专利名称：一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法
技术领域：
本发明属于农业生物技术和生物防治领域，具体涉及一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法。
背景技术：
土传病害是一种危害极其严重的植物病害。大量施用化肥，土壤连作，管理不当等都容易造成土传病害的爆发。病原菌通过侵入植物根部或茎部，引起植物死亡，造成重大的经济损失，据联合国粮农组织统计，每年因遭受植物病害引起的减产损失为总产量的109Γ15%。因而对土传病害防治的研究一直是一个热点和难点课题。传统的化学农药防治虽然能使农业生产的集约化种植中出现的大规模发病的问题在短时间内得到解决。但从长远来看，化学农药的长期使用会带来诸多负面的影响。如药剂残留造成水源土壤的污染，危害人畜健康，长期使用农药病原菌容易产生抗药性，导致防效下降甚至失败。大量研究结果表明生物防治具有对环境和人畜安全、不易产生抗药性等优点，是一种经济有效的防治植物病害的方法，具有广阔的前景。因而寻求新的、高效的可替代化学试剂的生物生防资源，对农业的可持续性发展具有重要的意义。堆肥(compost)是指在自然或人工强化接种微生物的情况下通过高温发酵使有机物矿质化、腐殖化和无害化变成腐熟肥料的过程。在堆肥过程中会产生各种营养类型的微生物群落，已有的研究表明这些丰富的微生物资源库，也是一个潜在的生防菌库。从堆肥中成功分离出诸如芽孢杆菌、多粘类芽孢杆菌、克雷伯菌、木霉菌等拮抗菌用于土传病害防治的报道屡见不鲜。但从堆肥中筛选拮抗细菌普遍采用的方法，与从土壤中筛选拮抗细菌普遍使用的方法类似。大体上都是先将堆肥制成堆肥悬浮液，而后将悬浮液等梯度稀释后，用涂布棒均匀涂布到适合细菌生长的酵母膏蛋白胨培养基(LB)或大豆酪蛋白琼脂培养基(TSA)上，待涂布后的培养基长出菌落后，将菌落划线纯化，挑选形态不一样的单菌落在适合真菌生长的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上采用对峙培养或点接法一一进行拮抗实验。由于堆肥或土壤中含有的细菌数量繁多，涂布纯化后长出的单菌落也成百上千，没有针对性的一一挑选进行拮抗实验，造成了很多繁琐和重复的工作，且需要消耗大量的培养基和培养皿。工作量大、效率低是上述方法的最大缺点。
发明内容
本发明的目的在于针对用传统的稀释平板涂布法从堆肥中筛选拮抗细菌工作量大、效率低这一问题，通过建立一种高效、快速的从堆肥中 筛选拮抗细菌的方法，以达到减少筛选工作量、缩短筛选时间，加快拮抗菌的开发和应用，促进我国生物防治和可持续农业的发展目的。本发明的技术方案如下
一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法，其特征在于按照以下几个步骤进行
(I)拮抗菌的初筛将堆肥悬浮液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上后再直接涂布致病菌孢子悬浮液，使细菌与致病菌直接对峙，优选制备重量百分比为10%堆肥原液后，依次制备稀释度为10—1，IO-2, IO-3, IO-4, IO-5, IO-6的堆肥悬浮液，堆肥悬浮液涂布的量为100μ I，致病菌孢子悬浮液涂布的量为200 μ 1，浓度为IXlO6CFU/ ml。(2)目标细菌的纯化待平板上形成抑菌圈后，从抑菌圈内将混合的目标细菌进行划线，纯化，优选纯化直至每个培养皿中细菌菌落的形状、大小和颜色相同。(3)拮抗细菌的复筛采用平板对峙法将纯化的目标细菌的菌液分别点接到含有病原菌的平板上，通过观察抑菌圈的有无，筛选出拮抗菌。本发明所述的筛选出拮抗细菌的方法，具体可按照下述步骤进行
一、拮抗细菌的初筛
(I)配制固体马铃薯葡萄糖培养基(马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L)。(2)称取10 g堆肥，加入含有90 ml无菌水的500 ml的三角瓶中，充分振荡后将三角瓶置于37°C的摇床中200 r/min，摇瓶30 min。(3)吸取5 ml上述步骤制备的堆肥悬浮液加到含有45ml无菌水的150ml的三角瓶中，制成1(Γ2的堆肥悬浮液，混合均匀。再如此依次配制10Λ 1(Γ4，1(Γ5，1(Γ6的系列堆肥稀释液。(4)用移液枪分别吸取上述系列堆肥稀释液100 μ I，滴在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，然后用涂布棒将其均匀涂布。(5)待涂布了堆肥悬浮液的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板在操净台内自然风干后，在平板上滴取200 μ I用灭菌的生理盐水重悬的，浓度为IX IO6CFU/ ml的病原菌孢子悬浮液，并用涂布棒均匀涂布。(6)将上述涂布好堆肥悬浮液和病原菌孢子悬浮液的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板用封口膜封好后，置于30 1的培养箱内培养7-10天。二、目标细菌的纯化
待上述马铃薯葡萄糖琼脂平板在培养箱内生长7-10天后，平板上会长满大量病原菌的菌丝，有目标细菌的平板，在真菌周围会出现抑菌带或抑菌圈，圈内不长真菌或菌丝长的较周围菌丝薄，且圈内能明显看到细菌。这些抑菌圈内的细菌即为目标细菌。但此时的目标细菌为混合细菌，用接种环挑取不同抑菌圈内的细菌在固体酵母膏蛋白胨培养基上划线。于30 °C的培养箱内培养一天，待酵母膏蛋白胨培养基上长出单菌落后，观察每个平板中菌落的形态，如果发现同一培养皿中出现形状、大小和颜色不同的细菌菌落，则用接种环挑取划线，进一步进行纯化。直至每个培养皿中细菌形状、大小和颜色均相同。三、拮抗细菌的复筛
用牙签挑取已经纯化好的在固体酵母膏蛋白胨培养的细菌单菌落，接种于含有50 ml酵母膏蛋白胨的液体培养基的150 ml三角瓶中，30 0C >200 r/min摇至对数期。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板的中央，转接用打孔器(直径5cm)在致病菌菌落边缘区域打孔制成的菌塞，在距中央致病菌约2. 5 cm处的四周(四点等距)，分别点接对数期菌液O. 5 μ I。接种好后，用封口膜封好，于30 V的培养箱内培养7天左右。通过观察抑菌圈的有无，进一步判断所筛选的细菌是否为拮抗菌。四、菌种的保存
将通过复筛确定的对植物病原菌具有拮抗作用的细菌，在液体酵母膏蛋白胨培养上30 °C >200 r/min摇至对数期后吸取800 μ I加入装有200 μ I灭过菌的甘油管中。封口膜封好后置于-70°C保存。本发明的优点
本发明在传统的海量式的用稀释平板涂布法即先涂布，然后挑取单菌落，对单菌落采用一一平板对峙筛选拮抗菌的基础中。对筛选方法进行了改进，采用先将细菌与致病菌直接对峙，即将堆肥悬浮液涂布后直接再涂布致病菌孢子悬浮液，待形成抑菌圈后，从抑菌圈内将混合的目标细菌进行划线，再挑取单个目标菌落进行平板对峙的方法，筛选拮抗细菌。本发明使用的材料与传统方法相似，具有成本低廉的特点。与传统的筛选方法相比，该发明缩小了筛选对象的范围，大大减少了工作量，缩短了拮抗菌的筛选时间，提高了筛选效率。本发明加快了生防菌的开发和利用，促进了我国生物防治和可持续农业的发展，具有重要的实际应用价值。
图1醋糟悬浮液和黄瓜尖孢镰刀菌病原菌共同涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养7天后，平板上抑菌圈的出现。图2目标细菌纯化后在酵母膏蛋白胨培养上形成的菌落。图3从醋糟堆肥中筛选到的拮抗菌对尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原菌的拮抗效果。
具体实施例方式以下以醋糟堆肥为例，说明快速、高效筛选植物病原菌尖孢镰刀菌黄瓜专化型拮抗菌的方法，但不受实施例限制。 在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1、醋糟堆肥中拮抗细菌的初筛
(I)配制固体马铃薯葡萄糖培养基(马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L)。(2)称取10 g醋糟堆肥，加入装有90 ml无菌水的500 ml的三角瓶中，充分振荡后将三角瓶置于37°C的摇床中200 r/min，摇瓶30 min。(3)用移液枪吸取5ml上述步骤制备的醋糟悬浮液加到含有45ml无菌水的150ml的三角瓶中，制成10_2的堆肥悬浮液，混合均匀。再如此依次配制10_3，10Λ 10_5，10_6的系列堆肥稀释液。(4)用移液枪分别吸取上述系列堆肥稀释液100 μ I，滴在马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，然后用涂布棒均匀将其涂布。(5)待涂布了堆肥悬浮液的马铃薯葡萄糖琼脂培养基的平板在操净台内自然风干后，在平板上滴取200 μ I用灭菌的生理盐水重悬的，浓度为IX IO6CFU/ ml的尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原菌的孢子悬浮液，并用涂布棒均匀涂布
(6)将上述涂布好了醋糟堆肥悬浮液和尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原菌孢子悬液的马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板用封口膜封好后，置于30 1的培养箱内培养7天。实施例2、目标细菌的纯化
将实施例1中所述马铃薯葡萄糖琼脂平板在培养箱内生长7天后，平板上长满了大量的尖孢镰刀菌黄瓜专化型病原菌的菌丝，且在10_5和10_6的平板上能看到明显的抑菌圈(见图1)。用接种环挑取不同抑菌圈内的细菌在固体酵母膏蛋白胨培养基(酵母提取物5 g/1、蛋白胨10 g/l、氯化钠10 g/l)上划线。于30 °C的培养箱内培养一天，待酵母膏蛋白胨培养基上长出单菌落后，观察每个平板中菌落的形态，并对不纯的菌种进行划线纯化。直至每个培养皿中细菌菌落形状、大小和颜色均相同(见图2)。最后一共挑取了 34株纯化好的细菌单菌落。实施例3、拮抗细菌的复筛
用牙签挑取实施例2所筛出的34株在固体酵母膏蛋白胨培养的目标细菌，接种于含有50 ml酵母膏蛋白胨的液体培养基(酵母提取物5 g/Ι、蛋白胨10 g/Ι、氯化钠10 g/Ι)的150 ml的三角瓶中，30 0C >200 r/min摇至对数期。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板的中央，转接用打孔器(直径5 cm)打好的尖孢镰刀菌黄瓜专化型菌种，在距中央致病菌约2. 5cm处的四周(四点等距)，分别点接上述对数期的菌液O. 5 μ 。于30 1的培养箱内培养7天左右。通过观察抑菌圈的有无，一共筛选到8株拮抗菌，部分拮抗细菌对黄瓜尖孢镰刀菌病原菌的拮抗效果图如图3所示。实施例4、菌种的保存和鉴定
将通过复筛确定的对植物病原菌具有拮抗作用的细菌，在液体酵母膏蛋白胨培养(酵母提取物5 g/l、蛋白胨10 g/l、氯化钠10 g/1) 30 °C>200 r/min摇至对数期后用移液器枪吸取800 μ l菌夜加入装有200 μ I灭过菌的甘油管中。封口膜封好后置于_70°C保存。通过16S rDNA分子鉴定分析发现，这8株拮抗菌分别从属于多粘类芽孢杆菌、芽孢杆囷、克雷伯囷。
权利要求
1.一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法，其特征在于按照以下几个步骤进行 (1)拮抗菌的初筛将堆肥悬浮液涂布于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上后再直接涂布致病菌孢子悬浮液，使细菌与致病菌直接对峙； (2)目标细菌的纯化待平板上形成抑菌圈后，从抑菌圈内将混合的目标细菌进行划线，纯化； (3)拮抗细菌的复筛采用平板对峙法将纯化的目标细菌的菌液分别点接到含有病原菌的平板上，通过观察抑菌圈的有无，筛选出拮抗菌。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于制备重量百分比为10%堆肥原液后，依次制备稀释度为ιοΛιοΛιοΛιοΛιοΛιο—6的堆肥悬浮液，堆肥悬浮液涂布的量为ΙΟΟμ 1，致病菌孢子悬浮液涂布的量为200 μ 1，浓度为IXlO6CFU/ ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)纯化直至每个培养皿中细菌菌落的形状、大小和颜色相同。
全文摘要
本发明公开了一种从堆肥中快速、高效筛选拮抗细菌的方法。先将堆肥悬浮液涂布于平板后，再直接在平板上涂布致病菌菌液，使目标细菌与致病菌直接对峙，待形成抑菌圈后，从抑菌圈内将混合的目标细菌进行划线纯化，纯化后再挑取单个目标细菌进行平板对峙，从而筛选出拮抗细菌的方法。本发明成本低廉，极大减少了工作量，缩短了筛选拮抗菌的时间，提高了筛选效率。本发明加快了生防菌的开发和利用，促进了我国生物防治和可持续农业的发展，具有重要的实际应用价值。
文档编号C12R1/22GK103013884SQ20121057133
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者李萍萍, 林英, 司春灿, 杜道林, 赵青松, 朱咏莉 申请人:江苏大学