专利名称：口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法
技术领域：
本发明涉及表面展示外源蛋白的重组芽孢的制备方法及产品，具体指的是在枯草芽孢杆菌芽孢表面展示带有肠激酶标签的人胰岛素原HPI重组芽孢，属于重组融合蛋白药物技术领域。
背景技术：
人胰岛素原(human proinsulin, HPI)是由109个氨基酸组成的单链无糖基化的蛋白质，分子量约为 12kD (Bell GI, et al. 1979. Kyriazis GA, et al. 2012)，等电点在
5.2左右。HPI是人体唯一降血糖激素胰岛素的前体蛋白，体内和体外的研究均发现其能够有效降低胰高血糖素 刺激的糖原分解，并结合胰岛素受体发挥生物效应。人体内胰岛素水平的长期失衡容易引起糖尿病，随着人类社会的不断发展和人民生活水平的不断提高，糖尿病的患者人数也在不断上升，其中中国已经成为世界上糖尿病患者最多的国家，2008年的流行病学分析显示全国的总患病人数约为9200万人，它被认为是二十一世纪威胁人类健康的沉默杀手。治疗糖尿病患者的方法主要是胰岛素的静脉注射(胰岛素注射液，商品名为诺和灵，诺和诺德生物制药公司生产http://www. novonordisk. com ;胰岛素的注射药来得时，赛诺菲集团生产http://www. sanof1. cn/l/cn/zh/index, jsp),其给患者带来了极大的精神痛苦，也容易引起高胰岛素血症、体重增加和低血糖等并发症，并且糖尿病患者的治疗费用昂贵(美国每名糖尿病患者的年治疗费用达11744美元)，因此越来越多的研究开始专注于口服降血糖药物的开发，目前中国的上市公司通化东宝正在进行口服胰岛素胶囊的二期临床开发(通化金马 http://125. 35. 24. 210/cpi/jsp/preview_l. jsp TID=20080505093125243274372)，其胰岛素的成分主要是发酵重组胰岛素获得。胰岛素的生产早期主要是从动物的胰腺中纯化结晶获得的，到了二十世纪九十年代才开始了世界范围内的重组胰岛素制剂的研制，但是其生产工艺复杂且产量较低，很难满足目前市场上对胰岛素制剂的需求(每年大约有几百亿美元的市场价值)，其中胰岛素原的生产就是严重制约胰岛素制剂规模化的瓶颈。胰岛素原对肝代谢有较强的选择性作用，能够有效抑制肝葡萄糖的输出作用。利用胰岛素原的灌注实验发现其灭活时间远长于胰岛素，许多研究者认为可将其作为活性胰岛素来治疗糖尿病，临床实验也发现给2型糖尿病人注射胰岛素原，可控制空腹血糖含量，且很少发生低血糖。目前已有通过基因工程的方法用酵母发酵生产重组人胰岛素原，2010年德国亥姆霍兹中心感染研究所公布其毕赤酵母分泌发酵方法http://www.helmholtz-hz1.de/en/news_events/news/view/article/complete/new_pathway_to_cheapjnsulin/，但要实现药物级重组人胰岛素原的大规模生产，发酵法仍然有许多的缺点和不足，因为重组人胰岛素原产品对纯度要求极高，纯度要求达到99. 999999%以上，任何微量的杂蛋白都可能造成严重的免疫反应。这使得发酵法生产重组人胰岛素原的分离纯化方法和步骤复杂,生产成本较高。枯草芽孢杆菌为环境友好型细菌，对弧菌、大肠杆菌和杆状病毒等有害细菌有很强的抑制作用，营养缺乏时能形成处于代谢休眠状态的芽孢，在适宜条件下芽孢又能萌发成具有繁殖能力的营养细胞，产生大量多种维生素、有机酸、氨基酸、蛋白酶、糖化酶等促进消化吸收的物质。芽孢容易培养，比重大易分离、不需要复杂的分离纯化操作。芽孢是生物界中抗逆性最强的生命体，其稳定性好，能耐氧化，耐高温，能长期耐60°C高温，在120°C 140°C还能生存几小时，并且在抗化学药物和抗辐射等方面也十分突出，可在恶劣环境中存活几年至几十年。芽孢在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，顺利通过动物消化道直达大小肠，可作为极端环境(如胃肠道)下异源蛋白或生物活性分子的载体(Oggioni MR, et al. 2003. Vaccine. 21:96-101)。枯草芽孢杆菌以孢子状态进入消化道后，迅速由休眠状态复活，在短期内繁殖成高含菌量的优势种群，消耗掉肠道内大量氧气，并能产生过氧化氢、细菌素，建立微生态平衡，促进有益厌氧微生物的繁殖，抑制有害细菌(大肠杆菌、沙门氏杆菌)的生长，因而能预防腹泻、下痢等肠胃道疾病，增强机体的免疫力和体质水平。目前市场上已经有口服枯草芽孢杆菌活菌胶囊产品，北京紫竹药业有限公司，国药准字 S20030018(http://www. 777aaa. com/html/yao/200791823402711963569029. htm)，表明枯草芽孢杆菌芽孢可以通过人口服使用而产生药效性。家蚕具有类似哺乳动物和人的脑、心脏、肝脏、肾脏、胃肠、神经、肌肉等类似器官和组织，对药剂的反应和对病原物的感受性与人相当一致。实践也证明用蚕作人类疾病研究和开发新医药的新的模式动物在第一阶段使用很好，试验快速、简便、成本低。同时家蚕作为药物初筛的模式动物还具有不逃逸，体外可以进行药物吸收性试验等优点，因此越来越多的研究开始用家蚕作为药物筛选的初级动物模型。家蚕和人同样具备调节血液中糖浓度即血糖值的功能，先前的实验显示过高的血糖浓度会使家蚕的生长发育受到抑制并且胰岛素可以降低家蚕血糖的含量，也就是说家蚕存在着与人体类似的血糖调节机制，本研究首次希望通过创建家蚕的糖尿病模型来筛选一些胰岛素类似物，同时为下面开发临床应用的膜岛素口服制剂提供实验基础。
本发明的目的在于根据人体胃肠道的消化特征，以益生菌枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白为载体，通过芽孢展示技术将带有肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的人胰岛素原展示在芽孢表面，使人胰岛素原获得快速大量表达具有良好抗逆性的同时能够在人体肠道进行增殖和自由消化吸收，适用于快速大量制备具有降血糖功效的重组人胰岛素原的口服药物。该产品结合了枯草芽孢杆菌的抗逆性特征和人体胃肠道的消化特点，增加了肠激酶位点，开发出能够在人体口服进行自由消化吸收的降血糖多肽药物，同时，能进行大规模的工业生产，迄今尚未见类似的报道和发明专利。本发明通过家蚕糖尿病模型进行降血糖药物的初级筛选。首次成功构建家蚕糖尿病模型的各项生理生化指标符合糖尿病模型的标准，通过人胰岛素原重组芽孢的糖尿病模型家蚕口添实验，证明了本产品的降血糖功效，这也是首例应用家蚕糖尿病模型成功进行降血糖药物筛选的产品。
发明内容
为了解决口服降血糖药物开发存在的问题，本发明提供了一种表面展示人胰岛素原HPI的重组芽孢的制备方法和产品。本发明以枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC为载体，通过芽孢表面展示技术将带有肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的人胰岛素原展示在枯草芽孢杆菌的芽孢表面，可用于动物直接口服，成为一种新型的人胰岛素原降血糖药物，其在安全性、耐受性、药效学以及药代动力学等方面与胰岛素具有类似的功效。相对于其它注射型胰岛素产品，本发明表面展示人胰岛素原的制备方法主要用于口服易于吸收，同时具有工业化生产特点，具有更广泛的应用价值。这种产品的发明克服了当前人胰岛素来源于胰腺组织提取的限制，同时也克服了重组酵母发酵生产的人胰岛素原分离纯化过程复杂的缺点，在药学领域具有良好的应用前景。本发明所采用的技术方案为一种口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，是利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因CotC为分子载体，与带有肠激酶标签的人胰岛素原重组，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌获得枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生芽孢，在芽孢表面展示有人胰岛素原蛋白。所述的融合表达的整合型重组质粒是将枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因与人胰岛素原基因重组构建的质粒。所述的枯草芽孢杆菌重组菌株是整合型重组质粒转化枯草芽孢杆菌所得到的菌株，该菌株染色体上含有适用于枯草芽孢杆菌的选择标记基因、以及芽孢衣壳蛋白基因与人胰岛素原基因的编码序列重组后的基因，这些基因插入淀粉酶基因中导致重组菌株的淀粉酶基因失活。本发明还公开了一种表面展示人胰岛素原的重组芽孢，该重组芽孢是枯草芽孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌的芽孢，芽孢表面展示有人胰岛素原HPI。由上述的方法获得。
本发明所述的表面展示人胰岛素原的重组芽孢重组芽孢应用于制备口服降血糖药物。本发明的一个具体操作是通过PCR的方法从购买的质粒pDNR-LIB (ProteinGroup, Inc.)中扩增获得人胰岛素原HPI的基因，将获得的基因插入到克隆载体pMD18_T中并转化大肠杆菌TGl保存。抽提质粒经过双酶切将人胰岛素原基因hpi插入到原核表达的质粒pET_30a的NcoI和SacI酶切位点之间，然后用KpnI和SacI对该质粒进行双酶切使其前端带有肠激酶标签基因Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,并插入到融合表达的质粒PJS700的KpnI和SacI酶切位点之间，构建好带有人体肠道能够自由消化吸收肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的整合型重组质粒pJS700_HPI,用该质粒转化枯草芽孢杆菌,采用耗竭法诱导宿主菌产生芽孢，在芽孢表面展示有带有肠激酶标签的融合蛋白CotC-HPI。本发明选择具有良好的转化能力并且可以产生芽孢的枯草芽孢杆菌菌株为重组质粒的转化菌株，例如Bacillus subtilis 168及其衍生的一系列菌株(Bacillus GeneticStock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University, West 12thAvenue, Columbus, Ohio, 43210, USA);选择芽抱衣壳蛋白基因 cotC(Gene Bank 序列号NP_389653)作为表面展示蛋白的分子载体，选择人胰岛素原基因hpi为重组基因。枯草芽孢杆菌为环境友好型细菌，其在营养缺乏时会分化形成休眠体芽孢，芽孢具有极强的抗逆性，可以耐酸和碱，存活能力较强，并且其比重大，容易进行分离纯化。枯草芽孢杆菌的培养方法简单方便，生长迅速，营养要求简单，容易进行工业放大培养。在枯草芽孢杆菌的芽孢表面展示带有肠激酶标签的人胰岛素原，使人胰岛素原蛋白获得快速大量表达的同时具有良好的抗逆性和人体肠道自由消化吸收的稳定性，并且分离纯化简便快捷。
本发明涉及发明所选择的芽孢衣壳蛋白基因cotC与hpi基因编码序列重组后构建的重组质粒，在此重组质粒中含有芽孢衣壳蛋白基因的启动子、不含终止密码子的编码序列与hpi基因的编码序列重组后的基因，可在枯草芽孢杆菌分化形成芽孢时融合表达CotC-HPI0通过构建带有人体肠道自由消化吸收肠激酶标签的整合型重组质粒，使得融合基因cotC-hpi整合于枯草芽孢杆菌染色体上的特定位点并稳定的进行遗传，避免了质粒在枯草芽孢杆菌细胞中容易丢失的缺点。带有融合表达CotC-HPI的表达载体可以通过热击法或电穿孔法转化宿主细胞。成功转化的细胞，通过进一步筛选带有本发明构建的融合基因的细胞，可以通过本领域熟知的方法加以鉴定，如收集细胞，裂解后提取DNA，然后进行PCR鉴定等，也可以在诱导表达后用HPI抗体进行western blot检测。本发明还涉及本发明构建的融合表达CotC-HPI的重组整合型质粒转化枯草芽孢杆菌筛选所得到的重组菌株，这些重组菌株诱导形成的芽孢表面展示有重组人胰岛素原，并可以通过Western blot检测其芽孢表面展示的重组蛋白HPI。本发明涉及基因hpi编码序列片段克隆的引物序列hp1-F CATGCCATGGCTATGGCCCTGTGGATGCG (SEQ ID NO.1)hp1-R CGAGCTCCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG (SEQ ID NO. 2)本发明涉及枯草芽孢杆菌淀粉酶基因amyE(Gene Bank序列号NP_388186)片段扩增的引物序列amyE-F ATTGCTCGGGCTGTATGACTGG (SEQ ID NO. 3)amyE-R GTTACACCATCACTGTTCGTTCCTT (SEQ ID NO. 4)本发明的突出优点表现为将人胰岛素原HPI展示在枯草芽孢杆菌表面，利用芽孢所具有的独特抗逆性，使得人胰岛素原蛋白顺利通过动物体消化屏障。本发明构建的表面展示带有肠激酶标签Asp-Asp-Asp-Asp-Lys人胰岛素原HPI的枯草芽孢杆菌重组芽孢，可用于动物、人直接口服在肠道进行自由的消化吸收，成为一种新型的口服人体降血糖药物产品，相对于其它注射型人体降血糖制剂，制备方法和分离过程简单快速，并且这种方法获得的胰岛素原可以也可在体外大量的进行酶切纯化，大大降低胰岛素生产的原料价格，具有广泛的应用价值和广阔的市场价值。这种产品的发明克服了当前人胰岛素原来源于组织提取的限制，降低了人体降血糖注射制剂带来的负面效应和精神痛苦，并且可以在生产上大大降低胰岛素原的生产价格，同时也克服了重组酵母发酵生产的人胰岛素原分离纯化过程复杂的缺点。
图1发明人克隆的人胰岛素原hpi基因编码序列在Gene Bank中搜索比对结果。
图2融合表达CotC-HPI整合型重组质粒pJS700_HPI的构建方法及其结构图谱。amyE5’ -end和amyE3’ -end分别表示淀粉酶基因编码序列的5’端和3’端，通过同源重组整合在Bacillus subtilis 168 (trpO染色体的淀粉酶基因中。Amplr, Enf分别表示氨节青霉素抗性基因和红霉素抗性基因，在大肠杆菌和Bacillus subtilisl68 (trpO中作为筛选标记。Enterokinase表示肠激酶消化的标签位点Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,从原核表达载体pET_30a载体上获得。cotC-hpi为在Bacillus subtilisl68 (trpl的芽孢中融合表达CotC-HPI重组蛋白的基因片段，该片段含有cotC基因的启动子序列、不含有cotC终止密码子的CotC编码序列，以及HPI的全部编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段。图3 重组菌株 Bacillus subtilis 168 (trp_)/pJS700_HPI 的淀粉酶活性分析。A :野生型菌株 Bacillus subtilis 168 (trp_)和重组菌株 Bacillus subtilis 168(trp_)/PJS700-HPI于淀粉平板上培养；B :在淀粉平板上野生型菌株和重组菌株的碘液染色。图4Enf-cotC_hpi基因片段在Bacillus subtilisl68 (trpO染色体中的整合不意图。图5PCR 检测重组菌株中的 Enf-cotC-hpi 片段。M 250bp DNA Ladder Marker ；分别以 Bacillus subtilis 168(trp0 (Wild-type, WT) ^PBacillus subtilis 168(trp_)/pJS700-HPI (Transgenic, TG)的染色体为模板，以 amyE-F/amyE-R、hp1-F/hp1-R、hp1-F/amyE-R和amyE_F/hp1-R为四组引物对(引物对的在染色体中的位置见附图4)进行PCR鉴
定重组基因。图6转基因重组菌株表面展示HPI重组芽孢的western blot鉴定。M为prestained proteinMW marker, 1为野生型菌株 Bacillus subtilis 168(trp_)培养 48h后的提取物作为对照，2和3分别为重组菌株Bacillus subtilis 168 (trp_)/pJS700_HPI培养8h和48h后的提取物。图7家蚕糖尿病模型的构建和验证。图7-1和图7-2为家蚕第一次显微注射浓度为10%的葡萄糖溶液25ul后不同时间点家蚕血液葡萄糖和总糖量的浓度变化；图7-3为家蚕糖尿病模型构建的实例图片；图7-4，图7-5和图7-6分别为成功构建好的糖尿病家蚕不同处理组家蚕的体重、体长和血糖浓度的变化。
图8 口服重组芽孢对糖尿病模型家蚕体重、体长和血糖含量的影响。图8-1为口服重组芽孢对糖尿病模型家蚕发育影响的实例图片；图8-2，图8-3和图8-4分别为口服重组芽孢对糖尿病模型家蚕体重、体长和血糖含量的变化。
具体实施例方式实验材料各种限制性内切酶、T4DNAligase、LA Taq、Taq酶，pMD18_T载体均购至宝生物工程(大连)有限公司，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，测序由百奥迈科(Biomics)生物技术有限公司完成，用于本发明的所有DNA片段的回收均采用Omega Bio-Tek GelExtractionKit分离纯化,大肠杆菌菌株DH5 α购于中科院微生物研究所，为本实验室保存，其它试剂均为国产分析纯。在本发明中所使用的术语，非特别说明的情况下，一般为本领域普通技术人员所理解的含义。以下实施例中未作具体说明的实验操作方法均参照《分子克隆实验指南》(Sambrook等编著，科学出版社，1992年版)、试剂盒说明书、及产品说明书进行。以下的实施例只是为了举例说明本发明，并非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的一些过程和方法都为本领域技术人员熟悉和了解的常规方法。所用试剂的来源、商品名，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的相同。本发明实施例中涉及的由发明人保存的生物材料，均可向公众提供20年。实施例1 :人胰岛素原hpi基因的克隆、测序及鉴定
通过PCR的方法从公司购买的质粒pDNR-LIB (Protein Group, Inc.)中扩增获得人胰岛素原HPI的基因。人胰岛素原hpi基因片段的PCR扩增引物为hp1-F :CATGCCATGGCTATGGCCCTGTGGATGCG (SEQ ID NO.1)hp1-R CGAGCTCCTAGTTGCAGTAGTTCTCCAGCTG (SEQ ID NO. 2)PCR反应体系按TaKaRa LA Taq使用说明书严格进行，20 μ L反应体系中含TaKaRaLA TaqO. 2 μ L，10XLA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 2 μ L, dNTP Mixture (各 2. 5mM) 3. 2 μ L,模板DNAlOOng，上下游引物(20 μ Μ)各O. 4 μ L，最后加灭菌超纯水补齐到20 μ L。PCR条件为:94°C变性 5min，94°C lmin,56°C 40s, 72°C 40s，30 个循环。PCR 产物大小为 352bp，包括人胰岛素原hpi基因的编码序列。为了便于克隆，上游引物hp1-F中添加了 NcoI限制性酶切位点，下游引物hp1-R中添加了 SacI位点。扩增片段按TaKaRapMD18_T SimpleVector(TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司)说明书的方法，克隆于pMD18_T载体中，转化大肠杆菌DH5 α，筛选克隆菌株，提取质粒，通过PCR及NcoI和SacI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，并对重组质粒进行测序，克隆片段的测序由百奥迈科(Biomics)生物技术有限公司完成。克隆的重组质粒命名为PMD18-T-HPI，重组子菌株命名为DH5 a /pMD18-T_HPI。阳性重组菌株保存在含有15%甘油的LB培养基中，冻存于_80°C。测序结果在GenBank 中(http: //blast, ncb1. nlm. nih. gov/Blast. cgi)进行搜索比对，结果见图1。实施例2 以CotC为载体表面展示HPI的枯草芽孢杆菌重组芽孢的制备与应用1.重组整合型质粒PJS700-HPI的构建质粒pJS700(李倩.以CotX为分子载体表面展示WSSV囊膜蛋白Vpl9和Vp28的枯草芽孢杆菌重组芽孢的研究[D].江苏镇江江苏大学，2010:36-38)由江苏大学环境学院宁德刚副教授惠赠，该质粒大小约为5. 5kb。在pJS700质粒中,amyE5’_end和amyE3’_end分别表示淀粉酶基因amyE(Gene Bank序列号NP_388186)编码序列的5’端和3’端，通过同源重组整合在Bacillus subtilis 168(trp_)染色体的淀粉酶基因中。Amp Enf分别表示氨节青霉素抗性基因和红霉素抗性基因，在大肠杆菌和Bacillus subtilis 168(trp0中作为筛选标记。Enterokinase表示肠激酶消化的标签位点Asp-Asp-Asp-Asp-Lys,从原核表达载体pET-30a载体上获得。cotC为枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白CotC基因，该基因片段含有cotC基因(GeneBank序列号NP_389653)的启动子序列、不含有cotC终止密码子的CotC编码序列。oriC为大肠杆菌复制子片段。分别用NcoI和SacI酶切质粒pMD18-T-HPI和pET-30a，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收hpi片段和pET-30a，用T4DNA Iigase连接两双酶切后纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，转化物涂布于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板中37°C培养过夜，次日挑选阳性单克隆菌株于含有50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 °C培养12至16h，提取质粒，通过PCR及NcoI和SacI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性 克隆，鉴定正确后将重组整合型质粒命名为pET-30a-HPI，然后用KpnI和SacI分别酶切质粒pET-30a_HPI和pJS_700，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收hpi片段和？几700，用T4DNA Iigase连接两双酶切后纯化好的片段，连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞，转化物涂布于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板中37°C培养过夜，次日挑选阳性单克隆菌株于含有50 μ g/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C培养12至16h，提取质粒，通过PCR及KpnI和SacI双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆，鉴定正确后将重组整合型质粒命名为PJS700-HPI，阳性重组菌株命名为DH5 a /PJS700_HPI。该重组整合型质粒PJS700-HPI中含有肠激酶标签的重组基因cotC-hpi，该质粒的构建过程及其图谱见图2。2.融合表达重组芽孢的枯草芽孢杆菌菌株的筛选与鉴定将整合型重组质粒pJS700_HPI 转化 Bacillus subtilis 168(trp_) (BacillusGenetic Stock Center, Department of Biochemistry, The Ohio State University,West12th Avenue, Columbus, Ohio, 43210，USA)，用含有 0.4 μ g/mL 红霉素(购自 SIGMA 公司)的LB平板筛选重组子，从平板上挑选单菌落接种于含1%淀粉的LB平板中，37°C过夜培养，次日用碘-碘化钾溶液对淀粉平板染色来鉴定重组菌株。1%淀粉平板的制备方法100mL LB固体培养基中加可溶性淀粉0.1g,高压蒸汽灭菌后倒制平板。碘-碘化钾溶液的配制碘化钾2g，碘lg，蒸馏水300mL，先将碘化钾溶于少量去离子水中，待全部溶解后再加入碘，振荡溶解后稀释至300mL，避光保存在棕色玻璃瓶中，用时可稀释2 10倍。取适量碘-碘化钾溶液滴于淀粉平板上，菌落周围产生透明圈表明重组基因没有插入淀粉酶基因amyE中，菌落及其周围颜色变蓝表明重 组基因成功的插入到了 Bacillus subtilis 168(trp_)染色体上的淀粉酶基因amyE中，因而导致淀粉酶基因amyE没有活性，见图3。为了进一步 证明重组菌株中淀粉酶基因的失活是由于Enf-cotC-hpi的插入所致，分别以 amyE-F/amyE-R、hpi_F/hpi_R、amyE_F/hp1-R、hp1-F/amyE-R 为引物对，以枯草芽孢杆菌的染色体为模板，PCR扩增鉴定重组菌株中是否含有Enf-cotC-hpi基因片段。Enf-cotC-hpi片段在Bacillus subtilis 168 (trp)染色体中的整合不意图见图4。PCR反应体系按TaKaRa LA Taq使用说明书严格进行，20 μ L反应体系中含TaKaRa LA TaqO. 2 μ L,10 X LA PCR Buffer II (Mg2+Plus) 2 μ L, dNTP Mixture (各 2. 5mM) 3. 2 μ L,模板 DNAlOOng,上下游引物(20 μ Μ)各0.4 μ L，最后加灭菌超纯水补齐到20 μ L。PCR反应条件根据各个引物对的特征分别设置。在重组菌株中分别检测到约3. 3kb、0. 3kb、2. 8kb和0. 8kb的扩增片段，而野生型菌株中只检测到约1.1kp的淀粉酶基因，鉴定结果见图5。这表明重组菌株染色体上含有Enf-cotC-hpi重组基因，并且Enf-cotC-hpi重组片段成功的插入到了淀粉酶基因中。将鉴定后的重组菌株命名为Bacillussubtilis 168 (trpl/pJS700_HPI。枯草芽孢杆菌染色体的提取方法为挑单菌落接于LB加相应抗生素的培养基中，在37 °C摇床中培养至OD6tltl为1. O 2. O。取1. 5mL菌液于Eppendorf管中，8000rpm离心lOmin，弃上清，加100 μ L ρΗ8· O的TE缓冲液(IOmM Tris-HCl，ImM EDTA)洗沉淀，离心去上清，再加IOOyL TE悬浮沉淀；向悬浮液中加SOyLlOOmg/ml溶菌酶溶液，不要摇晃，在37 °C培养箱中放lh，加50μ L10%SDS和20 μ L20mg/mL蛋白酶K，37 °C继续培养Ih ;补TE至300 μ L，分别加150 μ L苯酚和氯仿抽提，12000rpm离心IOmin,取上清；再加300 μ I氯仿，12000rpm离心5min,取上清,加1/4体积5M的NaCl, 2倍体积的无水乙醇,室温下沉淀DNA2h，12000rpm离心lOmin，收集沉淀，用500 μ L70%的乙醇洗沉淀，待挥发干后，加10 μ LTE缓冲液溶解沉淀，取I μ L用琼脂糖凝胶电泳检测DNA浓度，剩余的可放于_20°C中保存备用。3.表面展示人胰岛素原重组芽孢的诱导及鉴定用DSM 培养基诱导重组菌株 Bacillus subtilis 168 (trp-) /pJS700-HPI形成芽孢。DSM培养基的配方为0. 8%nutrientbroth (营养肉汤Difo)，0. 1%KC1，O. 025%MgS04 · 7H20,1. OmMCa (NO3) 2 · 4H20,10 μ M MnCl2,1. 0 μ M FeSO4。将野生型菌株Bacillus subtilis 168 (trp_)和重组菌株分别接种于DSM培养基中，重组菌株分别取Sh和48h培养物进行处理，野生型菌株取48h的培养物进行处理。芽孢蛋白的处理方法12000rpmX IOmin离心收集菌体，重悬于相同体积的GTE Buffer (50mM葡萄糖,20mMpH7. 5Tris-HCl，IOmM EDTA, 2mg/mL溶菌酶)中，37 °C处理30分钟用以破坏营养细胞，12000rpmX IOmin沉淀芽孢，用pH7. 4的PBS洗3次后重悬于相同体积的SDS-DTT缓冲液(O.1mM pH7. 4PBS,50mM DTT,1. 5%SDS)中，65°C水浴处理 lOmin，进行 SDS-PAGE 电泳，转移到PVDF膜上，以兔抗HPI血清为一抗，Western blot检测重组菌株和野生型菌株的芽孢蛋白。结果显示野生型菌株48h和重组菌株8h的培养物中都没有检测到HPI，而重组菌株培养48h后，由于营养耗尽，细胞分化形成芽孢，在芽孢形成的过程中，HPI随着芽孢衣壳蛋白CotC —同得到表达，因而能检测到HPI，见图6。这表明重组芽孢中人胰岛素原HPI通过衣壳蛋白载体CotC将其展示在了重组芽孢的表面。4.家蚕糖尿病模型的构建和验证及其口服重组芽孢的功能分析本实验首次使用多化性家蚕品种海南棉白作为实验动物构建家蚕糖尿病模型，该实验模型已经被日本学者论证(Matsumoto, Sumiya et al.),据此本实验的研究方法,研究过程严格按照其进行。首先是家蚕糖尿病模型的构建，5龄眠起家蚕在实验前进行称重约为O. 45g，整个实验过程的家蚕培养条件为保持室温27±2°C，饮食按常规饲养方法进行。选取90条家蚕，将它们随即分为6组(每15条一小筐)一饥饿组(无任何处理，不喂养食物)，一正常组(按常规方法饲养)，一生理 盐水组(每隔12h注射25ul生理盐水,常规饲养)，一 5%葡萄糖组(每隔12h注射浓度为5%的葡糖糖溶液25ul，常规饲养)，10%葡萄糖组(每隔12h注射浓度为10%的葡糖糖溶液25ul，常规饲养)，15%葡萄糖组(每隔12h注射浓度为15%的葡糖糖溶液25ul，常规饲养)，整个实验的显微注射实验统一时间进行，并分别取10%葡萄糖组第一次显微注射后每组家蚕不同时间点(lh, 3h，5h，7h)的血液进行糖类物质和葡萄糖的测定(图7-1和图7-2)，糖类物质的测定方法为家蚕的血液20ul加入180ul0.6N的高氯酸溶液进行蛋白沉淀，3000rpm离心IOmin后取上清加入等体积的蒸懼水,再从中吸取IOOul溶液加入100ul5%的苯酚溶液，加入500ul的浓硫酸溶液剧烈反应20min后进行490nm光吸收的浓度测定，标准的系列稀释的葡萄糖溶液作为标准曲线；葡萄糖的测定方法按照葡萄糖测定试剂盒-氧化酶法(Glucose Oxidase Method, GOD E101)进行。3天后对每组5条家蚕进行体重和体长的测量，并分离血清进行糖度测定。成功构建的家蚕糖尿病模型实例图片见图7-3。家蚕各组体重、体长和血糖含量变化的实验数据表示为平均值土标准差。统计学分析用独立样本的t检验。P〈0. 05表明实验结果具有统计学意义。实验结果表明，高剂量的葡萄糖溶液能够明显抑制家蚕的生长发育，削弱家蚕的体重，提高家蚕血液的含糖量，见图7(4-6)，这些理化参数的特征符合家蚕糖尿病模型的构建标准，为后续降血糖药物的筛选提供了初级的筛选模型。糖尿病模型家蚕口服重组芽孢生理功能分析如下取60条体重相同的家蚕将其随机分为6组，每组10条家蚕一正常组(常规饲养)，一生理盐水组(每隔12h注射25ul生理盐水，常规饲养)，一对照组(每隔12h注射15%葡萄糖溶液25ul后，常规饲养)，一野生型组(每隔12h注射15%葡萄糖溶液25ul并口添3ul40mg/ml野生型芽孢)，两个重组芽孢处理组(每隔12h注射15%葡萄糖溶液25ul，一低剂量组为每隔12h 口添3ul40mg/ml重组芽抱，一闻剂量组为每隔12h 口添7ul40mg/ml重组牙抱)。3天后，对每组5条豕香进彳了体重和体长的测量，并分离血清进行糖度测定，测定方法如上。糖尿病家蚕口服重组芽孢后的实例图片见8-1。实验数据表示为平均值土标准差。统计学分析用独立样本的t检验。P〈0.05表明实验结果具有统计学意义。实验结果表明口服高剂量的重组芽孢能够降低糖尿病模型家蚕的血糖含量，P〈0. 05，显著恢复糖尿病模型家蚕的正常发育(体重和体长)，P〈0. 001，见图8 (2-4)，这表明本发明所构建的胰岛素`原重组芽孢具有一定的降血糖功能。
权利要求
1.一种口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，其特征在于利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与人胰岛素原基因重组，带有肠激酶标签，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示人胰岛素原的重组芽孢。
2.按照权利要求1所述的口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因是CotC。
3.按照权利要求2所述的口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，其特征在于所述的融合表达的整合型重组质粒是将枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因与人胰岛素原基因重组构建的质粒。
4.按照权利要求3所述的口服降血糖重组人胰岛素原的制备方法，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌重组菌株是整合型重组质粒转化枯草芽孢杆菌所得到的菌株，该菌株染色体上含有适用于枯草芽孢杆菌的选择标记基因、以及芽孢衣壳蛋白基因与人胰岛素原基因的编码序列重组后的基因，这些基因插入淀粉酶基因中导致重组菌株的淀粉酶基因失活。
5.一种表面展示人胰岛素原的重组芽孢，其特征在于，该重组芽孢是枯草芽孢杆菌重组菌株诱导形成的枯草芽孢杆菌的芽孢，芽孢表面展示有人胰岛素原HPI。
6.权利要求5所述重组芽孢在制备口服降血糖药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及口服降血糖重组人胰岛素原的产品及制备方法和应用，是利用枯草芽孢杆菌芽孢衣壳蛋白基因为分子载体，与人胰岛素原基因重组，带有肠激酶标签，构建融合表达的整合型重组质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示人胰岛素原的重组芽孢。本发明成功的筛选出重组枯草芽孢杆菌菌株，诱导重组菌株产生的芽孢表面展示有人胰岛素原。本发明的重组芽孢可直接用于动物口服进行肠道消化吸收，在保持了芽孢生理特性的基础上同时具有人胰岛素原的部分药效性和营养功能。同时，适合工业化生产。
文档编号C12N15/62GK103045631SQ201210571799
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者陈克平, 冯凡, 胡平, 连超群, 吕鹏, 唐琪, 姚勤, 袁弋, 张春霞, 陈亮 申请人:江苏大学