专利名称：一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法
一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法技术领域
本发明属于大豆多肽提取技术，尤其涉及一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法。
背景技术：
固定化酶是20世纪60年代发展起来的新技术，一般是将酶与不溶性载体结合起来，使酶在一定的空间内呈封闭状态，能连续的进行反应，反应后的酶通过过滤或离心等方法回收重复使用。固定化酶作为酶应用领域中的一个主要研究方向，目前大都通过将酶固定在不溶性聚合物或无机载体上，形成的固定化酶在大分子底物转化中由于聚合物载体的存在而大大降低了酶的结合容量和反应能力。此外，固定化使用的试剂和载体成本高昂、固定效率偏低，真正投入工业化应用的固定化酶不多，因而进一步开发更简便、更适用的固定化方法仍是该领域追求的目标。
交联酶聚集体技术是一种无载体固定化酶技术，酶的固定化是通过对基本纯化的、高浓度的蛋白质样品的共价交联来实现的。与传统固定化酶相比，该固定化方法获得的固定化酶有较高的催化剂比表面，单位体积活性大、空间效率高，有较高的酶催化活性，受底物扩散限制的影响较小，在极端条件下及有机溶剂中和蛋白酶中的操作稳定性，成本低廉、设备简单，无需载体，应用范围广。然而将交联酶聚集体技术——无载体固定化酶技术应用于酶解大豆分离蛋白提取大豆多肽的研究未见报道，现有的提取大豆多肽的方法存在酶不能回收重复使用，成本高等问题。发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法，达到简化工艺、提高酶的重复利用率及降低成本的目的。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法，该方法包括以下步骤(I)将protex-6L 碱性蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中，加入乙醇沉淀聚集，所述的乙醇浓度50-90%，聚集时间10-50min，聚集后再加入戊二醛进行交联得交联酶聚集体即固定化碱性蛋白酶，所述的戊二醛浓度10-50%，交联时间l_3h ; (2)将大豆分离蛋白加水混合配制成大豆分离蛋白溶液，调节PH和温度，再加入步骤(I)中得到的固定化酶进行酶解，酶解时间2-4h，加酶量 3000-7000U/g，酶解pH 8_10，酶解温度40_80°C，酶解后回收固定化酶，酶解液经离心分离得上清液，上清液经冷冻干燥即得大豆多肽。
所述的固定化protex_6L碱性蛋白酶制备的优选参数为乙醇浓度80%，聚集时间 30min,戊二醛浓度40%，交联时间2. 5h。
所述的酶解优选参数为酶解时间2. 84h，加酶量5450U/g，酶解pH 9. 5，酶解温度 50。。。
本发明方法采用无载体固定化碱性蛋白酶，首先用沉淀剂聚集酶，再加入交联剂使酶聚集体交联，即得交联酶聚集体一固定化碱性蛋白酶，该固定化酶由于无需成本高昂的载体，因此大大降低了成本，应用此固定化酶酶解大豆分离蛋白提取大豆多肽，提取工艺简单，并且酶可回收重复使用，减少了资源的浪费。
图I是本发明方法的工艺路线 图2乙醇浓度对酶活力回收率的影响；
图3聚集时间对酶活力回收率的影响；
图4戊二醛浓度对酶活力回收率的影响；
图5交联时间对酶活力回收率的影响；
图6酶解时间与加酶量交互对多肽提取率的响应面；
图7酶解时间与酶解pH交互对多肽提取率的响应面；
图8加酶量与酶解温度交互对多肽提取率的响应面；
图9酶解pH与酶解温度交互对多肽提取率的响应面。
具体实施方案下面结合附图对本发明具体实施例进行详细描述，
一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法，该方法包括以下步骤(I)将proteX-6L碱性蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中，加入乙醇沉淀聚集，所述的乙醇浓度50-90%，聚集时间10-50min，聚集后再加入戊二醛进行交联得交联酶聚集体即固定化碱性蛋白酶，所述的戊二醛浓度10-50%，交联时间l_3h ; (2)将大豆分离蛋白加水混合配制成大豆分离蛋白溶液，调节PH和温度，再加入步骤(I)中得到的固定化酶进行酶解，酶解时间2-4h，加酶量3000-7000U/g，酶解pH 8_10，酶解温度40_80°C，酶解后回收固定化酶，酶解液经离心分离得上清液，上清液经冷冻干燥即得大豆多肽。所述的固定化protex-6L碱性蛋白酶制备的优选参数为乙醇浓度80%，聚集时间30min,戊二醛浓度40%，交联时间2. 5h。所述的酶解优选参数为酶解时间2. 84h，加酶量5450U/g，酶解pH 9. 5，酶解温度50。。。实施例I :制备无载体固定化碱性蛋白酶最佳参数的筛选试验 I材料与方法
I. I材料、试剂 __
权利要求
1.一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1) 将protex-6L碱性蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中，加入乙醇沉淀聚集，所述的乙醇浓度 50-90%，聚集时间10-50min，聚集后再加入戊二醛进行交联得交联酶聚集体即固定化碱性蛋白酶，所述的戊二醛浓度10-50%，交联时间l-3h ;(2)将大豆分离蛋白加水混合配制成大豆分离蛋白溶液，调节PH和温度，再加入步骤(I)中得到的固定化酶进行酶解，酶解时间 2_4h，加酶量3000-7000U/g，酶解pH 8-10,酶解温度40_80°C，酶解后回收固定化酶，酶解液经离心分离得上清液，上清液经冷冻干燥即得大豆多肽。
2.根据权利要求I所述的一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法，其特征在于所述的固定化protex-6L碱性蛋白酶制备的优选参数为乙醇浓度80%,聚集时间30min,戍二醒浓度40%，交联时间2. 5h。
3.根据权利要求I所述的一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法，其特征在于所述的酶解优选参数为酶解时间2. 84h，加酶量5450U/g，酶解pH 9. 5，酶解温度50°C。
全文摘要
一种无载体固定化酶制备大豆多肽的方法属于大豆多肽提取技术，该方法包括以下步骤(1)将碱性蛋白酶溶解于磷酸盐缓冲液中，加入乙醇沉淀聚集后再加入戊二醛进行交联得交联酶聚集体即固定化碱性蛋白酶；(2)将大豆分离蛋白溶液加水混合配制成大豆分离蛋白溶液，调节pH和温度，再加入步骤(1)中得到的固定化酶进行酶解，酶解后回收固定化酶，酶解液经离心分离得上清液，上清液经冷冻干燥即得大豆多肽；本方法制备的无载体固定化碱性蛋白酶活性高，无需成本高昂的载体，同时将该固定化酶酶解大豆分离蛋白制备大豆多肽，所需的工艺设备简单，能耗低，且固定化酶可回收重复使用，减少资源浪费，节省成本。
文档编号C12P21/06GK102978269SQ201210571820
公开日2013年3月20日 申请日期2012年12月26日 优先权日2012年12月26日
发明者江连洲, 李杨, 齐宝坤, 冯红霞, 王欢, 隋晓楠, 王中江, 王胜男 申请人:东北农业大学