专利名称：利什曼原虫液体培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及黑热病疫情监测和黑热病诊断的液体培养基技术领域，是一种利什曼原虫液体培养基及其制备方法。
背景技术：
黑热病是我国《传染病法》规定的乙类传染病之一，是由利什曼原虫引起的一种自然疫源性寄生虫病，白蛉是传播媒介，患病的人和动物是主要传染源；有些地方的传染源和传播媒介还没有查明。2012年WHO报告，利什曼病包括黑热病，广泛分布于88个国家和地区，每年新增病例2百万，总病例已达到I. 2亿，有3. 5亿人处在该病的威胁中。近些年全世界的黑热病患者人数呈上升趋势，我国和印度的黑热病病人约占世界利什曼病的30%。随着石油、农业和旅游开发，进出疫区的人员日趋增加，增加了黑热病向外扩散传播的机会。由 于治疗不彻底或治疗方案不合理，抗药性利什曼原虫的分布范围有扩大趋势。培养分离利什曼原虫不仅是判断黑热病的重要标准之一，而且是深入开展防治研究工作的基础。3N培养基培养分离利什曼原虫是世界卫生组织(WHO)和我国卫生部黑热病诊断标准推荐的培养基和培养分离技术。3N培养基为双相培养基，下层为固体琼脂凝胶，结冰融化后就不能使用，只能在0°C以上保存，有效期为30天。使用3N培养基培养分离利什曼原虫，在亚洲黑热病疫区，黑热病患者的利什曼原虫的检出率不到20% ;在荒漠型黑热病疫区，黑热病患者的利什曼原虫检出率不到1%，出结果时间长达15天。
发明内容
本发明提供了一种利什曼原虫液体培养基及其制备方法，克服了上述现有技术之不足，其能有效解决使用3N培养基培养分离利什曼原虫的检出率低、检测出结果时间长和有效期短的问题。本发明的技术方案之一是通过以下措施来实现的一种利什曼原虫液体培养基，该利什曼原虫液体培养基含有 NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2
0.2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清 200 ml、去离子水1700ml、青霉素100万单位、链霉素100万单位、兔溶血液100 ml ;该利什曼原虫液体培养基按下述步骤得到第一步，依次将上述所需要量的NaCl、KCl,NaHC03> KH2PO3^CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混匀于上述所需要量的去离子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液调节pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混匀；第二步，将充气管插入到液体下部，用充气管充注CO2气体到液体中，直至液体颜色由淡红色变为亮黄色,此时CO2气体在液体中达到饱和；第三步,加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和链霉素充分混匀；第四步，将充分混匀后的液体放在除菌过滤器中用压力为0. 4公斤/cm2的CO2气体压滤除菌后得到利什曼原虫液体培养基，然后将利什曼原虫液体培养基分装到灭菌塑料瓶或玻璃瓶中，密闭，_20°C保存。下面是对上述发明技术方案之一的进一步优化或/和改进上述兔溶血液按下述步骤得到第一步，选I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，无菌采血，玻珠法脱纤维，按脱纤维之后血量体积的2倍加去离子水，在温度为_5°C至5°C之间反复冻溶至血红细胞破裂，然后在离心机中4000g离心20分钟，弃沉淀，上清液即为兔溶血液。本发明的技术方案之二是通过以下措施来实现的一种利什曼原虫液体培养基的制备方法按下述步骤进行该利什曼原虫液体培养基含有NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640
10.4g、小牛血清200 ml、去离子水1700ml、青霉素100万单位、链霉素100万单位、兔溶血液100 ml ;该利什曼原虫液体培养基按下述步骤进行第一步，依次将上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混匀于上述所需要量的去离子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液调节pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI_1640和小牛血清混匀；第二步，将充气管插入到液体下部，用充气管充注CO2气体到液体中，直至液体颜色由淡红色变为亮黄色，此时CO2气体在液体中达到饱和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和链霉素充分混匀；第四步，将充分混匀后的液体放在除菌过滤器中用压力为
0.4公斤/cm2的CO2气体压滤除菌后得到利什曼原虫液体培养基，然后将利什曼原虫液体培养基分装到灭菌塑料瓶或玻璃瓶中密闭保存。下面是对上述发明技术方案之二的进一步优化或/和改进
上述兔溶血液按下述步骤得到第一步，选I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，无菌采血，玻珠法脱纤维，按脱纤维之后血量体积的2倍加去离子水，在温度为_5°C至5°C之间反复冻溶至血红细胞破裂，然后在离心机中4000g离心20分钟，弃沉淀，上清液即为兔溶血液。本发明通过利什曼原虫液体培养基培养疑似黑热病病人的骨髓和肿大的动物脾脏，培养并分离利什曼原虫，培养出利什曼原虫的确定为黑热病，具有出结果快、保存方便和有效期长的特点，提高了利什曼原虫的分离率，为黑热病临床诊断、流行病调查和利什曼原虫抗药性研究提供依据。
具体实施例方式本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体的实施方式。实施例I :该利什曼原虫液体培养基含有NaCl 8.5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0.2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg, Hepes 4. 5g, RPMI-1640 10. 4g、小牛血清200 ml、去离子水1700ml、青霉素100万单位、链霉素100万单位、兔溶血液100ml ;该利什曼原虫液体培养基按下述步骤得到第一步，依次将上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混匀于上述所需要量的去离子水中，用
0.IMol/L的NaOH溶液调节pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混匀；第二步，将充气管插入到液体下部，用充气管充注CO2气体到液体中，直至液体颜色由淡红色变为亮黄色，此时CO2气体在液体中达到饱和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和链霉素充分混匀；第四步，将充分混匀后的液体放在除菌过滤器中用压力为
0.4公斤/cm2的CO2气体压滤除菌后得到利什曼原虫液体培养基，然后将利什曼原虫液体培养基分装到灭菌塑料瓶或玻璃瓶中密闭保存。利什曼原虫液体培养基在温度为_20°C下可保存I. 5年、温度为4°C下可保存3个月、温度为25°C下可保存30天。
实施例2 :与实施例I的不同之处实施例2的兔溶血液按下述步骤得到第一步，选I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，无菌采血，玻珠法脱纤维，按脱纤维之后血量体积的2倍加去离子水，在温度为_5°C至5°C之间反复冻溶至血红细胞破裂，然后在离心机中4000g离心20分钟，弃沉淀，上清液即为兔溶血液。上述实施例所得利什曼原虫液体培养基按下述步骤进行应用
在以下实际应用中，严格按生物安全操作规定实施。一培养分离利什曼原虫的设备和材料准备
I.设备和器材生物安全柜，倒置显微镜，细胞培养瓶，毛细玻管，rk39ELISA试剂盒，rk39dipstick，一次性注射器，0. 9%生理盐水，眼科剪刀，5ml细胞培养瓶。2.利什曼原虫液体培养基将上述实施例所得利什曼原虫液体培养基调节为pH
7.2利什曼原虫液体培养基用于培养利什曼原虫前鞭毛体；将上述实施例所得利什曼原虫液体培养基调节为PH 6. 4利什曼原虫液体培养基用于培养利什曼原虫利杜体。临用前，将低温保存的上述调节好的利什曼原虫液体培养基融化并摇匀，无菌操作分装于5ml细胞培养瓶，每瓶4ml。4°C可保存30天。二培养分离利什曼原虫标本采集
I.采集疑似黑热病病人骨髓
采取有疑似黑热病临床症状的病人血清，按rk39dipstick或rk39ELISA使用说明书检测血清rk39抗体，黑热病抗体阳性的患者，在治疗用药前采取骨髓。2.采集动物骨髓、脾脏标本
用rk39dipstick或rk39ELISA检测动物血清rk39抗体阳性的动物,体型较大的如家犬等，采取骨髓；小型啮齿类动物，亦可采取股骨骨髓或脾脏标本，取骨髓或脾脏0. Ig,在凹孔载玻片上研碎，加0. 2ml上述实施例所得利什曼原虫液体培养基，研磨成混悬液。3.采集白蛉标本
钨丝灯诱捕白蛉，鉴定分类后，解剖取胃内容物，加0. Iml上述实施例所得利什曼原虫液体培养基，研磨成混悬液。三培养和观察方法
将疑似黑热病病人骨髓、动物脾脏、白蛉胃内容物混悬液0. 01ml，分别加到装有上述调节好的pH7. 2利什曼原虫液体培养基的毛细玻管或培养瓶中，封口后25°C培养。从接种后第2天开始，每天用倒置显微镜200倍镜下观察，发现有鞭毛体游动，便可以确定有前鞭毛体生长；连续观察到第15天，仍未观察到前鞭毛体，按利什曼原虫培养阴性处理。上述调节好的pH6. 4利什曼原虫液体培养基用于培养利杜体，把有前鞭毛体生长的培养液接种到上述调节好的PTO. 4利什曼原虫液体培养基中，3天后取培养液涂片，瑞氏染色或姬姆萨氏染色，油镜观察生长情况。四利什曼原虫扩大培养和保种
观测到有前鞭毛体生长的第8天，取部分有前鞭毛体的培养液，用2倍量上述调节好的利什曼原虫液体培养基稀释，扩大培养。已成功纯化培养的利什曼原虫，用上述调节好的利什曼原虫液体培养基稀释到每毫升10万个利什曼原虫，18°C _22°C试管内可以保存40天，上述方法可传代保存利什曼原虫。
权利要求
1.一种利什曼原虫液体培养基，其特征在于该利什曼原虫液体培养基含有NaCl8.5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清200 ml、去离子水1700ml、青霉素100万单位、链霉素100万单位、兔溶血液100 ml ;该利什曼原虫液体培养基按下述步骤得到第一步,依次将上述所需要量的NaCl、KCl、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混匀于上述所需要量的去离子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液调节pH至7. 2，加入上述所需要量的Hepes, RPMI-1640和小牛血清混匀；第二步，将充气管插入到液体下部，用充气管充注CO2气体到液体中，直至液体颜色由淡红色变为亮黄色，此时CO2气体在液体中达到饱和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和链霉素充分混匀；第四步，将充分混匀后的液体放在除菌过滤器中用压力为0. 4公斤/cm2的CO2气体压滤除菌后得到利什曼原虫液体培养基，然后将利什曼原虫液体培养基分装到灭菌塑料瓶或玻璃瓶中，密闭，-20°C保存。
2.根据权利要求I所述的利什曼原虫液体培养基，其特征在于所述兔溶血液按下述步骤得到第一步，选I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，无菌采血，玻珠法脱纤维，按脱纤维之后血量体积的2倍加去离子水，在温度为-5°C至5°C之间反复冻溶至血红细胞破裂，然后在离心机中4000g离心20分钟，弃沉淀，上清液即为兔溶血液。
3.—种利什曼原虫液体培养基的制备方法，其特征在于按下述步骤进行该利什曼原虫液体培养基含有 NaCl 8. 5g、KCl 0. 4g、NaHCO3 I. 6g、KH2PO3 0. 2g、CaCl2 0. 2g、葡萄糖 5. 0g、L-谷氨酰胺 0. lg、Hepes 4. 5g、RPMI-1640 10. 4g、小牛血清 200 ml、去离子水1700ml、青霉素100万单位、链霉素100万单位、兔溶血液100 ml ;该利什曼原虫液体培养基按下述步骤进行第一步，依次将上述所需要量的NaCl、KC1、NaHC03、KH2P03、CaCl2、葡萄糖和L-谷氨酰胺溶解混匀于上述所需要量的去离子水中，用0. IMol/L的NaOH溶液调节pH至7. 2，加入上述所需要量的H印es、RPMI-1640和小牛血清混匀；第二步，将充气管插入到液体下部，用充气管充注CO2气体到液体中，直至液体颜色由淡红色变为亮黄色，此时CO2气体在液体中达到饱和；第三步，加入上述所需要量的兔溶血液、青霉素和链霉素充分混匀；第四步，将充分混匀后的液体放在除菌过滤器中用压力为0. 4公斤/cm2的CO2气体压滤除菌后得到利什曼原虫液体培养基，然后将利什曼原虫液体培养基分装到灭菌塑料瓶或玻璃瓶中，密闭，_20°C保存。
4.根据权利要求3所述的利什曼原虫液体培养基的制备方法，其特征在于所述兔溶血液按下述步骤得到第一步，选I. 3Kg至I. 5Kg的雌兔，无菌采血，玻珠法脱纤维，按脱纤维之后血量体积的2倍加去离子水，在温度为-5°C至5°C之间反复冻溶至血红细胞破裂，然后在离心机中4000g离心20分钟，弃沉淀，上清液即为兔溶血液。
全文摘要
本发明涉及黑热病疫情监测和黑热病诊断的液体培养基技术领域，是一种利什曼原虫液体培养基及其制备方法;本发明通过利什曼原虫液体培养基培养疑似黑热病病人的骨髓和肿大的动物脾脏，培养并分离利什曼原虫，与传统3N培养基比较，培养和分离荒漠型黑热病利什曼原虫的分离率，由不到1%提高到10%以上；出结果快，培养观察出结果时间由15天缩短到5天；保存方便，有效期由30天延长到2年。为黑热病临床诊断、流行病调查和利什曼原虫抗药性研究提供依据。
文档编号C12N1/10GK102746989SQ20121025094
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者廖力夫, 徐兵, 徐艺玫, 燕顺生 申请人:新疆维吾尔自治区实验动物研究中心