一株短双歧杆菌及其制备共轭亚油酸或共轭亚麻酸的应用
【专利摘要】本发明涉及一种短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)C11(CCFM683)及其用途。本发明短双歧杆菌C11(CCFM683)能够高效将游离亚油酸、亚麻酸分别转化为更具生物活性的共轭亚油酸、共轭亚麻酸，可直接用于制备共轭亚油酸、共轭亚麻酸，也可用于生产富含共轭亚油酸、共轭亚麻酸的食品。CGMCC No. 1182820151204
【专利说明】-株短双歧杆菌及其制备共辆亚油酸或共辆亚麻酸的应用 【技术领域】
[0001 ] 本发明设及一株筛选得到的短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)Cll菌株，W及 该菌株在制备共辆亚油酸或共辆亚麻酸中的应用。 【【背景技术】】
[0002] 共辆亚油酸（Conjugated Iinoleic acid,CLA)是含有共辆双键的十八碳二締酸 总称，是亚油酸化inoleic acid, 18:2)的位置异构体和几何异构体。最丰富、最常见的异构 体是顺9，反11-化4(。9，111-化4)，亦被称为瘤胃酸(咖1116111。日別(1)。此外，反10，顺12-化八 (tlO，cl2-CLA)也是自然界含量相对较高的异构体。共辆亚油酸因其生物功能而受到关注， 不同的共辆亚油酸异构体具有不同的生理功能，其中c9，tll-CLA和tlO，cl2-CLA是公认的 最具生理活性的共辆亚油酸异构体，c9，tll-CLA最主要的功能在于抗癌、抗炎及免疫调节 等方面，而tlO，cl2-CLA对于减肥和脂质代谢方面的影响是非常显著的。此外，t9，tll-CLA 也被报道具有抗炎等活性。
[0003] 共辆亚麻酸（Conjugated Iinolenic acid,CLNA)是由亚麻酸(Xinolenic acid, LNA)衍生而来具有共辆双键的十八碳=締酸多种位置与几何异构体的总称，它具有多种营 养和保健功能，如抗癌、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化、降低体脂含量、膜岛素抵抗、调节机体 免疫等多种营养和保健功能，已成为医学、化学、营养学等领域的研究热点。在共辆亚麻酸 的各种立体异构体中，。9，111，。15-化臟(化臟1)、19，111，。15-化臟(化臟2)、110，。12，。15- CLNA和c6，c9，tl I-CLNA等是被认为最具生物活性的异构体。
[0004] 天然的共辆亚油酸主要存在于瘤胃动物牛、羊等的乳脂及肉制品中，每克乳脂中 含量从2mg-25mg不等，且CLA含量随奶牛年龄增长而增加。非天然来源的CLA主要通过人工 合成获得。人工合成的CLA因其原料和合成方法不同，所得产品中各异构体的含量相差甚 远。
[0005] 天然的共辆亚麻酸存在于自然界的一些植物种子如石恼巧、油桐巧、苦瓜巧、金盏 花巧、括楼和蓝花摇巧等。然而，众多含有共辆亚麻酸的植物种子中仅括楼巧可直接食用， 且植物种巧中的油脂成分很复杂，W植物巧油脂为原料实现共辆亚麻酸的分离与纯化十分 困难。
[0006] 另一方面，现有技术通过碱处理亚麻酸异构化法也可产生共辆亚麻酸，但其产率 较低，且有试剂残留，故至今尚未实现共辆亚麻酸的工业化生产。
[0007] 目前有研究发现通过微生物转化CLAXLNA，特别有些乳酸菌具有共辆亚油酸和共 辆亚麻酸转化能力，例如Gorissen等对30多株双歧杆菌生物转化CLA和共辆亚麻酸进行了 研究，在36株双歧杆菌中发现6株可W产CLA或CLNA，6株双歧杆菌中对两种共辆脂肪酸的转 化率最高的分别为53%、78% (Gorissen L,et al.Production of con化gated Iinoleic acid and conjugated!inolenic acid isomers by Bifidobacterium species[J].Appl Microbiol Biotechnol ,2010,87(6) :2257-2266.)。然而，所得脂肪酸的异构体并非Wc9, tl I-化A和tlO，cl2-化A或c9，tl I，cl5-化NA和t9，tl I，cl5-化NA为主。 【
【发明内容】
】
[0008] 本发明的目的是克服现有技术缺陷，获得一株异常高产共辆亚油酸、共辆亚麻酸、 且转化率更高、且产物中Wc9，tll-CLA和tl0，cl2-化A或c9，tll，cl5-化NA和巧，tll，cl5- CLNA为主的短双歧杆菌菌株，且脂肪酸产物留存在发酵液中W易于分离纯化。
[0009] 到本发明还提供上述菌株在产共辆亚油酸或共辆亚麻酸中的应用。
[0010] 为了实现W上目的，本发明提供一株短双歧杆菌(Bif idobacterium breve)Cll， 该菌株已于2015年12月04日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏，其保 藏号为CGMCC No. 11828。
[0011] 运株短双歧杆菌Cl 1也被命名为CCFM683，留存于江南大学食品生物技术菌种保藏 中屯、。
[0012] 本发明的菌株经分离、筛选后，采用了包括细菌基因组DNA提取、16S rDNA特异引 物PCR扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤进行种属鉴定，鉴定为短双歧杆菌，并 命名为短双歧杆菌Cll (或CCFM683)。
[0013] 短双歧杆菌Cl 1具有下述生物学特性：
[0014] 菌体特征:呈乳白色。
[0015] 菌落特征：在mMRS固体平板上菌落突起，光滑、圆形、乳白色、半透明、直径为1~ 2mm
[0016] 生长特性:在37 °C恒溫厌氧的条件下，在MRS培养基中培养约24h达到对数末期。
[0017] 短双歧杆菌是双歧杆菌属中的一种。双歧杆菌属共包含35个种，包括青春双歧杆 菌、动物双歧杆菌动物亚种、动物双歧杆菌乳酸亚种（即乳双歧杆菌）、两歧双歧杆菌、熊峰 双歧杆菌、布姆双歧杆菌、短双歧杆菌、链双歧杆菌、豚双歧杆菌、棒状双歧杆菌、家兔双歧 杆菌、齿双歧杆菌、没食子双歧杆菌、鸡双歧杆菌、长双歧杆菌长亚种、长双歧杆菌婴儿亚 种、大双歧杆菌、最小双歧杆菌、假小链双歧杆菌、假长双歧杆菌假长亚种、假长双歧杆菌球 旋虫亚种、小鸡双歧杆菌、细长双歧杆菌、嗜热双歧杆菌等。
[0018] 由于双歧杆菌属种类繁多，同属不同种的双歧杆菌在形态、生理、代谢及生理功能 等多方面存在显著差异，目前为止，尚未有研究发现短双歧杆菌能够转化共辆脂肪酸，仅少 数同属不同种的菌株具备较低转化率。目前也尚未有研究确定导致差异的原因或机理。
[0019] 本发明还提供所述短双歧杆菌Cll在制备共辆亚油酸中的应用，特别地将亚油酸 转化为共辆亚油酸，特别是转化为c9，tl I-CLA和tio，C12-CLA。
[0020] 本发明还提供所述短双歧杆菌Cll在制备共辆亚麻酸中的应用，特别地将亚麻酸 转化为共辆亚麻酸，特别是转化为c9，tl 1，Cl5-化NA和t9，tl 1，Cl5-化NA。
[0021] 本发明还提供所述短双歧杆菌Cll在制备富含共辆亚油酸、共辆亚麻酸的食品中 的应用。
[0022] 短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)Cll，该菌株于2015年12月04日在中国微生 物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国 科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 11828。 【【附图说明】】
[0023] 图I为本发明中短双歧杆菌的分离、纯化及保藏操作流程图；
[0024] 图2为本发明短双歧杆菌B.breve C1UCCFM683)共辆亚油酸的转化率；
[0025] (A)共辆亚油酸总浓度随培养时间的变化
[0026] (B)培养72小时后培养液、胞内的共辆亚油酸的分布
[0027] 图中：SA:硬脂酸，VA:异油酸，OA:油酸，LA:亚油酸，CLAl: c9，111-CLA，CLA2:巧， tIl-CLA
[0028] 图3为本发明短双歧杆菌B.breve C1UCCFM683)共辆亚麻酸的转化率；
[0029] (A)共辆亚麻酸总浓度随培养时间的变化
[0030] (B)培养72小时后培养液、胞内的共辆亚麻酸分布
[0031] 图中：0A:油酸，LA:亚油酸，ALA:亚麻酸，化NAl:c9，tll，cl5-化NA,化NA2:巧，til, C15-化NA 【【具体实施方式】】
[0032] 下述实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。
[0033] 在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度或比例的"％"或百分比均为重量百分 比。
[0034] 本发明设及W下培养基：
[0035] mMRS液体培养基:膜蛋白腺lOg、牛肉浸膏lOg、酵母粉5g、葡萄糖20g、巧樣酸氨二 锭2g、醋酸钢5g、憐酸氨二钟2g、屯水硫酸儀0.5g、一水合硫酸儘0.25g，吐溫801血与0.5g半 脫氨酸，加水至1000 mL。
[0036] mMRS固体培养基是在W上基础添加W液体培养基总重计1.5%琼脂得到的。
[0037] 实施例1:样品的采集和双歧杆菌的分离鉴定
[0038] 新生儿粪便样品，采集于无锡市第九人民医院。
[0039] 取Ig新生儿粪便样品，梯度稀释后涂布于mMRS固体培养基，置于厌氧环境下在37 °C下培养72h，观察记录菌落形态，挑去菌落划线纯化，然后在MMRS液体培养基中在37°C下 培养4她，所得菌落进行革兰氏染色并记录菌株形态，弃除菌落中的革兰氏阴性菌株和革兰 氏阳性球菌，挑选得到革兰氏阳性杆菌，经过过氧化氨酶分析后弃除过氧化氨酶阳性菌株， 保留过氧化氨酶阴性菌株，W果糖-6-憐酸激酶检测W弃除阴性菌株，所得均经过16S rDNA 测序鉴定为短双歧杆菌，命名为短双歧杆菌C11。所得短双歧杆菌进行传代培养，收集菌体 置于离屯、管中3000rpm离屯、IOmin洗涂，重复3次，所得菌体加入基体保护剂中进行冻存、保 藏。
[0040] 168扣麻扩增条件：951：5111111;35个循环（951：3〇3,551：3〇3,721：2111111);721： IOmin
[0041] 扩增引物：
[0042] 27F:(5 '-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 '）
[0043] 1492R:(5'-TACGGCTACCTTGTTACGACT T-3'
[0044] 扩增产物纯化和序列比对过程按文献（Turroni F et al.Exploring the Diversity of the Bifidobacterial Population in the Human Intestinal Tract[J] .Appl Environ Microb.2009;75(6) :15:34-45)记载的方法进行。
[0045] 所得短双歧杆菌(Bifidobacterium breve Cl I (CCFM683))的基本特性见表1。
[0046] 表1短双歧杆菌C1UCCFM683)的基本特性
[0047]
[004引实施例2:短双歧杆菌Cl 1 (CCFM683)生物转化共辆亚油酸 [0049]具体实验如下：
[0化日]1、菌株活化
[0051]从-80°C冰箱取出保有短双歧杆菌Cll的甘油管，取菌液划线于mMRS固体培养基 上，厌氧环境下37°C培养4她。挑取长出的单菌落并接种于mMRS液体培养基中，厌氧环境下 37 °C培养4她，连续活化3代。
[0化2] 2、亚油酸母液的配制
[0化3] 称取300mg亚油酸(LA)和200mg Tween-80溶于水并定容至IOmL,充分揽拌乳化后， 经0.45WI1无菌滤膜过滤除菌后保存于-20°C避光保存。
[0化4] 3、与亚油酸共培养
[0化日]将活化好的菌液按照2% (v/v)接种量接种至含0.64mg/mL LA(210iil前述亚油酸 母液）的IOmL mMRS液体培养基中，厌氧环境下37°C培养0、12、24、48、7化，同时W添加等量 亚油酸母液而不添加菌液的培养基为对照。培养后，将菌液移至离屯、管中，WSOOOrpm离屯、 5min，每份发酵产物各取3份3mL发酵液至干净离屯、管待用，离屯、后所得菌体待用。
[0056] 4、脂肪酸提取
[0057] 提取发酵液中的脂肪酸：向每一支3mL发酵液中添加十屯烧酸(C17:0)至终浓度为 0.075mg/mL作内标，然后添加2mL异丙醇，充分振荡30s ;再添加3mL正己烧，充分振荡30s ; 500化pm离屯、3min，吸取正己烧层至干净提脂瓶中，氮气吹干得到脂肪酸。
[005引提取菌体中的脂肪酸：前述离屯、所得菌体用2mL盐溶液（0.137mol/L NaCl, 7.Ommol/L K2HPO4,2.5mmoL/L K此P04)洗涂，4000rpm离屯、5min，重复洗涂步骤。再将菌体重 悬于2mL前述盐溶液中，添加十屯烧酸C17:0至终浓度为0.0575mg/mL，按与发酵液相同的方 法进行脂肪酸提取及氮气吹干，得到菌体中的脂肪酸。
[0059] 5、脂肪酸甲醋化
[0060] 向前述发酵液脂肪酸、菌体脂肪酸用氮气吹干后分别加入40化L甲醇，充分振荡混 匀后W15化L重氮甲烧试剂直接进行甲醋化，氮气吹干后用ImL正己烧回溶，转移至气相瓶， 待进行GC-MS检测。
[0061 ] 6、GC-MS 检测
[0062] 岛津气相色谱仪(GC 2010plus)，气相柱IUx-wax(30mX0.25mmX0.25皿），质谱仪 (岛津叫tra QP2010)。
[0063] 程序升溫条件:初始150°C，W5°C/min的速率升溫至200°C，保持1 Omin，后W4°C/ min升溫至230°C，保持18min。采用分流进样，进样量化L，分流比50:1，氮气为载气。进样器 溫度和检测器溫度均为240°C。离子源220°C，强度为70eV。
[0064] 7、实验结果
[0065] 所得脂肪含有:硬脂酸0.043mg/mL、油酸0.017mg/mL、异油酸0.005mg/mL、亚油酸 0.087mg/mL、CLA0.4703mg/mL。
[0066] 化A的积累过程中，短双歧杆菌CCFM683在含有0.64mg/mL LA的mMRS中生长12h时 开始转化CLA，随着菌体生长共辆亚油酸的含量逐渐增加(24h、3化），培养36h后发酵液中共 辆亚油酸的浓度趋于饱和，如图2-A所示。该菌对LA的最大转化率为培养72h左右，CLA的总 含量达到了0.4703mg/mL，W底物LA总量计CLA的总转化率为73.48%。
[0067] 经过脂肪酸分析，从CLA各异构体含量来看，所得发酵产物只含有CLAl和CLA2两种 异构体。菌株在培养1化后开始转化CLAl。随着菌体生长，异构体CLAl在12h到3化内快速累 积，CLAl的含量在菌株培养36h后趋于饱和，而CLA2在菌株开始积累CLA时（24h)含量较低， 随着培养时间的延长，该异构体的浓度也进一步增加。培养72h后，CLAl的浓度高达为 0.4392mg/mL，占总化A产量的93.39%。
[0068] 从培养7化后短双歧杆菌C1UCCFM683)发酵液及菌体脂肪酸组成可发现，该菌对 LA的吸收与转化率均极高，显著高于现有技术。分析显示，发酵液中仅剩少量的底物LA且菌 体内也几乎未残留尚未被转化的LA。转化得到的CLA绝大多数均处于发酵液中，菌体内存留 的量仅为〇.〇62mg/mL、显著少于发酵液中的CLA浓度。该结果也表明绝大多数CLA产物均不 在胞内积累，而是被转运至胞外，且CLA在发酵液中占总脂肪酸的比例超过75%，纯度较高， 因此能够有效简化后期对发酵液中CLA的分离纯化。
[0069] 实施例3:短双歧杆菌Cl 1 (CCFM683)生物转化共辆亚麻酸
[0070] 1、菌株活化
[0071] 从-80°C冰箱取出保有短双歧杆菌Cll的甘油管，取菌液划线于mMRS固体培养基 上，厌氧环境下37°C培养4她。挑取长出的单菌落并接种于mMRS液体培养基中，厌氧环境下 37 °C培养4她，连续活化3代。
[0072] 2、亚麻酸母液的配制
[0073] 称取SOOmga-亚麻酸(a-LNA)和200mg Tween-80溶于水并定容至IOmL,充分揽拌乳 化后，经0.45WI1无菌滤膜过滤除菌后保存于-20°C，避光保存。
[0074] 3、与亚麻酸共培养
[0075] 将活化好的菌液按照2%(v/v)接种量接种至含a-LNA 0.3759mg/mL的IOmL mMRS 液体培养基中，厌氧环境下37°C培养0、12、24、36、48、72h，同时W添加等量亚麻酸而不添加 菌液的培养基为对照。培养后，将菌液移至离屯、管中，50(K)rpm，离屯、5min;取3份3mL发酵液 至干净离屯、管待用。
[0076] 4、脂肪酸提取
[0077] 发酵液中脂肪酸的提取：向3mL发酵液中添加十屯烧酸（C17:0)至终浓度为 0.0767mg/mL作内标，然后添加2mL异丙醇，充分振荡30s;再添加3mL正己烧，充分振荡30s; 500化pm离屯、3min，吸收正己烧层至干净提脂瓶中，氮气吹干，得到发酵液中的脂肪酸。
[007引菌体中脂肪酸提取：前述离屯、所得菌体用2mL盐溶液（含0.137mol/L NaCl, 7. Ommol/L K2HPO4，2.5mmoL/L KH2PO4)洗涂，4000rpm离屯、5min，重复洗涂步骤。所得菌体重 悬于2mL上述盐溶液中，添加十屯烧酸(C17:0)至终浓度为0.0575mg/mL，按与发酵液相同的 处理方法进行脂肪酸提取及氮气吹干。
[0079] 5、脂肪酸甲醋化
[0080] 向氮气吹干后的样品中加入4(K)化甲醇，充分振荡混匀后W适量重氮甲烧试剂直 接进行甲醋化，氮气吹干后用ImL正己烧回溶，转移至气相瓶，待进行GC-MS检测。
[0081 ] 6、GC-MS 检测
[0082] 岛津气相色谱仪(GC 2010plus)，气相柱IUx-wax(30mX0.25mmX0.25皿），质谱仪 (岛津叫tra QP2010)。程序升溫条件:初始溫度150°C，W5°C/min的速率升溫至200°C，保持 lOmin，然后W4°C/min升溫至230°C，保持18min。采用分流进样，进样量化L，分流比50:1，氮 气为载气。进样器溫度和检测器溫度均为240°C。离子源220°C，强度为70eV。
[0083] 7、实验结果
[0084] 短双歧杆菌Cll在含有0.3759mg/mLa-LNA的mMRS中生长1化时开始转化化NA,随着 菌体生长共辆亚麻酸的含量逐渐增加（24h、3化），培养3加后共辆亚麻酸的含量趋于饱和， 如图3-A。该菌对LNA的最大转化率为培养7化左右，化NA的总含量达到了0.3347mg/mL，W底 物a-LNA总量计其转化率为89.04%。
[0085] 经过化NA各异构体含量分析，所得产物中只有化NAl和化NA2两种异构体，即共辆 亚麻酸中最具有生物活性的。9，*11，。15-化魁和巧，*11，(315-化魁。菌株在培养1211后开始 转化共辆亚麻酸，随着菌体生长，异构体CLNAl在1化到36h内快速累积，CLNAl的含量在菌株 培养3加后趋于饱和，而化NA2在菌株开始积累化NA时（24h)含量较低，随着培养时间的延 长，该异构体的浓度也进一步增加，最终化NAl浓度为0.3218mg/mL，化NA2浓度为0.0129mg/ ITlL O
[0086] 从培养7化的短双歧杆菌C1UCCFM683)发酵液及菌体脂肪酸组成可W发现，该株 菌对a-LNA的吸收与转化率均极高，显著高于其他现有技术。且经过分析得知，发酵液中几 乎没有底物LNA剩余而且菌体内也仅剩极少量的LNA尚未被转化，所转化的CLNA绝大多数均 处于发酵液中，菌体内存留的量也非常少。且化NAl和化NA2在发酵液与菌体内的分布情况 基本一致，该结果也表明绝大多数的产物均不在胞内积累，而是被转运至胞外，因此有利于 后期的进一步分离与纯化。
【主权项】
1. 一株短双歧杆菌(Bif idobacterium breve)Cl I，该菌株于2015年12日04日保藏于中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No. 11828。2. 权利要求1所述的短双歧杆菌Cll在制备共辄亚油酸中的应用。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述短双歧杆菌Cll将亚油酸转化为共辄亚 油酸。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述共辄亚油酸是c9，tll-CLA和tl0，cl2-CLA05. 权利要求1所述的短双歧杆菌Cll在制备共辄亚麻酸中的应用。6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述短双歧杆菌Cl 1将亚麻酸转化为共辄亚 麻酸。7. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述共辄亚麻酸是c9，111，c 15-CLNA和t9， tll，cl5-CLNA〇8. 权利要求1所述的短双歧杆菌Cll在制备富含共辄亚油酸、共辄亚麻酸的食品中的应 用。
【文档编号】C12R1/01GK105925514SQ201610547034
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年7月12日
【发明人】杨波, 陈卫, 陈海琴, 赵建新, 张灏, 陈永泉
【申请人】江南大学