专利名称:用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法
技术领域：
本发明涉及一种生产多不饱和脂肪酸二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法，具体地说是一种用海洋微藻中的寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii(Selgo)Javornicky]发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法。
背景技术：
近年来，多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFAs)对人类健康的重要作用已愈来愈受到人们的重视。其中，二十二碳六烯酸因其在人体和动物体内的重要生理功能而倍受人们的青睐。研究表明，DHA是人体某些组织中细胞膜的基本组分；对婴幼儿视觉系统和神经系统的发育起着重要作用；还具有降低胆固醇作用，抗凝血功效以及抑制癌功效，防止老年性痴呆症等，并且它是幼鱼生长所必需的一种脂肪酸。现在公开报道用海洋微藻生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法有两种。一种是授权公告日为2006年7月19日、授权公告号为CN1264967C的发明专利公开的利用海洋真菌裂殖壶菌发酵生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法。另一种是
公开日为1995年4月5日、公开号为CN1101034A的专利申请公开的利用海洋微藻生产二十二碳六烯酸(DHA)油脂的方法。上述两种方法存在的缺陷在于二十二碳六烯酸(DHA)的产量不高。前一种方法海藻细胞的干重生物量为14-25g/L，菌体中DHA的百分含量为18-35％，后一种方法得到的海藻细胞的干重生物量更低，只有4-8g/L。其原因主要是与所选菌种有关外，还与培养工艺有直接的关系，如采用合适的培养基等。多年来，国内外许多研究者进行了大量的研究筛选不同的菌种，研究采用各种培养工艺均没有得到理想的结果。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术存在的缺陷，提供一种用海洋微藻中的寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，它大大地提高了二十二碳六烯酸(简称DHA)的产量。
本发明的技术方案是这样实现的它是以寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]为出发菌株，在液体培养基中连续培养寇氏隐甲藻得到海藻细胞，然后从海藻细胞中提取二十二碳六烯酸油脂。本发明所用的寇氏隐甲藻菌种名称是Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky。可以从包括ATCC(美国典型培养物收集中心)的保藏培养机构获得。
其中所用的培养基为每100ml液体培养基中含有氯化钠0.5-2.0g 硫酸镁0.2-0.8g氯化钙0.01-0.05g 葡萄糖1.0-10g氯化钾0.01-0.08g 磷酸二氢钾0.1-0.5g谷氨酸钠0.5-5.0g 酵母膏0.5-5.0g维生素B10.001-0.01g 维生素B60.001-0.01g。
优选的培养基配方如下氯化钠1.8g 硫酸镁0.55g氯化钙0.035g 葡萄糖7g氯化钾0.05g 磷酸二氢钾0.32g谷氨酸钠3.8g 酵母膏3.5g维生素B10.006g 维生素B60.008g。
本发明采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到海藻细胞。其中海藻细胞的生产方法具体步骤如下(1)取出斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶种，25-35℃培养，培养24-72小时。
(2)将步骤1中的摇瓶菌种转接入装有摇瓶扩大培养基的摇瓶中进行扩大培养，25-35℃培养，转速120-180rpm/min，培养30-60小时。
(3)将步骤2中的摇瓶菌种转接入一个装有一级种子培养基的发酵罐中，接种量为0.1-1％，保持罐温25-35℃，罐压0.05-0.09kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵24-48小时。
(4)将一级种子罐中的菌种转接入一个装有二级种子培养基的发酵罐中，接种量为1-10％，保持罐温25-35℃，罐压0.05-0.09kPa，搅拌速度80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵24-48小时。
(5)将二级种子罐种的菌种转接入一个装有三级发酵培养基的发酵罐中，接种量为1-10％，保持罐温25-35℃，罐压0.05-0.09kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量1∶0.3-0.5v/v.m，发酵60-120小时。在还原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下时放罐。放罐后液体使用膜过滤方法，回收海藻细胞。
本发明的提取方法有两种，一种是将海藻细胞经低温干燥，然后将干燥菌丝体用有机溶剂浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，将二十二碳六烯酸毛油经碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。另一种是在浓缩发酵液中加入表面活性剂，如十二烷基硫酸钠作为破壁剂，其用量为浓缩发酵液重量的0.1-0.6％，然后用有机溶剂浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，将二十二碳六烯酸毛油经脱胶、脱酸、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。其中所述的有机溶剂为正己烷或氯仿等。优选的提取方法是在α-生育酚存在或在惰性气体如氮气中，进行从海藻细胞中提取DHA。采用后一种提取方法的优点是不需要经过干燥，可以防止二十二碳六烯酸毛油的氧化，使萃取油脂过氧化值极低，POV值在0.5以下。
本发明所用培养基可含有适当的碳源、氮源、无机盐。所述的培养基是以葡萄糖或甘油或果糖为碳源，以酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、谷氨酸、玉米浆、大豆蛋白中一种或混合物为氮源。
培养基中用于连续培养的碳源浓度一般优选在1.0到10.0％重量范围内。
培养基中用于连续培养的氮源浓度可以优选在0.5到5.0％重量范围内。
对于连续添加的培养基，可以用相对于培养基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏补充到培养基(I)中形成的改良培养基。
本发明选用合适的海洋微藻作为菌种，在培养基中加入了维生素，通过筛选合适的工艺方法，大大提高了二十二碳六烯酸油脂的产量，海藻细胞中二十二碳六烯酸含量在30％-50％，获得的海藻细胞为20-40g/L，海藻细胞含油量为20-50％。以上各项指标明显高于现有技术。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步描述实施例1培养基配方(g/100ml)(I)氯化钠1.25g 氯化钾0.07g 氯化钙0.035g硫酸镁0.8g 磷酸二氢钾0.2g 谷氨酸钠4.0g酵母浸膏2.0g 葡萄糖7.5g 维生素B10.003g维生素B60.005g。
加水至所需体积，PH控制在6.5-7.0。
培养基(II)相对于培养基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏补充到培养基(I)中形成的改良培养基。
本发明采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到海藻细胞。其生产方法具体步骤如下将名称为Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的寇氏隐甲藻细胞接种在无菌斜面培养基中，培养温度为28℃，培养时间48h。
将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床培养48-72小时，摇床转速150r/min。然后将所得摇瓶菌种100ml接种到5个三角摇瓶(1000ml)中，每个含200ml培养基(PH6.8)进行扩大培养，28℃摇床培养48小时，摇床转速150r/min。对以上每个摇瓶做无菌检测，将反应良好的摇瓶种子接入一级种子罐。
将三角摇瓶扩大的菌种1000ml转接入装有60L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温28℃，罐压0.07KPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间48小时。将一级种子罐菌种转接入装有700L种子培养基(PH7.0)的1000L容积的二级种子培养罐中，保持罐温28℃、罐压0.07KPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间36小时。将二级种子罐菌种转接入装有30000L三级发酵罐中，保持罐温28℃、罐压0.07KPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间80小时。
本实施例中斜面培养基组成是(g/100ml)葡萄糖5g，酵母浸膏1.2g，琼脂1.5g，加水定容至100ml。
本实施例中摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养、三级发酵培养基均为为培养基(I)。
在发酵开始后，收集样品，在105℃干燥5h以测量藻细胞密度。当藻细胞的密度达到5g/L时，在与上述罐发酵相同的培养条件下，通过以0.1h/r的稀释速率连续补充培养基(II)，从而开始连续培养3天。连续培养开始后，在培养基中未发现一个有复鞭毛的藻细胞。(下文将由此得到的藻细胞称为“连续培养藻细胞”)本实施例中发酵结束标准是发酵液开始变浓，还原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下，镜检发现菌体开始衰老。
将从发酵器中流出的发酵液在105℃干燥5h以找出产率为30.0g/L的干燥细胞和一个油脂生产量为10g/L的干燥藻细胞。
将从发酵器中流出的发酵液经膜过滤浓缩后，低温干燥，干燥藻细胞用正己烷萃取，得到DHA毛油，DHA毛油经脱胶、脱酸、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。DHA油脂经甲基酯化，用气相色谱分析确定其含量。
经气相层析确定的藻细胞中脂肪酸组成如下。
脂肪酸名称 脂肪酸含量C10:0 0.3532
C12:0 0.1065C14:0 11.0994C16:0 22.39C16:1 0.199C18:0 0.9863C18:1 0.3714C18:2 0.3588C18:4 0.1092C20:4 3.645C20:5 0.4312C22:5 16.17C22:6 43.78实施例2海藻细胞的培养和发酵同实施例1相同。提取方法是将从发酵器中流出的发酵液经膜过滤浓缩后，在浓缩发酵液中加入十二烷基硫酸钠作为破壁剂，其用量为浓缩发酵液重量的0.1-0.6％，然后用正己烷浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，将二十二碳六烯酸毛油经脱胶、脱酸、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。
DHA精炼油过氧化值为0.1meq/kg，酸价0.14mg(KOH)/g。
DHA油脂经甲基酯化，用气相色谱分析确定其含量。
经气相层析确定的藻细胞中脂肪酸组成如下。
脂肪酸名称 脂肪酸含量C10:0 0.3532C12:0 0.1065C14:0 11.0994C16:0 22.39C16:1 0.199C18:0 0.9863C18:1 0.3714C18:2 0.3588
C18:4 0.1092C20:4 3.645C20:5 0.4312C22:5 16.17C22:6 43.78实施例3培养基(I)氯化钠1.35g 氯化钾0.065g 氯化钙0.04g硫酸镁0.7g 磷酸二氢钾0.3g 谷氨酸钠4.3g酵母浸膏3.0g 葡萄糖8.5g 维生素B10.005g维生素B60.006g加水至100ml培养基(II)相对于培养基(I)，用10％(V/V)葡萄糖和2.4％(V/V)酵母浸膏补充到培养基(I)中形成的改良培养基。
将名称为Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的细胞接种在无菌斜面培养基中，培养温度为28.5℃，培养时间48h。
将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28.5℃摇床培养48-72小时，摇床转速140r/min。然后将所得摇瓶菌种100ml接种到5个三角摇瓶(1000ml)中，每个含200ml培养基(PH6.8)进行扩大培养，28.5℃摇床培养48小时，摇床转速140r/min。对以上每个摇瓶做无菌检测，将反应良好的摇瓶种子接入一级种子罐。
将三角摇瓶扩大的菌种1000ml转接入装有60L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温28.5℃，罐压0.07KPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间24小时。将一级种子罐菌种转接入装有700L种子培养基(PH7.0)的1000L容积的二级种子培养罐中，保持罐温28.5℃、罐压0.07KPa，搅拌速率100rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间28小时。将二级种子罐菌种转接入装有30000L培养基的50000L三级发酵罐中，保持罐温28.5℃、罐压0.07KPa，搅拌速率110rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间85小时。
本实施例中斜面培养基组成是(g/100ml)葡萄糖4.8，酵母浸膏1.5，琼脂1.5，加水定容100ml。
本实施例中摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养、三级发酵培养基为培养基(I)。
在发酵开始后，收集样品，在105℃干燥5h以测量藻细胞密度。当藻细胞的密度达到5g/L时，在与上述罐发酵相同的培养条件下，通过以0.1h/r的稀释速率连续补充培养基(II)，从而开始连续培养3天。连续培养开始后，在培养基中未发现一个有复鞭毛的藻细胞。
从发酵器中流出的培养基在105℃干燥5h以找出产率为28.0g/L的干燥细胞和一个油脂生产量为7.84g/L的干燥藻细胞。
将从发酵器中流出的发酵液经膜过滤浓缩后，低温干燥，干燥藻细胞用氯仿萃取，得到DHA毛油，DHA毛油经脱胶、脱酸、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。DHA油脂经甲基酯化，用气相色谱分析确定其含量。
经气相层析确定的藻细胞中脂肪酸组成如下。
脂肪酸名称 脂肪酸含量C10:0 0.4673C12:0 0.4265C14:0 14.0800C16:0 21.6900C16:1 0.1690C18:0 0.9761C18:1 0.6521C18:2 0.3716C18:4 0.1889
C20:4 4.1000C20:5 0.4185C22:5 15.68C22:6 40.78实施例5培养基配方(g/100ml)(I)氯化钠1.8g 氯化钾0.05g 氯化钙0.035g硫酸镁0.55g 磷酸二氢钾0.32g 谷氨酸钠3.8g酵母浸膏3.5g 葡萄糖7.0g 维生素B10.006g维生素B60.008g加水至100ml。
培养基(II)与实施例1相同。
将名称为Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky的细胞接种在无菌斜面培养基中，培养温度为28℃，培养时间50h。
将新鲜的斜面菌种接入装有100ml培养基的500ml三角瓶中，28℃摇床培养48小时，摇床转速140r/min。然后将所得摇瓶菌种100ml接种到5个三角摇瓶(1000ml)中，每个含200ml培养基(PH6.8)进行扩大培养，28℃摇床培养48小时，摇床转速140r/min。对以上每个摇瓶做无菌检测，将反应良好的摇瓶种子接入一级种子罐。
将三角摇瓶扩大的菌种1000ml转接入装有60L种子培养基的100L一级种子罐中，保持罐温28℃，罐压0.07KPa，搅拌速率120rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间48小时。将一级种子罐菌种转接入装有700L种子培养基(PH7.0)的1000L容积的二级种子培养罐中，保持罐温28℃、罐压0.07KPa，搅拌速率120rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间48小时。将二级种子罐菌种转接入装有30000L培养基的50000L三级发酵罐中，保持罐温28℃、罐压0.07KPa，搅拌速率120rpm/min，通气量1∶0.5v/v.m，发酵时间80小时。
本实施例中斜面培养基组成是(g/100ml)葡萄糖5.5，酵母浸膏2.0，琼脂1.5，加水定容至所需体积，PH值为自然。
本实施例中摇瓶培养、摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养、三级发酵培养基为培养基(I)。
在发酵开始后，收集样品，在105℃干燥5h以测量藻细胞密度。当藻细胞的密度达到5g/L时，在与上述罐发酵相同的培养条件下，通过以0.1h/r的稀释速率连续补充培养基(II)，从而开始连续培养3天。连续培养开始后，在培养基中未发现一个有复鞭毛的藻细胞。
从发酵器中流出的培养基在105℃干燥5h以找出产率为27.0g/L的干燥细胞和一个油脂生产量为7.02g/L的干燥藻细胞。
将从发酵器中流出的发酵液经膜过滤浓缩后，低温干燥，干燥藻细胞用正己烷萃取，萃取时用α-生育酚作为抗氧化剂在氮气中进行萃取，得到DHA毛油，DHA毛油经脱胶、脱酸、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。DHA油脂经甲基酯化，用气相色谱分析确定其含量。
经气相层析确定的藻细胞中脂肪酸组成如下。
脂肪酸名称 脂肪酸含量C10:0 0.3800C12:0 0.1240C14:0 11.1174C16:0 22.1200C16:1 0.1625C18:0 0.9156C18:1 0.3485C18:2 0.3927C18:4 0.3892C20:4 5.2475C20:5 0.4326C22:5 18.2300
C22:6 40.1400各种培养基的对比试验数据如下表1培养基配方设计表
表2发酵液检查结果表
通过表1、表2可以看出配方1优于其他配方。从而可以得出以下结论同样发酵条件下，在培养基中添加维生素B1和维生素B6，可提高发酵液中生物量，同时提高藻细胞的含油量。因此，本发明优选配方1的培养基。
权利要求
1.一种用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，它是以寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]为出发菌株，在液体培养基中连续培养寇氏隐甲藻得到海藻细胞，然后从海藻细胞中提取二十二碳六烯酸油脂。
2.根据权利要求
1所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所用的培养基为每100ml液体培养基中含有氯化钠0.5-2.0g 硫酸镁0.2-0.8g氯化钙0.01-0.05g 葡萄糖1.0-10g氯化钾0.01-0.08g 磷酸二氢钾0.1-0.5g谷氨酸钠0.5-5.0g 酵母膏0.5-5.0g维生素B10.001-0.01g 维生素B60.001-0.01g。
3.根据权利要求
1或2所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻细胞油脂中二十二碳六烯酸含量在30％-50％。
4.根据权利要求
1或2所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中三级发酵时间为60h-120h，获得的海藻细胞为20-40g/L。
5.根据权利要求
1或2所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻细胞含油量为20-50％。
6.根据权利要求
1或2所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中它采用斜面菌种进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养、一级种子培养、二级种子培养和三级发酵培养，得到海藻细胞。
7.根据权利要求
6所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中海藻细胞的生产方法具体步骤如下(1)取出斜面菌种转接入装有摇瓶培养基的摇瓶种，25-35℃培养，培养24-72小时。(2)将步骤1中的摇瓶菌种转接入装有摇瓶扩大培养基的摇瓶中进行扩大培养，25-35℃培养，转速120-180rpm/min，培养30-60小时。(3)将步骤2中的摇瓶菌种转接入一个装有一级种子培养基的发酵罐中，接种量为0.1-1％，保持罐温25-35℃，罐压0.05-0.09kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量10.3-0.5v/v.m，发酵24-48小时。(4)将一级种子罐中的菌种转接入一个装有二级种子培养基的发酵罐中，接种量为1-10％，保持罐温25-35℃，罐压0.05-0.09kPa，搅拌速度80-150rpm/min，通气量10.3-0.5v/v.m，发酵24-48小时。(5)将二级种子罐种的菌种转接入一个装有三级发酵培养基的发酵罐中，接种量为1-10％，保持罐温25-35℃，罐压0.05-0.09kPa，搅拌速率80-150rpm/min，通气量10.3-0.5v/v.m，发酵60-120小时。在还原糖含量降低到0.5％以下，氮含量降低至0.02％以下时放罐。放罐后液体使用膜过滤方法，回收海藻细胞。
8.根据权利要求
1所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的提取方法是将海藻细胞经低温干燥，然后将干燥菌丝体用有机溶剂浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，将二十二碳六烯酸毛油经碱炼、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。
9.根据权利要求
1所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的提取方法是在浓缩发酵液中加入破壁剂，其用量为浓缩发酵液重量的0.1-0.6％，然后用有机溶剂浸提18h-28h后，得到二十二碳六烯酸毛油，将二十二碳六烯酸毛油经脱胶、脱酸、脱色、脱臭后得到二十二碳六烯酸精炼油。
10.根据权利要求
1所述的用寇氏隐甲藻发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其中所述的有机溶剂为正己烷或氯仿。
专利摘要
本发明涉及一种用海洋微藻中的寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]发酵生产二十二碳六烯酸油脂的方法。它是以寇氏隐甲藻[Crypthecodinium cohnii(Seligo)Javornicky]为出发菌株，在液体培养基中连续培养寇氏隐甲藻得到海藻细胞，然后从海藻细胞中提取二十二碳六烯酸油脂。本发明选用合适的海洋微藻作为菌种，在培养基中加入了维生素，通过筛选合适的工艺方法，大大提高了二十二碳六烯酸油脂的产量，海藻细胞中二十二碳六烯酸含量在30％－50％，获得的海藻细胞为20－40g/L，海藻细胞含油量为20－50％。以上各项指标明显高于现有技术。
文档编号C12R1/89GKCN1986822SQ200610125476
公开日2007年6月27日 申请日期2006年12月15日
发明者蔡立刚, 袁谦, 简晓红 申请人:湖北友芝友生物科技有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan