转化寇氏隐甲藻的方法

转化寇氏隐甲藻的方法
【专利摘要】本发明涉及转化寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii)的方法，该方法包括以下步骤：预培养寇氏隐甲藻；预培养农杆菌；在渗透压调节剂的存在下悬浮寇氏隐甲藻及农杆菌，然后将完整的寇氏隐甲藻细胞与农杆菌共培养；和获得农杆菌转化的寇氏隐甲藻。
【专利说明】转化寇氏隐甲藻的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域。具体涉及用农杆菌转化寇氏隐甲藻的方法。

【背景技术】
[0002] 寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii)按照 NCBI Taxonomy 数据库分类， 属于 Eukaryota 界 Alveolata(囊泡虫类）Dinophyceae (甲藻门）Gonya μ Iacales 目 Crypthecodiniaceae科Crypthecodinium属。该藻是一种比较原始的真核生物，具有核膜 不连续、染色体始终高度凝集、细胞壁厚等特性[刘晓玲等，寇氏隐甲藻染色体的提取及其 独特的超微结构，实验生物学报，2000, 33 (2) :189-1]。
[0003] 寇氏隐甲藻有较好的二十二碳六烯酸（DHA)合成能力。DHA占细胞脂质的30% 以上[Wynn 等· Production of single cell oils by dinoflagellates, in Single Cell 0il(ZVi Cohen&Colin Ratledge)pp.86_98，A0CS Press，Urbana]，尤其是产物脂质组分少。 如ATCC30772菌株的生物量可达17. 2g/L，DHA占总脂肪酸组成的59%，且脂肪酸组成简单 [Colin等· Production of docosahexaenoic acid by Crypthecodinium cohnii grown in a pH-auxostat cμ lture with acetic acid as principal carbon source. 2001,Lipid, 36(11) :1241-1246]。隐甲藻的脂肪酸一般含有DHA及棕榈酸、油酸、硬脂酸等，少见鱼油或 裂壶藻油中的EPA、DPA等不适合婴幼儿服用或不确定功能的组分，因此一度成为唯一适用 婴幼儿配方食品的DHA藻油。
[0004] 目前对寇氏隐甲藻生产性能的优化主要集中在发酵改良上，典型如Colin等人的 US7674609、Martek公司的US7678931，以及商业化生产产品DHASC0。De Swaaf的文献报 道实现了 l〇9g/L 生物量 19g/L DHA 产量的流加发酵[De Swaaf ME. High-cell-density fed-batch cultivation of the docosahexaenoic-acidproducing marine alga Crypthecodinium cohnii on ethanol. Applied Microbiology and Biotechnology, 2003,61(1) :40-43]。对隐甲藻的培养，一般使用较高盐浓度，常见25g/L的海盐，也有见 使用 25g/L NaCl 的[da Silva TL. Effect of n-dodecane on Crypthecodinium cohnii fermentations and DHA production. J Ind Microbiol Biotechnol, DOI10. 1007/ S10295-006-0081-8]，ATCC建议的隐甲藻活化培养基ATCC460也要求使用23. 48g/L的 NaCl并含有其他盐分。其他因素如温度、pH、碳源、氮源对寇氏隐甲藻合成DHA的影响也有 报道[王菊芳等.隐甲藻悬浮培养生产DHA.无锡轻工业大学学报，2002,21(4) :344-346]。 个别专利提及了对隐甲藻进行改造，如通过离子束进行诱变（CN201110138270. 5)。
[0005] 隐甲藻分子生物学方向的研究还较少，1998年Lohuis Michael R. ten和 MillerDavid J.使用金刚砂（silicon carbide)对隐甲藻完整细胞进行转化后（效率 每 IO7 个细胞得到 5-24 个转化子）[Lohuis Michael R. ten and Miller David J. 1998. Genetic transformation of dinoflagellates(Amphidinium and Symbiodinium)： expression of GUS in microalgae using heterologous promoter constructs. The Plant Journal，13(3) :427-435]后，未见对寇氏隐甲藻进行遗传转化的公开报道；也 未见对隐甲藻DHA合成的机理进行探索的尝试，无法解释其具有优良脂肪酸组成的原 因。目前仅在 BASF 公司专利《Method For the Production of Myltiple-Unsaturated Fatty Acids in Transgenic Organisms》提到两个寇氏隐甲藻Δ-5延长酶基因序列（如 US20080155705中SEQ47/49)，但仅表示该基因可用于构建产油的转基因生物中，未涉及隐 甲藻的基因工程研究。目前对隐甲藻的分子生物学改造、研究公开文献资料很少。
[0006] 寇氏隐甲藻的DHA产量较高，油脂组分非常简单，是很好的DHA生产菌株。但目前 尚无对隐甲藻进行基因工程改造的报道。


【发明内容】

[0007] 发明人出乎意料地发现，在农杆菌与寇氏隐甲藻悬浮时，如果加入调节渗透压的 物质，可以实现农杆菌对寇氏隐甲藻完整细胞的成功转化，达到比现有技术高的转化效率。
[0008] 具体地，本发明涉及转化寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii)的方法，该方法 包括以下步骤：在渗透压调节剂的存在下悬浮寇氏隐甲藻及农杆菌，然后将完整的寇氏隐 甲藻细胞与农杆菌共培养；和获得农杆菌转化的寇氏隐甲藻。所述渗透压调节剂是添加在 IMN中，所述IMN使用农杆菌转化常用的诱导培养基（Induction medium,简称IM),通过选 自钠盐、镁盐、钾盐、钙盐、有机物的渗透压调节剂调节頂的渗透压来配制。具体地，所述渗 透压调节剂可以是钠盐。具体地，所述渗透压调节剂可以是氯化钠、硫酸钠、氯化钾、氯化 钙、葡萄糖或山梨醇。上述渗透压调节剂的浓度可以是100mM-700mM，优选是100mM-650mM， 更优选是200mM-400mM。在本发明的方法中，可以预培养寇氏隐甲藻到对数初期将寇氏隐甲 藻细胞与农杆菌共培养。在本发明的方法中，可以将寇氏隐甲藻细胞与农杆菌共培养。具 体地，在本发明中使用的寇氏隐甲藻可以是ATCC30772和ATCC40750。
[0009] 在寇氏隐甲藻的预培养过程中，可以使用常规的CA培养基。其成分可以是葡萄糖 9-3(^/1，酵母粉1.5-7.5 8/1，50-75%海水（或人造海盐配制），？册.0-7.0。其中还可以额 外添加硫酸钠或氯化钠，以调节其渗透压。
[0010] 在寇氏隐甲藻细胞与农杆菌共培养中，使用常规的頂培养基效果不佳。发明人出 乎意料地发现，在IM中添加上文所述的调节渗透压的物质，可以实现良好的转化效果。
[0011] 农杆菌是一种本领域技术人员常用的转化工具。如本领域工作者所熟知的，决 定农杆菌毒性的基因在野生型农杆菌中以质粒形式存在，根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)中称为Ti质粒，发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)中称为Ri质粒。 这两种质粒均含有毒力基因 Vir (Virulence)区和转移DNA (transfer DNA，T-DNA)区。Vir 区的基因表达出来后，将T-DNA边界序列之间的区域转移并整合到宿主基因组中。Vir区 包含许多基因，有些基因的表达需要酚类化合物的诱导，通常植物的受伤部位或天然地分 泌这类化合物，实验室条件下常用如乙酰丁香酮来人为促使Vir基因的表达。诱导培养基 (IM)中适当的pH、糖类浓度、磷酸浓度，以及诱导时的温度条件会促进Vir基因受酚类物质 诱导表达的效果[邹智.农杆菌vir基因诱导因子研究进展.中国生物工程杂志，2011， 31 (7) :126-132]，从而提高农杆菌的转化效率。通常农杆菌转化，需要宿主细胞适当地暴露 或创伤，如使植物组织形成创伤、真核生物先制备成原生质体等。本发明使用经渗透压调节 剂调整后的頂来悬浮预培养的细胞，可以使农杆菌高效地转化完整的寇氏隐甲藻，无需麻 烦的原生质体制备过程。本发明的关键在于预培养细胞悬浮液中渗透压调节剂的加入，而 所举例的頂配方可经本领域技术人员适当的修改。同样的，本发明頂N的盐及糖或醇的浓 度条件，主要作用对象为寇氏隐甲藻，因此本发明的应用不限于本发明实施例所列农杆菌， 常见的根瘤农杆菌和发根农杆菌工具菌株，包括但不限于EHA105、LBA4404、AGLO等都可以 用于本发明。本发明实施例使用双元载体系统模式，通过K7载体构建重组农杆菌，但本发 明的重点不是重组农杆菌的构建方式，因此本发明的应用包括但不限于双元载体系统、一 元载体系统。外源基因转入农杆菌中的方式以及外源基因转入农杆菌借助的载体并不是本 发明的关键，本领域技术人员可以根据常识进行选择。本发明实施例为了鉴定阳性转化子， 特别在农杆菌中用k7载体导入了 zeocin抗性基因和⑶S基因作为标记基因，这些基因并 不是转化方法所必须的，因为它们并不决定转化的效率，只是筛选阳性转化子所需要的。本 领域研究者可以简单地通过成熟的技术导入其它元件，包括但不限于药物抗性基因、酶基 因、基因表达调控元件、基因敲除元件、基因定点突变元件等；包括含T-DNA边界序列的载 体为出发载体，不限于pCAMBIA系列载体。

【专利附图】

【附图说明】
[0012] 图1 :构建重组农杆菌用K7质粒示意图。载体上含在重组寇氏隐甲藻内起作用的 筛选标记zeocin抗性基因，含有在重组农杆菌内起作用的筛选标记卡那霉素抗性基因，含 有CaMV35S启动子以及EcoR I-Hind III等限制性内切酶位点组成的多克隆位点区（MCS)、 含有左边界T-DNA重复及右边界T-DNA重复两个T-DNA边界区域。农杆菌将左边界T-DNA 重复、CaMV35S PolyA、zeocin、CaMV35S 启动子、MCS、CaMV35S 启动子、⑶S、Nos PolyA、右 边界T-DNA重复这一段转到寇氏隐甲藻中，并整合到基因组上。
[0013] 图2 :CA_1体系转化寇氏隐甲藻所获的抗zeocin菌落PCR检验的结果。1泳道样 品为重组农杆菌菌落为模板的PCR阳性对照，2泳道为构建重组农杆菌所用K7质粒为模板 的PCR阳性对照，4-11泳道为随机挑选的抗zeocin重组寇氏隐甲藻菌落为模板的PCR扩增 产品。虚线框表明重组寇氏隐甲藻菌落得到了与阳性对照一致的PCR检测条带。
[0014] 图3 :CA-2体系所获抗性菌落PCR检验结果。1、2泳道为重组农杆菌、K7质粒为模 板进行的PCR阳性对照。3-6泳道为四个随机挑选的zeocin抗性寇氏隐甲藻菌落PCR检测 结果。虚线框表明重组隐甲藻菌落获得了与阳性对照一致的PCR检测条带，M为Takara公 司DL5000核酸标记物。
[0015] 图4 :优化实验所得抗性菌落PCR检测的结果。M泳道为Takara公司Ikb DNA ladder，1-12为随机挑选的zeocin抗性寇氏隐甲藻菌落。8、9、11泳道为未得到特异性的 PCR产物，为PCR检测的阴性样。
[0016] 图5 :寇氏隐甲藻培养终点阶段对农杆菌介导的转化效率的影响。结果显示，培养 寇氏隐甲藻到对数初期比对数末期有更好的转化效果。
[0017] 图6 :MN溶液中氯化钠浓度对转化效率的影响。51mM为正常頂诱导液中Na离 子的浓度，200-700mM为任选的几种Na离子浓度条件。
[0018] 图7A:相同浓度下（350mM)，使用有机溶剂糖类（葡萄糖为代表）、醇类（山梨醇 为代表）配置的頂N溶液处理寇氏隐甲藻后，农杆菌转化的效率与氯化钠的对比。
[0019] 图7B :350mM阳离子浓度、不同无机盐配制的MN溶液处理寇氏隐甲藻后，农杆菌 转化转化效率图。
[0020] 图8 :寇氏隐甲藻ATCC40750与寇氏隐甲藻ATCC30772在本发明条件下转化效率 的对比。

【具体实施方式】
[0021] 如无具体说明，本发明的各种原料均可以通过市售得到；或根据本领域的常规方 法制备得到。除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟 练人员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本 发明方法中。
[0022] 本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
[0023] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标 准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建 议的条件进行。除非另外说明，否则所有的份数为重量份，所有的百分比为重量百分比。
[0024] 除非另有定义或说明，本文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术熟练人 员所熟悉的意义相同。此外任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明 方法中。
[0025] 如本文所用，"含有"、"具有"或"包括"包括了"包含"、"主要由......构成"、"基 本上由......构成"、和"由......构成";"主要由......构成"、"基本上由......构成" 和"由......构成"属于"含有"、"具有"或"包括"的下位概念。
[0026] 可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特 征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相 似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般 性例子。
[0027] 可使用本发明方法转化的寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii)包括但不限 于：ATCC40750，TEX L1649，ATCC30556，ATCC50051，UTEX L1649，RJH，ATCC30772，CCMP316， ATCC50297, ATCC30556 等。
[0028] 可用于本发明方法的农杆菌可以是本领域已知的各种用于基因转化的农杆菌，包 括但不限于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105、EHA101、LBA4404、AGL-0、 AGL-1、NT1、C58-Z707、GV3101: :pMP90 等。
[0029] 本发明方法中，使用农杆菌转化完整的寇氏隐甲藻细胞。"完整的寇氏隐甲藻细 胞"指细胞结构完整，包括细胞壁、细胞膜等寇氏隐甲藻细胞应有的结构。更具体而言，完整 的寇氏隐甲藻细胞不是寇氏隐甲藻原生质体，后者经处理而不含有细胞壁。
[0030] 本发明中，农杆菌含有感兴趣的目标基因。所述目标基因可以是任意脱氧核糖核 酸。所述目标基因相对于待转化的寇氏隐甲藻而言可以是外源的，即该寇氏隐甲藻自身不 存在的；也可以是内源的，即符合寇氏隐甲藻本身遗传信息的核酸。所述目标基因包括但不 限于具有生物学活性的核酸，如蛋白编码基因、用于调控基因转录的核酸等；以及不具备生 物活性的核酸，如应用于基因整合、敲除的核酸片段。在某些实施例中，目标基因编码感兴 趣的酶和各种功能蛋白。
[0031 ] 在本发明中，共培养时使用的培养基可以包括但不限于农杆菌转化诱导培养基。
[0032] 可采用常规的条件，例如培养时间、接种量、温度等，来培养寇氏隐甲藻，优选地， 将寇氏隐甲藻预培养至对数初期。
[0033] 可采用常规的条件培养农杆菌至对数期。将外源基因转入农杆菌可使用本领域公 知的方法，例如，包括但不限于热激法、电击转化法等。
[0034] 可使用含有渗透压调节剂的培养基来分别洗涤、重悬预培养的寇氏隐甲藻细胞和 农杆菌。具体而言，可使用含有渗透压调节剂的培养基洗涤，然后用含有渗透压调节剂的培 养基重悬。重悬后的体积一般取决于用来收集的菌液量，一般约是原菌液体积的1/20。可使 用含有渗透压调节剂的培养基洗涤，然后重悬到〇. 8-1. 2 X IOltl个/ml (重悬到I. 5-2. 5ml)。 通常取等体积的两种悬液混匀。但也可取不同体积比的两种悬液混匀。
[0035] 在本发明中，渗透压调节剂优选为钠盐、镁盐、钾盐、钙盐或糖、醇类有机物中的一 种或多种，更优选的所述渗透压调节剂选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、葡萄 糖和山梨醇。培养基中渗透压调节剂的浓度为100mM-700mM，优选的，所述渗透压调节剂的 浓度是 100mM-650mM，更优选是 200-400mM。
[0036] 在本发明的一个具体实施例中，渗透压调节剂的浓度为：100mM，110mM，120mM， 130mM,140mM,150mM,160mM,170mM,180mM,190mM,200mM,210mM,220mM,230mM,240mM, 250mM,260mM,270mM,280mM,290mM,300mM,310mM,320mM,330mM,340mM,350mM,360mM, 370mM,380mM,390mM,400mM,410mM,420mM,430mM,440mM,450mM,460mM,470mM,480mM, 490mM,500mM,510mM,520mM,530mM,540mM,550mM,560mM,570mM,580mM,590mM,600mM, 610mM，620mM，630mM，640mM，650mM，660mM，670mM，680mM，690mM，或 700mM〇
[0037] 在本发明中，含有渗透压调节剂的培养基使用农杆菌诱导培养基，由MES(2-吗啉 乙磺酸）、缓冲体系（一般为磷酸盐）、碳源、氮源、盐组成，一般控制在合适的PH条件下（如 pH5. 3)以提高农杆菌转化的效果。
[0038] 在一个具体实施例中，洗涤、重悬时使用的培养基为包含有100mM-700mM渗透压 调节剂的頂培养基。
[0039] 可采用常规的方式混匀寇氏隐甲藻悬液和农杆菌悬液，并取适量混合菌液（例如 10-200 μ 1，如50 μ 1)涂布到培养平板上。可采用常规平板制备方法来制备所述培养平板。 在本发明中，所述培养平板可以包括但不限于已公开的支持隐甲藻生长的培养基，如碳源 可选自葡萄糖、半乳糖等糖类，短链酸如乙酸、丙酸、乳酸或其盐，醇类如乙醇、甘油，糖浆如 角豆浆糖浆；氮源可选自使用酵母粉、蛋白胨、肉提取物、谷氨酸或其盐、硝酸钾、氯化铵、玉 米浆等；海盐或海水提供渗透压。
[0040] 应理解，虽然上述对培养基的各成分和含量进行了描述，但本领域技术人员可根 据实际需要对其成分和含量做出适当改动。下文将以具体实施例的方式描述本发明。实施 例中所用的试剂、反应条件等，除非另有说明，否则均为本领域常规的试剂和反应条件。
[0041] 实施例中使用培养基和溶液配方如下：
[0042] YEB培养基：牛肉浸膏5g/L，酵母粉lg/L，蛋白胨5g/L，ρΗ7· 0-7. 5。
[0043] CA培养基：葡萄糖9g/L，酵母粉I. 5g/L，海盐25g/L，ρΗ6· 5
[0044] CS培养基：除碳源从葡萄糖换成乙酸钠外，CS其余组分及含量同CA培养基
[0045] 頂培养基和頂液：7.8g/L2-吗啉乙磺酸，葡萄糖2g/L，甘油0.6g/L，氯化钠 0· 15g/L，硫酸铵0· 5g/L，硫酸亚铁0· 0025g/L，氯化钙0· 08g/L，硫酸镁0· 25g/L，磷酸氢二 钾2. 28g/L，磷酸二氢钾I. 36g/L，pH5. 3。IM在农杆菌及隐甲藻共培养时，充当培养基的作 用，因此称之为培养基；IM在悬浮细胞及洗脱细胞时，并未支持细胞生长，仅是起到一种溶 液的作用，因此称作頂液。两者成分一致。
[0046] 頂固体培养基：頂中补充L 8%的琼脂粉制得。
[0047] 实施例一
[0048] 由出发农杆菌菌株，即根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens) EHA105 (所述菌 株购自普如汀生物技术（北京）有限公司）构建所需重组农杆菌。EHA105菌株为本领域研 究者熟知的常用工具菌株。本实验中为了鉴定转化成功与否，在其中导入药物抗性基因，从 而便于检测。
[0049] 具体步骤如下：① PCAMBIA1301载体中潮霉素抗性基因两端均有XhoI限制性内切 酶识别位点，因此通过XhoI内切酶（购自宝生物公司）酶切pCAMBIA1301 (购自Cambia公 司），使载体中的潮霉素抗性基因被完全切出；②使用PGAPZ a A载体（购自普如汀生物技 术（北京）有限公司）为模板，使用引物ZEOU(AAAACTCGAGATGGCCAAGTTGACCAGTGC)及ZEO D(AAAACTCGAGTCAGTCCTGCTCCTCGGCCA)PCR 扩增 zeocin 抗性基因片段，扩增程序为 95°C 5 分钟预变性、32个循环的95°C 50s、55°C 50s、72°C 30s扩增、最后在72°C延伸10分钟，得 到两端含有XhoI酶切位点的zeocin抗性基因片段，并通过Cycle Pure Kit (Omega公司， D6492-01)试剂盒回收纯化后，使用XhoI限制性内切酶酶切处理；③酶切的pCAMBIA1301 载体及PCR产物分别通过1%琼脂糖凝胶电泳分离，切出pCAMBIA1301载体去除了潮霉素 抗性基因片段剩余部分的片段以及PCR产物酶切物的条带后，通过Gel Extraction Kit凝 胶回收试剂盒（Omega公司，D2500-02)回收纯化，通过T4DNA连接酶（Ferments，EL0011) 将两个纯化后片段进行连接；④连接产物通过42°C热激法转入CaCl 2法制备的DH5 α感受 态细胞（购自Takara公司）中，预培养后涂布于卡那抗性LB平板上筛选；⑤抗性克隆经过 菌落PCR及质粒测序筛选，得到zeocin抗性基因取代了 pCAMBIA1301载体中潮霉素抗性基 因的新载体，命名为K7,载体示意图见图1所示；⑥按照[李明刚，植物基因操作原理与技 术[M]，天津科学技术出版社，2000, ppl81]的方法制备感受态农杆菌细胞，具体如下：使用 YEB培养液，28°C振荡摇床上培养农杆菌EHA105菌落过夜，然后按体积比1 %转接到50ml 新的YEB培养液中，28°C振荡培养到0D600 = 0. 5 ;冰浴菌液30分钟后，5000rpm离心5分 钟收集细胞，悬浮菌体沉淀到IOml预冷的0. 5M的无菌NaCl溶液中，再次5000rpm离心5 分钟收集细胞，悬浮菌体沉淀于20ml预冷的0. 02M无菌CaCl2溶液中，然后按照200 μ 1/支 分装，液氮速冻后保存到超低温冰箱；⑦取Κ7质粒溶液20 μ 1 (0. 5-1. 0 μ g)，加入到一支冰 浴融化的200 μ 1农杆菌感受态细胞液中，混匀，冰浴30分钟后液氮速冻5分钟，然后立即 转入37°C水浴中水浴5分钟，最后加入Iml YEB培养液，28°C振荡培养2h后，涂布于卡那霉 素抗性的LB平板上，28°C培养性培养至明显的菌落出现。所得菌落即为重组农杆菌。
[0050] 接种通过以上步骤获得的重组农杆菌单菌落到5ml YEB培养液中，添加卡那霉素 和链霉素，28°C培养过夜；按0. 1 %比例转接到50ml YEB培养液中，添加卡那霉素和链霉 素，28°C 200rpm摇床培养过夜到OD = 0. 4-0. 8,离心收集菌体并用頂液重悬到2ml。
[0051] 从甘油管中接种寇氏隐甲藻ATCC30772(购自广东省微生物菌种保藏中心）到CA 培养基中。211：摇床150印111振荡培养1周，得到种子液。然后10%比例接种到04、05培 养基中，分别于21°C、28°C振荡培养3天，检测光密度（OD)并镜检菌体活力。
[0052] 培养相同时间，发现菌体量CA28r= CA2rc> CS2rc> CS2rc,其中，CA28r表示在CA培 养基中于28°C培养，类似的，CV e表示在CA培养基中于21°C培养，CVe、CS28d1ij表示在 CS培养基中于21°C、28°C培养。因此本发明预培养隐甲藻阶段采用CA培养基，以便很方便 观察隐甲藻是否生长正常；筛选培养基使用CS，以形成更清晰的菌落。
[0053] 按10%比例，从种子液中转接菌体到不同渗透压的CA-I和CA-2培养基中进行预 培养。这里所用CA-I和CA-2培养基中，葡萄糖、酵母粉、海盐及pH条件同上述的CA培养 基，但通过硫酸钠调节培养基中的盐分含量。CA-I和CA-2两种培养基分别为额外添加了 0 和6. 6g/L的无水硫酸钠，使得Na+的浓度分别为240和333mM，以设计不同的预培养渗透 压。21°C摇床150rpm振荡培养至ODL 0, 3000rpm离心10分钟收集寇氏隐甲藻菌体并使用 IM液重悬到2ml。
[0054] 上述农杆菌及隐甲藻菌液均需现用现制。分别取新鲜Iml寇氏隐甲藻和Iml重组 农杆菌，混匀，50 μ 1/板涂布到M固体培养基上，28°C培养箱培养16h。使用常见的玻璃三 角涂布棒，在2ml IM润洗作用下，刮洗共培养平板上的菌苔得到菌液，吸出菌液并使用IM 液补充到2ml，混勻后取50 μ 1涂布到CS选择平板（含50 μ g/ml zeocin)，超净台上经无 菌风吹干平板表面后置28°C培养箱培养。结果发现培养1周都未出现抗性菌落。重复上述 农杆菌、隐甲藻预培养、混匀共培养及筛选实验并检查，发现隐甲藻的细胞壁似乎较薄，并 不像文献中"厚"的描述，且对渗透压敏感。显微镜检查頂液处理的隐甲藻，发现有少量的 细胞在视野下发生崩解，因此常规頂液的渗透压不适用于悬浮隐甲藻。
[0055] 重复上述农杆菌、隐甲藻的预培养以及混匀共培养、筛选抗性菌落操作，但将頂 液更改为頂N液（7. 8g/L2-吗啉乙磺酸，葡萄糖2g/L，甘油0. 6g/L，硫酸铵0. 5g/L，硫酸亚 铁0· 0025g/L，氯化钙0· 08g/L，硫酸镁0· 25g/L，氯化钠41g/L，磷酸氢二钾2. 28g/L，磷酸 二氢钾1.36g/L，pH5. 3)作为悬浮隐甲藻、农杆菌菌体以及刮洗共培养平板的溶液（共培 养时依然涂布到IM固体培养基平板，该固体培养基未做改动），共培养的时间为20h，所述 MN溶液中NaCl的摩尔浓度为0. 7M。转化结果见表一所示，其中转化效率=抗性菌落数 量XPCR检测阳性率+每平板上涂布的隐甲藻数量。
[0056] 表一农杆菌转化隐甲藻结果
[0057]

【权利要求】
1. 转化寇氏隐甲藻（Crypthecodinium cohnii)的方法，其特征在于，所述方法包括以 下步骤： 在渗透压调节剂的存在下悬浮寇氏隐甲藻及农杆菌； 将完整的寇氏隐甲藻细胞与重组农杆菌共培养；和 获得农杆菌转化的寇氏隐甲藻。
2. -种制备转基因寇氏隐甲藻（Crypthecodinium)的方法，其特征在于，所述方法包 括在渗透压调节剂的存在下，使用含有目标基因的重组农杆菌转化完整的寇氏隐甲藻。
3. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述渗透压调节剂选自钠盐、镁盐、钾盐、 钙盐或糖、醇类有机物，优选的，所述渗透压调节剂选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸镁、氯 化钙、葡萄糖和山梨醇。
4. 权利要求3的方法，其特征在于，所述渗透压调节剂的浓度是100mM-700mM，优选的， 所述渗透压调节剂的浓度是200mM-400mM。
5. 权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述寇氏隐甲藻和/或所述农杆菌经预培 养处理，优选的，所述寇氏隐甲藻和所述农杆菌预培养至对数期，更优选的，所述寇氏隐甲 藻为预培养到对数初期的寇氏隐甲藻。
6. 权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，在寇氏隐甲藻细胞与农杆菌共培 养时添加乙酰丁香酮。
7. 权利要求1-5的任一项所述的方法，其特征在于，所述寇氏隐甲藻选自ATCC30772、 ATCC40750、TEX L1649、ATCC30556、ATCC50051、UTEX L1649、RJH、CCMP316、ATCC50297、 ATCC30556;所述农杆菌选自：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)EHA105、EHA101、 LBA4404、AGL-0、AGL-1、NT1、C58-Z707 和 GV3101: :pMP90。
8. 权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括获得农杆菌转化 的寇氏隐甲藻的步骤。
9. 一种用于寇氏隐甲藻转化的培养基，其特征在于，所述培养基中包含渗透压调节剂， 优选的，所述渗透压调节剂选自钠盐、镁盐、钾盐、钙盐或糖、醇类有机物，更优选的渗透压 调节剂选自氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、葡萄糖和山梨醇。
10. 权利要求9所述的培养基，其特征在于，所述渗透压调节剂的浓度是100mM-700mM， 优选的，所述渗透压调节剂的浓度是200mM-400mM。
【文档编号】C12R1/89GK104293824SQ201310302810
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月15日 优先权日:2013年7月15日
【发明者】戴小军, 许骏, 蔡南海, 姜翠红 申请人:丰益(上海)生物技术研发中心有限公司