Dhplc检测并定量线粒体dna1555a>g的异质性突变的制作方法
【专利摘要】本发明公开了DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变，包括提取样本、引物设计、PCR反应及DHPLC检测等步骤，其中目的片段长度为339bp，DHPLC检测柱温为59.5℃。本发明不仅能检测出突变型和野生型个体，还能准确检测到低水平或高水平的异质性突变个体，并能精确定量其突变负荷，从而可以较好地解释临床表型多样化的原因，有助于进一步研究线粒体耳聋的分子遗传学机制，本发明的最低检测水平可达到5%，灵敏度较高。
【专利说明】DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变
【技术领域】
[0001]本发明涉及DNA检测领域，尤其涉及检测线粒体DNA 1555AG突变及其定量的方法。
【背景技术】
[0002]人类线粒体DNA(mitochondrial DNA, mt DNA)是唯一分布于细胞核外的人类遗传物质，又被称为人类的第25号染色体，呈双链环状。1981年Anderson完成了人类整个线粒体DNA 16569bp的测序工作，并将线粒体DNA分成编码区和控制区。线粒体基因组的遗传特点是母系遗传与异质性(heteroplasmy)。即在同一个体中会出现两种或两种以上类型的mtDNA，突变型线粒体DNA占全体线粒体DNA的百分比称为突变负荷，异质性线粒体DNA的突变负荷可以 介于0到100%之间，线粒体DNA疾病的发生及其临床表型往往取决于突变负荷的高低，当线粒体DNA突变体的突变负荷较低时，共存的野生型线粒体DNA会发挥保护和补偿作用；然而，当突变水平超过一定的阈值，野生型线粒体DNA不能补偿同时存在的突变DNA所产生的缺陷，不足以维持正常功能时，组织或器官就会出现功能异常。
[0003]1993 年，Prezant TR 等首次发现线粒体 DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) 12SrRNA基因的1555A>G突变与氨基糖甙类药物性耳聋有关，且研究报道大都为同质性突变。由于线粒体DNA 1555A>G突变致聋的不同家系或同一家系的不同成员在临床表型及外显率方面显示出较大差异，主要表现在氨基糖甙类药物致聋影响程度多样化、发病年龄多样化、表现度多样化、不同种族不同地域间发生率多样化等方面。而同质性的mtDNA1555A>G突变始终无法从分子水平上给予临床表型多样化的分子基础一个合适的解释。该部位突变是否存在异质性？其异质性水平是否与临床表型之间存在着一定的关系？目前传统检测技术在检测mtDNA1555A>G异质性上有一定的局限性，常采用PCR-RFLP和直接测序法对mtDNA1555A>G的异质性进行检测，但这些方法只能检测到高于20%的突变异质性水平，从而导致低水平的异质性突变无法被检出，而被认为是同质性突变或是同质性野生型，检测灵敏度不高，从而也无法解释临床表型多样化的原因。因而探索一种检测线粒体DNA1555A>G异质性突变及定量分析的方法显得十分重要。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种简单、准确且快速灵敏的运用DHPLC方法对线粒体DNA1555A>G的异质性突变进行检测及定量的方法，灵敏度高，且操作方便。
[0005]为达到上述目的，本发明所采用的技术方案为:
DHPLC检测并定量线粒体DNA 1555A>G的异质性突变，包括如下步骤:
1)提取线粒体DNA；
2)引物设计，根据DHPLC方法的原理及检测要求，应用在线引物设计工具进行引物设
计；
3 )确定PCR反应体系及反应条件，采用优化好的引物及PCR体系对线粒体DNA 1555A>G进行PCR扩增，得到PCR产物；
4)用DHPLC方法对PCR产物进行异质性突变的检测:
将PCR反应的产物在PCR仪中95 °C变性5min，然后以1°C /min的速度缓慢降温至25 0C，以充分形成异源性DNA双链；
然后采用DHPLC分析仪分析，每次自动进样8 ii L，采用流动相A液(0.lmmol/L TEAA,0.025%乙腈)和B液(0.lmmol/L TEAA，25%乙腈)将样本从分离柱中洗脱，检测柱温为59.5°C，洗脱液流速为0.9mL/min，洗脱曲线由紫外检测器检测获得，紫外检测器在260nm波长处收集信号。 [0006]作为本发明的一种优选方案，步骤2)的引物设计含以下序列:
正向序列:5’ gctcagcctatataccgccatcttcagcaa3> ；
反向序列:5’ ITTCCAGTACACTTACCATGTTACGACTTG3’。
[0007]作为本发明的一种优选方案，步骤2)的引物设计中，目的片段长度为339bp，且变异位点靠近下游引物的3’端。
[0008]作为本发明的一种优选方案，步骤3)的PCR反应体系为:50iiL反应体系，含IOOng 模板 DNA, 10 U mol/L 上、下游引物各 IyL, 10mmol /T, dNTP IuL, 2SmmoI /I, Mg2+3u L, IOXBuffer 5 U L, 5U/ U L Taq DNA 聚合酶 3yL。
[0009]作为本发明的一种优选方案，步骤3)的PCR的反应条件为:95°C预变性5min ；94°C lmin,60°C lmin,72°C lmin，35 个循环；72°C延伸 7min。
[0010]由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果为:
与PCR-RFLP和直接测序法相比，本发明不仅能检测出突变型和野生型个体，还能准确检测到低水平或高水平的异质性突变个体，并能精确定量其突变负荷，从而可以较好地解释临床表型多样化的原因，有助于进一步研究线粒体耳聋的分子遗传学机制，本发明的最低检测水平可达到5%，灵敏度较高。
[0011]本发明的检测成本低廉，解决了检测准确度和检测成本间的矛盾，可以较好地应用在临床检测和产前诊断等方面。本发明步骤简单，可快速准备地对mtDNA 1555A>G异质性突变进行检测并定量，检测结果稳定，可以作为一种常规的检测mtDNA 1555A>G的试验方法，还可以通过优化PCR扩增条件和DHPLC程序，以实现对其它位点突变进行检测和定量分析，对其它线粒体异质性点突变和疾病的临床关系的研究有重要意义。
[0012]【专利附图】
【附图说明】:
图1为标准品DNA 1555A>G异质性突变的DHPLC检测图谱；
图2为标准品DNA 1555A>G突变负荷的实际值和检测值的线性关系；
图3为部分样品的酶切图；
图4为部分样品的直接测序法检测的图谱及DHPLC检测图谱，其中箭头所示位置为1555位点。
[0013]【具体实施方式】:
一、方法的建立 (I)引物设计
根据DHPLC方法的原理及检测要求，应用NCBI在线引物设计工具Primer-BLAST进行引物设计，序列如下:
【权利要求】
1.DHPLC检测并定量线粒体DNA 1555A>G的异质性突变，其特征在于包括如下步骤: 1)提取线粒体DNA样本； 2)引物设计，根据DHPLC方法的原理及检测要求，应用在线引物设计工具进行引物设计； 3)确定PCR反应体系及反应条件，采用优化好的引物及PCR体系对线粒体DNA 1555A>G进行PCR扩增，得到PCR反应的产物； 4)用DHPLC方法对PCR反应的产物进行异质性突变的检测: 将PCR反应的产物在PCR仪中95°C变性5min，然后以1°C /min的速度缓慢降温至25 0C，以充分形成异源性DNA双链； 然后采用DHPLC分析仪分析，每次自动进样8 iiL，采用流动相A液(0.lmmol/L TEAA，0.025%乙腈)和B液(0.lmmol/L TEAA，25%乙腈)将前述样本从分离柱中洗脱，检测柱温为59.5°C，洗脱液流速为 0.9mL/min，洗脱曲线由紫外检测器检测获得，紫外检测器在260nm波长处收集信号。
2.根据权利要求1所述的DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变，其特征在于:所述步骤2)的引物设计含以下序列:
正向序列:5’ gctcagcctatataccgccatcttcagcaa3> ；
反向序列:5’ ITTCCAGTACACTTACCATGTTACGACTTG3’。
3.根据权利要求1或2所述的DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变，其特征在于:所述步骤2)的引物设计中，目的片段长度为339bp，且变异位点靠近下游引物的3’端。
4.根据权利要求1所述的DHPLC检测并定量线粒体DNA1555A>G的异质性突变，其特征在于: 所述步骤3)的PCR反应体系为:50 ii L反应体系，含IOOng模板DNA，10 y mol/L上、下游引物各 I U L，10mmol/L dNTP I u L,25mmol/L Mg2+ 3 u L, IOXBuffer 5 u L, 5U/ u L TaqDNA聚合酶3 ii L ; 所述步骤3)的PCR的反应条件为:95°C预变性5min ;94°C lmin,60°C lmin，72°Clmin, 35 个循环；72°C延伸 7min。
【文档编号】C12Q1/68GK103436604SQ201310302286
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月18日 优先权日:2013年7月18日
【发明者】王沙燕, 沈姗姗, 王琳凯 申请人:深圳市人民医院