一种纯化fitc标记的虾白斑综合症病毒（wssv）的方法
【专利摘要】本发明涉及病毒学与免疫学【技术领域】，特别是涉及一种纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒（WSSV）的方法。将经FITC标记的虾白斑综合症病毒混合液利用分子筛柱进行纯化；收集含有FITC标记的WSSV的洗脱液，即得到纯化的可视化WSSV；其中，分子筛柱填料为G-25M，洗脱液为PBS缓冲液。采用本发明可以较为简便地制备纯化的可视化WSSV，整个过程不需要借助高速离心机，也不需要反复离心去除上清再重悬，操作简便、省时、对仪器依赖度低，最终纯化完毕的WSSV仍然具有与虾类细胞的结合活性,可以用于进一步深入研究。
【专利说明】一种纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒学与免疫学【技术领域】，特别是涉及一种纯化FITC标记的对虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法。
【背景技术】
[0002]对奸白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,又称WSSV)是当前中国对虫下养殖业危害最重的病害，其侵染宿主的过程和机理一直是研究热点。目前对于WSSV侵染过程的研究多局限于个体水平，在细胞层面上的研究甚为缺乏，急需有可视化的WSSV作为实验工具来促进研究。
[0003]使用异硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记病毒并运用于研究已经在其他病毒中实现。Benne，CA等人利用FITC标记的流感病毒(H3N2)证明了其表面活性蛋白A而非表面活性蛋白D是大鼠巨噬细胞吞噬H3N2的调理素(CornelisA.Benne, Barry Benaissa-Trouw, Jos A.G.Van Strijp, Cornells A.Kraaijeveld, J.FreekF.Van Iwaarden.Surfactant protein A, but not surfactant protein D, is an opsoninfor influenza A virus phagocytosis by rat alveolar macrophages.European Journalof Immunology, 27 (1997)，886-890)。Joan E.Nichols 等人还利用 FITC 标记的流感病毒作为表征，对单核巨噬细胞和淋巴细胞在流式细胞仪上进行分离(Joan E.Nichols1D.J.Mock, N.J.Roberts.Use of FITC-1abeled influenza virus and flow cytometryto assess binding and internalization of virus by monocytes-macrophages andlymphocytes.Archives of Virology, 130 (1992),441-455.)。
[0004]目前已有文献报道，通过FITC标记的WSSV开展个例研究。Li等首先报道了使用FITC标记研究β -1ntegrin在WSSV侵染斑节对奸血细胞中发挥的作用(Deng-FengLi, Ming-Chang Zhang, Ha1- Jie Yang, Yan-Bing Zhu, Xun Xu.2007.β -1ntegrin mediatesWSSV infection.Virology, 368 (2007), 122-132.XWu 等在研究沉默Rab GTPases 后对于斑节对虾血细胞吞噬能力的影响中也使用了 FITC标记的WSSV。以上2篇文献中使用的FITC标记法都是先将WSSV与FITC混合孵育，然后通过三次高速离心(10，000 X g，IOmin)去除上清，再加入 TM buffer 重悬(50mM/L Tris-HCl, 10mM/L MgC12，ρΗ7.6)分离带有标记的WSSV与游离的FITC，纯化过程繁琐、耗时长，并且需要使用高速离心机。
[0005]分子筛是一种具网状结构的天然或人工合成的化学物质。如交联葡聚糖、沸石等，当作为层析介质时，可按分子大小对混合物进行分级分离。通过本发明，可以更为简便地纯化FITC标记的WSSV，为研究WSSV在细胞水平上的侵染过程提供帮助。
【发明内容】
[0006]为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种纯化FITC标记的对虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法。
[0007]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:[0008]一种纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，将经FITC标记的虾白斑综合症病毒混合液利用分子筛柱进行纯化；收集含有FITC标记的WSSV的洗脱液，即得到纯化的可视化WSSV ;其中，分子筛柱填料为G-25M，洗脱液为PBS缓冲液。
[0009]进一步地说，将经FITC标记的虾白斑综合症病毒混合液转移至装填有G-25M分子筛填料的分子筛柱，整个过程用PBS作为洗脱液，并依靠重力进行洗脱；收集含有FITC标记的WSSV的洗脱液，即得到纯化的可视化WSSV ;其中，装填有G-25M分子筛填料的分子筛柱先经2倍柱体积的PBS清洗。
[0010]所述FITC标记的WSSV混合液为将保存于PBS溶液中浓度为3.0 X IO6Copy/ μ I的虾白斑综合症病毒与FITC溶液按照体积比5-10:1混合，室温下孵育0.5-2h。
[0011]所述FITC溶液浓度为lyg/μ I。
[0012]所述孵育在水平摇床或杂交炉中进行。
[0013]所述水平摇床转速为30_100rpm。
[0014]所述收集的洗脱液经考马斯亮蓝法检测蛋白含量，将病毒含量最高(即蓝色最深)洗脱液混合，即得到含有FITC标记的WSSV的溶液，置于4°C避光保存。
[0015]本发明所具有的优点:通过采用本发明的方法，可以较为简便的得到可视化的WSSV,而且能够分离游离的FITC与FITC标记的WSSV，整个过程中不需要借助高速离心机，也不需要反复离心去除上清再重悬，操作简便、省时、对仪器依赖度低，最终纯化完毕的带有FITC标记的WSSV在波长为490~495nm的蓝光激发下发出波长为520~530nm的绿色荧光，同时WSSV仍然具有与虾类细胞的结合活性及感染性，可以用于进一步深入研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明实施例提供的纯化FITC标记的WSSV过程示意图。
[0017]图2为本发明实施例提供的FITC标记的WSSV与红螯螯虾造血组织原代细胞孵育结果图(荧光)。
[0018]图3为本发明实施例提供的FITC标记的WSSV与红螯螯虾造血组织原代细胞孵育结果图(可见光)。
【具体实施方式】
[0019]实施例1
[0020]1.材料准备
[0021]将Img 异硫氰酸突光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)溶于 Iml 碳酸钠碳酸氢钠缓冲液(0.1M，ρΗ9.0)制成FITC含量为I μ g/ μ I的FITC溶液，_20°C保存。
[0022]配制pH为7.4的10mM/L磷酸钠缓冲液，并向其中分别加入KCl和NaCl，使它们的终浓度分别达到27mM/L和138mM/L，该溶液记为PBS (pH7.4)。
[0023]将已经制备好的高纯度WSSV保存在上述PBS (pH7.4)中，浓度控制在约
3.0X IO6Copy/μ 1，_80°C保存。
[0024]配制pH为6.8的10mM/L磷酸氢二钠/磷酸二氢钾缓冲液，并向其中分别加入NaCl、CaCl2、MnCl2 和 KCl，使它们的终浓度分别达到 150mM/L、10 μ M/L、10 μ M/L 和 27 μ M/L，该溶液记为CPBS (pH6.8)。[0025]2.FITC与对虾WSSV混合孵育
[0026]取于冰上融化的80 μ I高纯度WSSV溶液与10 μ I FITC溶液，于200 μ I离心管中混合，在水平摇床60rpm中室温孵育lh，反应过程中用锡箔纸包住避光。
[0027]3.纯化 FITC 标记的 WSSV
[0028]如图1所示，孵育完毕以后将混合液转移至装填有G-25M分子筛填料的分子筛柱(柱体积为6ml)，整个过程用PBS并依靠重力进行洗脱。
[0029]先将预先装有G-25M分子筛填料的分子筛柱(柱体积为6ml)垂直固定于铁架台上，然后使用2倍柱体积的上述PBS (pH7.4)清洗分子筛柱，当分子筛柱中液面与填料持平时关闭止水夹。
[0030]此时再加入步骤2孵育后的混合液，打开止水夹使分子筛柱中液体流出约80 μ I后关闭(即，打开止水夹使分子筛柱中液面与填料持平)，最后使用2倍柱体积的上述PBS(ρΗ7.4)洗脱。洗脱时使用1.5ml的EP管收集洗脱液，每250 μ I —管，将收集管按照收集顺序依次编号。
[0031]同时吸取每个收集管中10μI溶液使用考马斯亮蓝法检测每个收集管中的蛋白含量，将检测到的连续编号的第一批含有蛋白的收集液视为含有病毒的洗脱液，取其中病毒含量最高(即蓝色最深)的3管，总体积约720 μ 1，将这些洗脱收集液混合，即得到含有FITC标记的WSSV的溶液，置于4°C避光保存。整个纯化过程均注意避光操作。
[0032]洗脱完毕以后再使用8倍柱体积的上述PBS (pH7.4)冲洗分子筛柱后保存下次使用。
[0033]4.应用研究
[0034]向在48孔板中培养的红螯螯虾造血组织原代细胞中加入纯化的FITC标记的WSSV溶液，每孔中加入量为50 μ 1，细胞培养条件下孵育lh，在孵育完毕后用上述CPBS冲洗3次以除去未与虾细胞结合的FITC标记的WSSV，最后在荧光显微镜下观察到经过FITC标记的WSSV与虾类细胞的结合情况(图2和图3)。纯化完毕的WSSV在波长为490~495nm的蓝光激发下会发出波长为520~530nm的绿色荧光，由图2可见在镜下观察到被FITC标记的WSSV结合的虾类细胞会发出绿色荧光。
【权利要求】
1.一种纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，其特征在于:将经FITC标记的虾白斑综合症病毒混合液利用分子筛柱进行纯化；收集含有FITC标记的WSSV的洗脱液，即得到纯化的可视化WSSV ;其中，分子筛柱填料为G-25M，洗脱液为PBS缓冲液。
2.按权利要求1所述的纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，其特征在于:将经FITC标记的虾白斑综合症病毒混合液转移至装填有G-25M分子筛填料的分子筛柱，整个过程用PBS作为洗脱液，并依靠重力进行洗脱；收集含有FITC标记的WSSV的洗脱液，即得到纯化的可视化WSSV ;其中，装填有G-25M分子筛填料的分子筛柱先经2倍柱体积的PBS清洗。
3.按权利要求1或2所述的纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述FITC标记的WSSV混合液为将保存于PBS溶液中浓度为3.0 X IO6Copy/ μ I的虾白斑综合症病毒与FITC溶液按照体积比5-10:1混合，室温下孵育0.5-2h。
4.按权利要求3所述的纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述FITC溶液浓度为I μ g/ μ I。
5.按权利要求3所述的纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述孵育在水平摇床或杂交炉中进行。
6.按权利要求5所述的纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述水平摇床转速为30-100rpm。
7.按权利要求1或2所述的纯化FITC标记的虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，其特征在于:所述收集的洗脱液经考马斯亮蓝法检测蛋白含量，将病毒含量最高(即蓝色最深)洗脱液混合，即得到含有FI TC标记的WSSV的溶液，置于4°C避光保存。
【文档编号】C12N7/02GK103468652SQ201310302179
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年7月15日 优先权日:2013年7月15日
【发明者】相建海, 谢世筠, 李富花 申请人:中国科学院海洋研究所