一种快速鉴定和定量单链小分子核酸组合的方法

一种快速鉴定和定量单链小分子核酸组合的方法
【专利摘要】本发明涉及一种快速鉴定和定量单链小分子核酸组合的方法。具体地，本发明提供了一种使用核酸序列杂交技术，在层析介质上通过专一性的抗原抗体反应来快速鉴定并半定量至少一种序列专一的单链小分子核酸或多种序列不同的单链小分子核酸组合的方法。这种方法特别适合应用在针对各种疾病相关的小分子核糖核酸(miRNA)变化的定性和半定量的测定。
【专利说明】一种快速鉴定和定量单链小分子核酸组合的方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及核酸检测领域，具体地，本发明提供了一种快速鉴定和定量单链小分 子核酸组合的方法，侧流片和试剂盒。

【背景技术】
[0002] 由现代细胞和分子生物学的研究发现，细胞内的基因表达在分子水平上受到多种 因素的严格调控。调控分为基因转录前调控和基因转录后调控以及信使核糖核酸翻译前调 控和信使核糖核酸翻译后调控。其中一种重要的调控机制是通过非编码短链核糖核酸专一 性结合在信使核糖核酸的3'端的互补序列，来抑制信使核糖核酸的蛋白质翻译过程。抑制 效果的产生一方面是通过结合后引入了核酸酶结合位点，导致该信使核糖核酸被核酸酶降 解，另一方面是结合产生的局部双链结构，阻止了核糖体对信使核糖核酸的蛋白质翻译过 程。这种非编码的短链核糖核酸一般被称为小分子核糖核酸（miRNA)。
[0003] miRNA是一类小分子的核糖核酸，长度按已经发现的miRNA的数据库查询一般介 于15-30个核苷酸之间。在miRNA被发现后，引起众多科学研究人员的关注，通过近10多 年来分子生物学和临床医学方面的研究，发现有多种miRNA和癌症有直接的相关性，有的 miRNA的含量在癌症患者中升高，有的则降低，导致受它们调控的相关蛋白质的表达量的降 低和升高，帮助癌细胞的生长和扩散。另外有些miRNA在免疫应答和心血管疾病中也产生 变化。
[0004] 随着miRNA的研究的深入，越来越多的miRNA被发现，越来越多的miRNA与各类疾 病的相关性被确认。miRNA在疾病的诊断和治疗方面显示出越来越大的重要性。目前已知 的miRNA检测方法有：反转录实时链式扩增法（RT-Realtime PCR)，应用杂交原理的微阵列 法（microarray)，以及传统的杂交法。
[0005] 依照目前已知的技术，在检测miRNA的时候都是针对一种序列专一的miRNA分子， 由于单一种类的miRNA在样品中的含量比较少，为了提高检测的灵敏度一般要在杂交法中 应用较为灵敏的多点荧光标记技术，或者核酸连接标记荧光基团技术，这种技术的应用往 往不会使用miRNA全核酸序列进行杂交，虽然灵敏度有提高，但是其杂交专一性就有所下 降，导致准确性降低。
[0006] 另外一种方法是通过核糖核酸反转录实时链式扩增技术来提高检测的灵敏度，但 是由于核酸合成酶的准确性不是1〇〇%，在扩增过程中引入一个错误的核苷酸，就会导致检 测准确性的下降。而且上述的方法检测的成本都比较高，都需要价格比较高的荧光检测设 备并进行较为复杂的标记反应，这样可能导致不准确的结果和人为导入的误差。
[0007] 综上所述，本领域迫切需要一种准确度高，检测效率高，低成本的miRNA检测方 法。


【发明内容】

[0008] 本发明的目的是提供一种准确度高，检测效率高，低成本的miRNA检测方法。
[0009] 本发明的第一方面，提供了一种检测样品中单链小分子核酸的方法，所述方法包 括步骤：
[0010] ⑴将待测样品与检测溶液混合，形成检测混合物；
[0011] 其中，所述检测溶液含有检测探针、捕获探针和报告探针，并且所述检测探针具 有：分别位于侧翼的捕获探针结合区和报告探针结合区，以及位于所述捕获探针结合区和 所述报告探针结合区之间的目标核酸分子结合区；
[0012] α υ使所述检测混合物进行杂交反应，从而形成含"目标核酸分子-捕获探针-报 告探针-检测探针"四元复合物的、杂交后的检测混合物；
[0013] (iii)将所述杂交后的检测混合物在层析介质上进行层析，其中所述的层析介质 设有一个或多个复合物捕获区，从而将所述四元复合物捕获于所述的复合物捕获区，形成 一条或多条层析带；以及
[0014] (iv)检测所述层析带中所述四元复合物的存在与否和/或数量，从而确定所述样 品中小分子核酸的存在与否和/或数量。
[0015] 在另一优选例中，所述的捕获探针结合区、报告探针结合区和miRNA结合区是紧 邻的。（间隔区的碱基数为〇或1个）。
[0016] 在另一优选例中，所述检测方法为定量或半定量检测。
[0017] 在另一优选例中，所述的样品中包含至少一种序列专一的单链小分子核酸 (miRNA)。
[0018] 在另一优选例中，所述的样品中包含多种序列不同的单链小分子核酸组合。
[0019] 在另一优选例中，所述的层析介质是纤维素膜。
[0020] 在另一优选例中，所述的捕获探针、检测探针和报告探针为脱氧核糖核酸寡聚核 苷酸，且所述各探针的序列为外源性序列。
[0021] 在另一优选例中，所述捕获区的数量为1-20个，较佳地2-10个，更佳地2-5个，最 佳地设有2-4个捕获区。
[0022] 在另一优选例中，所述的捕获探针带有或连有结合基团，而所述的复合物捕获区 固定有捕获基团，所述的捕获基团特异性捕获或结合于所述的结合基团。
[0023] 在另一优选例中，所述捕获探针的结合基团标记在5'端或3'端。
[0024] 在另一优选例中，所述结合基团选自下组：生物素（biotin)、荧光素、Cyanine染 料、抗原、配基。
[0025] 在另一优选例中，所述捕获基团选自下组：亲和素、荧光素抗体、Cyanine染料抗 体、抗体、配体。
[0026] 在另一优选例中，所述结合基团选自下组：生物素（biotin)、荧光素 (fluorescein)、荧光染料 Cy3 (C31H37KN2O8S2)，或其组合。
[0027] 在另一优选例中，所述结合基团通过化学修饰共价交联于捕获探针。
[0028] 在另一优选例中，捕获探针的结合基团与捕获探针的5'端核苷酸形成专一性结 合，通过其中的报告探针的报告基团产生显色反应。
[0029] 在另一优选例中，所述捕获探针的5'末端的结合基团与层析介质特定位置上的 结合蛋白或抗体相结合，从而使层析介质上产生可见的色带。
[0030] 在另一优选例中，所述的报告探针带有或连有报告基团或可检测标记。
[0031] 在另一优选例中，所述报告探针与所述报告基团或可检测标记通过共价交联方式 连接。
[0032] 在另一优选例中，所述报告基团为可以产生显色反应的基团，较佳地选自下组：纳 米金颗粒、碱性磷酸酯酶，或其组合。
[0033] 在另一优选例中，所述报告基团可以标记在3'端或5'端。
[0034] 在另一优选例中，当报告基团标记在3'端时，所述杂交检测反应配合使用在5'端 标记有结合基团的捕获探针，以及报告探针的互补序列在5'端，捕获探针序列在3'端的检 测探针。
[0035] 在另一优选例中，当报告基团标记在5'端时，所述杂交检测反应配合使用在3'端 标记有结合基团的捕获探针，以及报告探针的互补序列在3'端，捕获探针序列在5'端的检 测探针。
[0036] 在另一优选例中，所述的检测探针具有选自下组的一个或多个特征：
[0037] 所述捕获探针结合区是捕获探针的互补序列；
[0038] 所述报告探针结合区是报告探针的互补序列；和
[0039] 所述的目标核酸分子结合区是待检测目标核酸分子的互补序列。
[0040] 在另一优选例中，所述检测探针具有位于的3'端的捕获探针的互补序列，位于5' 端的报告探针的互补序列，以及位于捕获探针互补序列和报告探针互补序列之间的目标核 酸分子的互补序列。
[0041] 在另一优选例中，所述检测探针具有位于5'端的捕获探针的互补序列，位于3'端 的报告探针的互补序列，以及位于捕获探针互补序列和报告探针互补序列之间的目标核酸 分子的互补序列。
[0042] 在另一优选例中，当所述检测探针为上述探针时，所述的捕获探针是3'端标记有 结合基团的捕获探针；且所述的报告探针是5'端标记有报告基团的报告探针。
[0043] 在另一优选例中，所述方法具有以下的一个或多个特征：
[0044] 捕获探针结合区的长度Nl = 10-30个核苷酸；和/或
[0045] 报告探针结合区的长度N2 = 10-30个核苷酸；和/或
[0046] miRNA结合区的长度N3 = 10-30个核苷酸；和/或
[0047] 检测探针序列的总长度M = 32-90个核苷酸。
[0048] 在另一优选例中，所述的复合物捕获区上连接有用于检测小分子核酸分子的结合 蛋白或抗体。
[0049] 在另一优选例中，所述的用于检测小分子核酸分子的结合蛋白或抗体选自下组： 生物素结合蛋白，抗荧光素抗体，抗荧光染料Cy3抗体，或其组合。
[0050] 在另一优选例中，所述结合蛋白或抗体是标记捕获探针的结合基团的抗体。
[0051] 在另一优选例中，所述结合蛋白或抗体用于结合捕获探针序列。
[0052] 在另一优选例中，所述层析介质上还设有阳性对照区域，所述阳性对照区域上连 接有用于直接检测报告基团的结合蛋白或抗体。
[0053] 在另一优选例中，所述的直接检测报告基团的结合蛋白或抗体选自下组：纳米金 颗粒结合蛋白、抗纳米金抗体、碱性磷酸酯酶结合蛋白、抗碱性磷酸酯酶抗体，或其组合。
[0054] 在另一优选例中，所述结合蛋白或抗体与报告基团结合，从而使层析介质上产生 阳性对照条带。
[0055] 本发明的第二方面，提供了一种侧流片，所述侧流片包括层析介质、位于层析介质 一端的加样区、和位于层析介质另一端的任选的吸水片，以及用于固定层析介质的夹持和 固定材料，其特征在于，
[0056] 所述层析介质上设有一个或多个连接有捕获基团的捕获区，用于捕获结合基团；
[0057] 所述层析介质上设有连接有直接检测报告基团的阳性对照区，用于结合报告基 团；和
[0058] 所述层析介质上还设有加样区，用于加入待测样品。
[0059] 在另一优选例中，所述捕获基团为抗结合基团的抗体。
[0060] 在另一优选例中，所述直接检测报告基团为抗报告基团的抗体。
[0061] 在另一优选例中，所述捕获区的数量为1-20个，较佳地2-10个，更佳地2-5个，最 佳地设有2-4个捕获区。
[0062] 本发明的第三方面，提供了一种检测包含单链小分子核酸的样品的试剂盒，其特 征在于，包括：
[0063] 检测溶液，所述检测溶液中包含捕获探针、检测探针和报告探针；
[0064] 一个或多个容器，用于盛放检测溶液；
[0065] 如本发明第二方面所述的侧流片；
[0066] 任选的加样装置；和
[0067] 说明书。
[0068] 在另一优选例中，所述的试剂盒还含有加样装置；较佳地，加样装置是滴管或毛细 管。
[0069] 在另一优选例中，所述的层析介质是纤维素膜。
[0070] 在另一优选例中，所述试剂盒通过如本发明第一方面所述的方法检测单链小分子 核酸。
[0071] 本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的侧流片或如本发明第二方面 所述的试剂盒用于检测待测样品中的单链小分子核酸的用途。
[0072] 在另一优选例中，所述待测样品为生物样品，较佳地选自下组：全血样品、血清样 品、体液样品、唾液样品、尿液样品。
[0073] 本发明的第五方面，提供了一种疾病预检装置，所述装置包括本发明第二方面所 述的侧流片，以及用于检测所述侧流片的检测信号的检测设备（或检测器）。
[0074] 在另一优选例中，所述的检测设备检测检测所述层析带中所述四元复合物的存在 与否和/或数量，从而确定所述样品中小分子核酸的存在与否和/或数量。
[0075] 在另一优选例中，所述侧流片的层析介质上设有1-5个捕获区，较佳地设有2-4个 捕获区，且所述侧流片的层析介质上还设有阳性对照区。
[0076] 在另一优选例中，所述装置可用于检测与小分子核酸相关的疾病。
[0077] 在另一优选例中，所述装置可用于检测选自下组的疾病：癌症、心血管疾病、外源 性微生物感染。
[0078] 本发明第六方面，提供了一种检测包含单链小分子核酸的样品的方法，所述方法 包括：使用捕获探针，检测探针和报告探针，在层析介质上通过专一性的抗原抗体反应和/ 或蛋白质和其专一性结合的化学基团的结合来快速鉴定单链小分子核酸含量。
[0079] 本发明的第七方面，提供了一种疾病的预检方法，所述方法包括使用如本发明第 二方面所述的侧流片或如本发明第三方面所述的试剂盒进行检测。
[0080] 在另一优选例中，所述的疾病选自下组：癌症、心血管疾病、外源性微生物感染。
[0081] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文（如实施例）中具 体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。

【专利附图】

【附图说明】
[0082] 图1显示了本发明方法所用的探针和目标核酸分子，其中，结合基团（如结合基团 A、B 和 C)可选用生物素（biotin)，荧光素（fluorescein)或荧光燃料 Cy3 (C31H37KN2O8S2 ;Ex : 548nm，Em:562nm);报告基团可选用纳米金颗粒，荧光基团或者酶标记（如碱性磷酸酯酶）。
[0083] 图2显示了本发明的检测方法示意图，其中，捕获探针与结合基团结合后，与待检 测的miRNA序列形成核苷酸，miRNA序列的另一端与一端连接有报告基团的报告探针相连 接，形成与检测探针互补的核酸序列，并与检测探针经过杂交后形成稳定的双链结构，且所 述结合基团能够被相应条带上的捕获基团捕获。
[0084] 图3显示了本发明实施例2中的实际检测效果图。
[0085] 图4显示了本发明实施例3中的实际检测效果图。

【具体实施方式】
[0086] 本发明人经过长期而深入的研究，意外地发现，采用检测探针、末端修饰的捕获探 针和末端标记的报告探针与样品在合适条件下进行杂交，并在层析介质上进行捕获和显 色，可非常高效和简便地定性或定量地检测样品中的单链小分子核酸。基于上述发现，发明 人完成了本发明。
[0087] 术语
[0088] 如本文所用，术语"外源性序列"指在目标组织中不含有相同的序列的人工设计序 列。
[0089] 术语"结合基团"指用于标记捕获探针的基团，所述基团与位于层析介质上的用于 检测小分子核酸分子的结合蛋白或抗体相结合从而将杂交的核酸分子固定在层析介质上。 所述结合基团可以是（但并不限于）生物素（biotin)、抗原或配基等能够与特定基团特异 性结合的基团。
[0090] 术语"捕获基团"指用于与结合基团特异性结合的基团，所述基团设置于层析介质 上，与标记在捕获探针上的结合蛋白或抗体特异性结合，从而将杂交的核酸分子固定在层 析介质上。所述的捕获基团可以是（但并不限于）生物素结合蛋白、抗原或配体等能够与 特定基团特异性结合的基团。
[0091] 捕获探针
[0092] 如图1所示，捕获探针是一条由10-30个核苷酸组成的脱氧核糖核酸寡聚核苷酸 链。它的一端标记有结合基团，较佳地为5'端。这个结合基团可以是生物素（biotin)，荧 光素（fluorescein)或突光燃料 Cy3 (C31H37KN2O8S2 ;Ex :548nm, Em :562nm)其中的任意一种 或其组合。
[0093] 所述的结合基团用于与层析介质上的捕获基团相结合，从而使"目标核酸分 子-捕获探针-报告探针-检测探针"四元复合物被层析介质上的特定捕获区捕获。
[0094] 捕获基团为固定在层析介质上的与捕获探针专一性结合的基团。捕获基团的 选取取决于捕获探针的种类，通常可选用生物素结合蛋白（streptavidin, avidin或 neutravidin)，抗突光素抗体或抗突光染料Cy3的抗体，它们通过吸附交联在层析介质的 特定位点，并通过结合捕获探针上的结合基团捕获经过该位点的捕获探针。
[0095] 当4种核酸分子通过碱基配对形成的复合物达到一定浓度时，相应的色带就产生 显色反应，浓度的高低可以通过显色条带的深浅度和宽度在一定的范围内来进行准定量的 分析（如图4所示）。
[0096] 在针对不同的目标核酸分子检测中，需要在层析介质上分别设置不同的捕获探针 序列。捕获探针序列都是在目标组织中并不含有的外源性人工设计的序列，通过常规方法， 如NIH(美国国立卫生院）的基因数据库的Blast程序进行检验。
[0097] 报告探针
[0098] 如图1所示，报告探针是一条由10-30个核苷酸组成的脱氧核糖核酸寡聚核苷酸 链。在针对不同的目标核酸分子检测中，报告探针的序列一般保持不变，它的序列是一个在 目标组织中并不含有的外源性人工设计的序列，可通过NIH(美国国立卫生院）的基因数据 库的Blast程序检验（图1)。
[0099] 报告探针的一端标记有报告基团，较佳地为3'端。当报告基团聚合到一定程度 时，会产生肉眼可以观察到的颜色。报告基团可以是纳米金颗粒，也可以是荧光基团或者酶 标记，比如碱性磷酸酯酶。
[0100] 检测探针
[0101] 如图1所示，检测探针是一条由32-90个核苷酸组成的脱氧核糖核酸寡聚核苷酸 链。它的一端侧翼具有报告探针结合区，所述报告探针结合区为报告探针的互补序列，较佳 地位于5'端；它的另一端侧翼具有捕获探针结合区，所述捕获探针结合区为捕获探针的互 补序列，较佳地位于3'端，介于这两个序列之间的是目标核酸分子结合区，所述目标核酸 分子结合区为目标核酸分子（如miRNA)的互补序列。
[0102] 本发明的检测探针用于与捕获探针序列，目标miRNA序列以及报告探针序列杂交 形成双链结构四元复合物。
[0103] 目标核酸分子
[0104] 如图1所示，目标核酸分子是一条较短的核酸分子，长度介于12-30个核苷酸之 间。它可以是脱氧核糖核酸，也可以是核糖核酸。它可以是天然或生物体自由的核酸分子， 也可以是通过化学方法或生物工程方法人工合成的核酸分子。在本发明的优选例中，目标 核酸分子为miRNA。
[0105] 层析介质
[0106] 层析介质是指一种介质，它可以是不同孔径的层析材料，如纤维素膜或者经过一 定化学处理的纤维素膜，在介质的另一端有吸取溶液的吸水片，当样品溶液在介质的一端 的加样孔加入，样品溶液经过虹吸现象向介质的另一端扩散。
[0107] 如图4所示，在本发明的一个实施例中，使用时在层析介质上依次设置一条或多 条检测条带（目标核酸分子捕获区），并在各条检测条带后设置一条阳性对照条带。
[0108] 其中，所述的检测条带含有或固定有分别与待检测序列的捕获探针结合的相应捕 获基团的抗体或结合蛋白，从而特异性地与相应的捕获基团相结合，使与待检测序列相应 的条带显色。
[0109] 所述的阳性对照条带为直接结合报告基团的结合蛋白或抗体，如纳米金颗粒结合 蛋白、抗纳米金抗体、碱性磷酸酯酶结合蛋白或抗碱性磷酸酯酶抗体。所述结合蛋白或抗体 与报告基团相结合，从而使阳性对照条带显色。
[0110] 核酸序列的杂交
[0111] 术语"杂交"是指单链的核糖核酸或脱氧核糖核酸和另一条或另一条其中的一段 完全互补的单链核糖核酸或脱氧核糖核酸中碱基配对，其碱基之间形成氢键的过程。
[0112] 所述的碱基配对可以是传统的华生-克里克配对，也可以是摆动配对。一个典型 的摆动配对是鸟嘌呤和尿嘧啶的配对，它们之间形成2对氢键。
[0113] 杂交是在一定的反应条件下进行，对杂交的准确性有影响的因素有杂交使用的温 度，杂交液中的盐浓度，在杂交溶液中探针分子的浓度以及在杂交溶液中掺入的其他化学 物质，如聚乙醇6000, Formamid等。杂交的条件是依据要检测的目标核酸分子的长度和 其各类核苷酸的含量进行调整，以达到专一，灵敏的要求。在本发明中，所述的杂交过程在 65-80°C下，或40?65°C下进行。
[0114] 在另一优选例中，本发明方法所述核酸杂交的过程包括：
[0115] 捕获探针的3'末端核苷酸与目标miRNA的5'末端核苷酸形成相邻的核苷酸；
[0116] 目标miRNA的3'末端核苷酸和报告探针的5'末端核苷酸形成相邻的核苷酸；和
[0117] 检测探针与上述三个单链核酸分子进行杂交配对。
[0118] 单链小分子核酸的检测
[0119] 本发明提供的检测样品中单链小分子核酸的方法，包括：
[0120] (i)将待测样品与检测溶液混合，形成检测混合物，其中所述检测溶液含有检测探 针、捕获探针和报告探针，并且所述检测探针的具有分别位于侧翼的捕获探针结合区和报 告探针结合区以及位于所述捕获探针结合区和所述报告探针结合区之间的目标核酸分子 结合区；
[0121] α υ进行杂交反应，从而形成含"目标核酸分子-捕获探针-报告探针-检测探 针"四元复合物的检测混合物；
[0122] (iii)将杂交后的检测混合物在层析介质上进行层析，其中所述的层析介质设有 一个或多个复合物捕获区，从而将所述四元复合物捕获于所述的复合物捕获区，形成一条 或多条层析带；
[0123] (iv)检测所述层析带中四元复合物的存在与否和/或数量，从而确定所述样品中 小分子核酸的存在与否和/或数量。
[0124] 本发明检测方法可作为定性检测，也可作为定量或半定量检测。
[0125] 如图2所示，从介质的加样端到另一端的吸水片之间依次分别有针对一个或多个 捕获探针的结合基团的专一性的结合蛋白或免疫抗体条带和一条能与报告基团结合的捕 获区（抗体条带）。在扩散过程中，所述探针与检测样品中的小分子核酸进行杂交，使报 告基团产生显色反应，并被结合基团捕获，使层析介质上显示出条带，从而检测目标核酸分 子。
[0126] 当捕获探针、检测探针、报告探针或目标核糖核酸缺乏时，就不能形成稳定的由4 个核酸分子构成的四元复合物。尤其当目标核酸分子缺乏时，不能形成只有捕获探针，报告 探针和检测探针组成的3个核酸分子的复合物。当这个含有由4个核酸分子形成的双链结 构四元复合物的溶液加在一个层析介质上，向一定的方向扩散。在层析介质上有一条或多 条分别能和捕获探针的结合基团形成专一性结合的条带，当由4个核酸分子形成的双链结 构四元复合物分子经过能和其中捕获探针的结合基团专一性结合的条带，就结合在该条带 上，当此类分子富集时，就能通过其中的报告探针的报告基团产生显色反应，通过这三个条 带的显色反应的强弱，就可以用肉眼或仪器半定型地测算出所含的目标核酸分子的含量。
[0127] 当检测多个miRNA分子时，根据各个条带的显色强弱程度，还可对待检测序列进 行半定量检测。
[0128] 疾病预检
[0129] 把针对一种疾病的相关miRNA进行分类，分为（a)含量上升的miRNA，（b)含量下 降的miRNA和（c)作为对照含量不变或基本不变的miRNA。针对含量上升的miRNA使用同 一种捕获探针，针对含量不变的miRNA使用同一种捕获探针，针对含量降低的miRNA使用同 一种捕获探针，通过以含量不变的miRNA做为对照，半定量含量上升或下降的miRNA，并和 健康组（或正常人群）对照，可以快速，准确地判断样品是否患有此类疾病，是否需要做更 深入的检查或长期观察。这样可以解决单一 miRNA含量过低以及出现的检测误差。
[0130] 使用本发明的检测方法，可对各种不同类型的疾病进行预检。代表性的疾病包括 (但并不限于）：癌症、心血管疾病、外源性微生物感染等。
[0131] 本发明的主要优点：
[0132] (1)能够更快速，半定量，更准确地检测待测样品中的miRNA，实验条件温和，准确 度高。
[0133] (2)能够有效地用于一些与miRNA含量相关的疾病的预检，如癌症、心血管疾病、 外源性微生物感染。
[0134] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0135] 材料

【权利要求】
1. 一种检测样品中单链小分子核酸的方法，其特征在于，包括步骤： (i) 将待测样品与检测溶液混合，形成检测混合物； 其中，所述检测溶液含有检测探针、捕获探针和报告探针，并且所述检测探针具有：分 别位于侧翼的捕获探针结合区和报告探针结合区，以及位于所述捕获探针结合区和所述报 告探针结合区之间的目标核酸分子结合区； (ii) 使所述检测混合物进行杂交反应，从而形成含"目标核酸分子-捕获探针-报告 探针-检测探针"四元复合物的、杂交后的检测混合物； (iii) 将所述杂交后的检测混合物在层析介质上进行层析，其中所述的层析介质设有 一个或多个复合物捕获区，从而将所述四元复合物捕获于所述的复合物捕获区，形成一条 或多条层析带；以及 (iv) 检测所述层析带中所述四元复合物的存在与否和/或数量，从而确定所述样品中 小分子核酸的存在与否和/或数量。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的捕获探针带有或连有结合基团，而 所述的复合物捕获区固定有捕获基团，所述的捕获基团特异性捕获或结合于所述的结合基 团。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的报告探针带有或连有报告基团或可 检测标记。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的检测探针具有选自下组的一个或多 个特征： 所述捕获探针结合区是捕获探针的互补序列； 所述报告探针结合区是报告探针的互补序列；和 所述的目标核酸分子结合区是待检测目标核酸分子的互补序列。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的复合物捕获区上连接有用于检测小 分子核酸分子的结合蛋白或抗体；和/或 所述层析介质上还设有阳性对照区域，所述阳性对照区域上连接有用于直接检测报告 基团的结合蛋白或抗体。
6. -种侧流片，所述侧流片包括层析介质、位于层析介质一端的加样区、和位于层析介 质另一端的任选的吸水片，以及用于固定层析介质的夹持和固定材料，其特征在于， 所述层析介质上设有一个或多个连接有捕获基团的捕获区，用于捕获结合基团； 所述层析介质上设有连接有直接检测报告基团的阳性对照区，用于结合报告基团；和 所述层析介质上还设有加样区，用于加入待测样品。
7. -种检测包含单链小分子核酸的样品的试剂盒，其特征在于，包括： 检测溶液，所述检测溶液中包含捕获探针、检测探针和报告探针； 一个或多个容器，用于盛放检测溶液； 如权利要求6所述的侧流片； 任选的加样装置；和 说明书。
8. 如权利要求6所述的侧流片或如权利要求7所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于 检测待测样品中的单链小分子核酸。
9. 一种疾病预检装置，其特征在于，所述装置包括权利要求6所述的侧流片，以及任选 的用于检测所述侧流片的检测信号的检测设备（或检测器）。
10. -种检测包含单链小分子核酸的样品的方法，其特征在于，使用捕获探针，检测探 针和报告探针，在层析介质上通过专一性的抗原抗体反应和/或蛋白质和其专一性结合的 化学基团的结合来快速鉴定单链小分子核酸含量。
【文档编号】C12M1/34GK104293897SQ201310301512
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】谭晓刚 申请人:谭晓刚