用于鉴定金花茶的snp分子标记及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于鉴定金花茶的SNP分子标记及其应用，所述SNP位于如SEQ ID NO.1所示的金花茶GBSSI基因的第141位碱基，此处碱基为T，则鉴定为金花茶物种。本发明首次基于金花茶SNP位点建立dCAPS分子标记体系，通过生物信息学方法对金花茶GBSSI基因序列进行分析，筛选SNP位点，设计适当的错配引物进行PCR扩增，选择合适的限制性内切酶进行酶切，最终将SNP转化为dCAPS分子标记进行检测，建立了适用于口岸检验的金花茶物种的快速鉴定方法。
【专利说明】用于鉴定金花茶的SNP分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体地说，涉及用于鉴定金花茶的SNP分子标记及 其应用。
【背景技术】
[0002] 金花茶（Camellia nitidissima Chi)属于山茶科（Theaceae)山茶属（Camellia) 金花茶组（Sect, chrysantha)的常绿灌木，因其花冠呈黄色而具有重要的园艺价值，被誉 为"茶花皇后"。近年来，由于栖息地的丧失，濒危物种资源的过度采集和非法出口贸易，其 自然种群急剧下降。金花茶被列为国家一级重点保护植物，IUCN红色名录中最濒危的植物 种类之一。因此，建立准确的金花茶植物鉴定方法是其生物多样性保护和研究的关键。
[0003] 单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP)是指在基因组水平 上由于单个核苷酸的转换、颠换、插入或缺失等所引起的碱基序列多态性，与其它类型分 子标记相比具有数量丰富、分布广泛、遗传稳定性高、易实现自动化分析等优势（Mochida et al.，2003)。目前SNP的检测分析方法，如：DNA直接测序法、基因芯片技术、阵列杂交 分析、高效变性液相色谱检测等（Jehan and Lakhanpaul, 2006)，但是由于技术繁琐、成本 高，限制了其应用。酶切扩增多态性（cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS) 标记是根据SNPs位点的DNA序列设计特异的PCR引物，与限制性内切酶相结合产生的一 种分子标记。但SNP恰好位于限制性酶切位点这种情况比较少，为了更有效地检测SNPs， 衍生酶切扩增多态性（derived cleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS)技 术在CAPS标记基础上通过在引物中引入错配碱基，结合SNP位点引入新的限制性内切 酶位点，从而达到酶切检测SNPs的目的（Michaels and Amasino, 1998)。dCAPS技术 自发明以来大量应用于分子遗传学及种质资源品种品系鉴定等方面研究，该技术已在水 稻（Komori and Nitta, 2005)、拟南芥（Nemri et al.，2007;Hou et al·，2010)、小麦 (Yanagisawa et al·，2003)、大麦（Shahinnia and Sayed-Tabatabaei, 2009)、葡萄（Boss and Thomas, 2002)、香蕉（P. UMALI and NAKAMURA, 2003)、山茶（张成才等，2012)等作物中 得到了广泛的应用。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种基于金花茶SNP位点建立dCAPS分子标记体系，从而快 速鉴定金花茶物种的方法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种用于鉴定金花茶的SNP分子标记，其 位于如SEQ ID NO. 1所示的金花茶GBSSI基因的第141位碱基，此处碱基为T，则鉴定为金 花茶物种。
[0006] 本发明还提供所述SNP分子标记在金花茶分子标记辅助育种中的应用。
[0007] 本发明还提供用于PCR检测金花茶的特异性引物对，包括上游引物 F5' -CTGTGGACGCAAACATCCACTTGAT-3' 和下游引物 R5' -CCATGTATTTCTTGCCAGTGCCCT-3'。
[0008] 本发明还提供一种鉴定金花茶的方法，包括以下步骤：1)提取待测植物的基因组 DNA ;2)以待测植物的基因组DNA为模板，利用上述引物F和R，PCR扩增金花茶GBSSI基因； 3)检测PCR扩增产物。
[0009] 具体地，步骤3)中采用酶切法检测PCR扩增产物，酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结 果呈现2条带，则待测植物为金花茶物种。其中，酶切使用的限制性内切酶为BstXI。
[0010] 前述方法中，25 μ L PCR反应体系中包括：添加 Mg2+的10 X EX Taq缓冲液2.5 μ L， 2. 5mM dNTPs2 μ L，10 μ M 上、下游引物各 1 μ L，5U/μ L EX Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，50 μ g/ μ L基因组DNAl μ L，余量为ddH20。
[0011] 前述方法中，PCR扩增程序为：94°C预变性5min;94°C变性30s，55°C退火30s， 72°C延伸50s，35个循环；72°C延伸10min，4°C保存。
[0012] 本发明还提供含有所述引物F和R的用于检测金花茶的试剂盒。优选所述试剂盒 还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板等中的一种或多种。
[0013] 本发明进一步提供所述引物F和R，或所述试剂盒在检测金花茶中的应用。
[0014] 本发明针对金花茶物种设计了特异性引物，能迅速将金花茶与山茶属其它近源种 区分，其中dCAPS引物的设计是将SNP转化为dCAPS分子标记的关键，通过软件设计了一系 列dCAPS上游引物，引物中错配碱基的数量、距离引物3'端的位置对分子标记的成功开发 具有重要影响。本发明选择了错配碱基数目为1个，距离3'端第6位的引物，通过PCR扩 增出目的条带，且酶切后结果与预期一致。表明错配碱基在距离引物3'端较远的位置能够 通过PCR反应顺利引入扩增产物中，从而形成专一的限制性内切酶识别位点。鉴于此方法 建立了基于SNPs的dCAPS分子标记技术鉴定金花茶物种的方法体系，从而达到可以快速、 准确检测物种特异SNPs的目的，dCAPS分子标记的成功开发，对于口岸物种检验工作及品 种资源鉴别、种质资源保护具有重大意义。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 图1为本发明实施例1中金花茶与其它近源种的GBSSI基因全序列比对结果；其 中，"表示相同的碱基，表示碱基缺失，方框标注为SNP位点，下划线序列为dCAPS引 物设计所用的目标序列。
[0016] 图2为本发明实施例1中金花茶dCAPS引物设计原理示意图；其中，下划线大写字 母表示SNP ;下划线小写字母表示引物中设置的错配碱基。
[0017] 图3为本发明实施例1中dCAPS分子标记鉴定金花茶的PCR分析结果；其中， M:DL500DNA marker;A:酶切前PCR产物，DNA片段为254bp;B:经BstXI酶切后的PCR产 物；1-17:分别对应于表1中样本号；1-7以及9-17:DNA片段大小为254bp;8:DNA片段大 小为229bp。
【具体实施方式】
[0018] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0019] 以下实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（New York:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技术规程，或按照制造 厂商所建议的实验条件。
[0020] 实施例1金花茶SNP分子标记的获得
[0021] 颗粒结合淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase I, GBSSI)是胚乳等植物 储藏器官中，合成直链淀粉的关键酶，其功能保守，在大部分植物科内是单拷贝。研究表明 在山茶属内GBSSI基因是单拷贝的，并且具有较高的序列变异率（不同物种间的变异在 5%左右），这对于研究山茶属此类具有许多近缘物种的类群的系统发育关系具有重要价值 (Yang et al.，2006)。
[0022] 1、根据杨俊波等（Yang et al.，2006)公开的GBSSI基因的引物及扩增条件，以表 1中17个山茶属物种基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物经1. 5%琼脂糖凝胶电泳 检测并在紫外凝胶成像系统观察合格后进行测序。
[0023] 表1 17个山茶属物种(基本涵盖了所有山茶属植物）
[0024]
【权利要求】
1. 用于鉴定金花茶的SNP分子标记，其特征在于，其位于如SEQ ID NO. 1所示的金花茶 GBSSI基因的第141位碱基，此处碱基为T，则鉴定为金花茶物种。
2. 权利要求1所述SNP分子标记在金花茶分子标记辅助育种中的应用。
3. 用于PCR检测金花茶的特异性引物对，其特征在于，包括上游引物 F5' -CTGTGGACGCAAACATCCACTTGAT-3' 和下游引物 R5' -CCATGTATTTCTTGCCAGTGCCCT-3'。
4. 一种鉴定金花茶的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 提取待测植物的基因组DNA ; 2) 以待测植物的基因组DNA为模板，利用权利要求3所述的特异性引物对PCR扩增金 花茶GBSSI基因； 3) 检测PCR扩增产物； 其中，金花茶GBSSI基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤3)中采用酶切法检测PCR扩增产物， 酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果呈现2条带，则待测植物为金花茶物种； 其中，酶切使用的限制性内切酶为BstXI。
6. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中25 μ L PCR反应体系中包括： 添加 Mg2+的10XEXTaq缓冲液2·5μL，2·5mMdNTPs2μL，10μM上、下游引物各lμL，5U/ μ L EX Taq DNA 聚合酶 0· 2 μ L，50 μ g/ μ L 基因组 DNA1 μ L，余量为 ddH20。
7. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)中PCR扩增程序为：94°C预变性 5min ;94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 50s，35 个循环；72°C延伸 lOmin，4°C保存。
8. 含有权利要求3所述引物对的用于检测金花茶的试剂盒。
9. 根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚 合酶、Mg2+、PCR反应缓冲液、标准阳性模板中的一种或多种。
10. 权利要求3所述引物对或权利要求8或9所述试剂盒在检测金花茶中的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104293776SQ201310300890
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2013年7月17日
【发明者】宋云, 赵竹, 徐晗 申请人:中国检验检疫科学研究院