酵素型基因芯片的侦测法
【专利摘要】一种酵素型基因芯片的侦测法，分为RNA萃取、cDNA合成、探针标志、杂交反应及讯号侦测等五个步骤，共有十七种试剂参与反应，并根据完成后的结果可观察管家基因的表现情形。藉此，透过本发明提出的侦测法，可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性的需求。
【专利说明】酵素型基因芯片的侦测法【技术领域】
[0001]本发明有关于一种酵素型基因芯片的侦测法，尤指涉及一种以十七种试剂参与基因芯片反应流程，可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现的酵素型基因芯片的侦测方法。
【背景技术】
[0002]对基因过渡表现(Overexpression)的分析已经导致疾病诊断的基本进步与临床进展。而研究基因过渡表现的技术包含有北方墨点法(Northern Blot)、反转录聚合酶链锁反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)及实时定量聚合酶链锁反应(Real-Time PCR)。其中Northern Blot由于操作步骤十分繁琐,所需检体量又过多，因此仅限于研究操作上，无法实际应用于临床诊断。至于RT-PCR及Real-Time PCR由于操作步骤简便，因此在单一基因检测的应用上，使用相当广泛，例如肝炎病毒的检测及感染症病原菌的鉴定。然而，虽然PCR序列的创作系作为整体最伟大的实验，但多数PCR技术仍保有特定的共同问题，其主要问题包含有:其一是污染，过渡灵敏侦察的伪阳性，例如雾式的DNA或先前的样品残余；其二是RT-PCR仅被认为半定量，因为当比较不同的样品时，难以控制序列放大的效率；以及其三是由于所需引子(Primer)间黏合(Annearling)的干扰，无论RT-PCR或Real-Time PCR都仅广泛应用于单一基因标的的检测，当检测标的为基因群时，则PCR相关的技术则有操作耗时、费事及高成本等缺点。
[0003]随着近几年来生物科技的快速发展，生物芯片于临床医学诊断或药效评估上的应用逐渐被重视，本发明的先前研究已开发并且评估一尼龙膜芯片(Membrane Array)方法，能使用于癌症诊断，在血液检体(Peripheral Blood)中同时查出一多种mRNA标记引物的表达水平。其分子标志的表达水平由RT-PCR与尼龙膜芯片评估，数据从RT-PCR与尼龙膜芯片取得，且受制于线性回归分析，显示在这两个方法结果之间的高度相互关系(r=0.979，P〈0.0001)。另外，以相关衍生技术的加权化学冷光型基因芯片(WeightedChemiluminescent Membrane Array, WCHMA)用于肺癌(Lung Cancer)患者的血液检体分析标的治疗药物(Target Therapeutic Drug)的作用标的K_ras的异常情形,也已被接受刊登于肺癌期刊中。
[0004]虽然尼龙膜芯片于分子诊断及药效评估上的应用已有许多报告提出，然而，由于原始尼龙膜芯片所使用判读方法上，对于每一基因在特定疾病的重要性皆等值的概念下，造成检测特异性在达到一定程度之后便不易提升。对此，本发明另外研究开发一基因群检测结构，虽可大量并快速进行生物检体检测分析，但其检测过程需先行放大，并无法达到直接从血液检测透过基因芯片就能侦测血液里的基因表现，导致在芯片检测灵敏度及方便性等方面的要求仍嫌不足；故，一般无法符合使用者于实际使用时所需。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是:针对上述现有技术的不足，提供一种可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性需求的酵素型基因芯片的侦测法。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是:一种酵素型基因芯片的侦测法，该方法至少包括下列步聚:
(A)RNA萃取步骤:取200~500 μ I欲处理的血液检体与20~50 μ I蛋白酶溶液及200~500 μ I裂解溶液混合均匀，置于45~67 V反应8~12分钟后，加入20~50 μ I磁珠溶液与300~500 μ I结合溶液混合均匀，置于20~30°C反应8~12分钟后，以磁铁固定磁珠去除反应溶液，于磁珠中加入700~1200 μ I清洗溶液混合均匀，再以磁铁固定磁珠去除清洗后的溶液，并于磁珠中加入一 20~100 μ I溶解溶液混合均匀，接着再置于56~84°C反应8~12分钟后，以磁铁固定磁珠，收集所得溶液，即为RNA溶液；
(B)cDNA合成步骤:将上述RNA溶液置于56~84°C反应8~12分钟后，加入I~5μ I引子溶液混合均匀，并置于-0.5~0.5°C反应1.5~2.5分钟，接着加入5~10 μ I反转录溶液与I~5μ I反转录酵素溶液混合均匀，置于34~50°C反应96~144分钟后,得到cDNA溶液；
(C)探针标志步骤:取10~50μ I上述cDNA溶液置于76~114°C反应4~6分钟后，降温至-0.5~0.5°C反应1.5~2.5分钟，再加入I~5 μ I标志溶液混合均匀，置于34~50°C反应192~288分钟后，取得探针溶液；
(D)杂交反应步骤:将一基因芯片置入一反应盒，加入2~8ml杂交溶液混合均匀，置于34~50°C反应8~12分钟，另将上述探针溶液置于76~114°C反应4~6分钟后，降温至-0.5~0.5°C反应1.5~2.5分钟，再将此探针溶液加入该反应盒中，置于34~50°C反应384~576分钟后，取得探针反应溶液，其中，该基因芯片选定寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量 控管依据的管家基因，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于芯片上，形成在该基因芯片上被覆有标定特定序列；以及
(E)讯号侦测步骤:将上述探针反应溶液移除，留下基因芯片于反应盒中，于反应盒中加入2~8 ml第一清洗溶液，清洗芯片4~6分钟后移除，重复两次，接着加入2~8 ml第二清洗溶液，置于34~50°C清洗4~6分钟后移除,重复两次，加入2~8 ml填补溶液，反应24~36分钟后移除，加入2~8 ml抗体溶液，反应72~108分钟后移除，加入2~8 ml第三清洗溶液,反应4~6分钟后移除,重复两次，最后加入2~8 ml呈色溶液,置于34~50°C反应直到讯号产生，之后加入水清洗，直到讯号停止继续产生，烘干后即得到侦测结果。
[0007]所述基因芯片为尼龙膜或热塑性复合材料，该热塑性复合材料为聚丙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。
[0008]所述寡核苷酸片段为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于IOmM~200mM，序列长度介于40~60碱基，并与目标基因上所具有的特殊序列呈现互补关系，该基因芯片是将该寡核苷酸溶液以30标准升以上之量，分布于芯片上，将寡核苷酸片段重复及排列，干燥后以紫外光照射固化所成。
[0009]所述步骤(A)中的蛋白酶溶液为蛋白酶K溶液。裂解溶液由4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠及聚乙二醇辛基苯基醚所组成。磁珠溶液为氧化硅基羟基磁珠。结合溶液由聚乙二醇及氯化钠所组成。清洗溶液由乙醇、丙三醇及醋酸铵所组成。溶解溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐及乙二胺四乙酸所组成。
[0010]所述步骤(B)中的引子溶液由寡核苷酸引子及随机引子所组成。反转录溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁及二硫代苏糖醇所组成。反转录酵素溶液由反转录酵素及核糖核酸酶抑制剂所组成。
[0011]所述步骤(C)中的标志溶液由随机引子、Klen Taq聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、生物素化脱氧三磷酸尿苷、Klen Taq缓冲液及丙三醇所组成。
[0012]所述步骤(D)中的杂交溶液由聚乙二醇、十二基硫酸钠及氯化钠所组成。
[0013]所述步骤(E )中的第一清洗溶液由十二基硫酸钠及柠檬酸钠所组成。第二清洗溶液为柠檬酸钠。第三清洗溶液由十二基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、及丙三醇所组成。填补溶液为阻断缓冲剂。抗体溶液为碱性磷酸酵素连结抗生物素免疫球蛋白G。呈色溶液为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑兰染色液。
[0014]如此，可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现，相较传统技术，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性的需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1是本发明的侦测流程示意图。
[0016]标号说明 11 RNA萃取步骤12 cDNA合成步骤
13探针标志步骤14杂交反应步骤
15讯号侦测步骤。
【具体实施方式】
[0017]请参阅图1所示，是本发明的侦测流程示意图。如图所示:本发明为一种酵素型基因芯片的侦测法，包括RNA萃取、cDNA合成、探针标志、杂交反应及讯号侦测等五个步骤，其间共需十七种试剂参与反应，并根据完成后的结果可观察管家基因的表现情形。于一较佳实施例中，该侦测法至少包括下列步骤:
(A)RNA萃取步骤11:先取欲处理的血液检体300 μ I与6 mAU/ml的蛋白酶K(ProteaseK)溶液30 μ I混合均匀，再与一由200 mM的4_轻乙基哌嗪乙磺酸(4_(2_ hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、400 mM 的氯化钠(Sodium Chloride)及 1% 质量浓度的聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)组成的裂解溶液300 μ I混合均匀，置于56°C反应10分钟后,加入30 μ I磁珠溶液即25 mg/ml的氧化娃基羟基磁珠混合均匀，再与一由12.5%质量浓度的聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)及2M的氯化钠组成的结合溶液400 μ I混合均匀，置于25°C反应10分钟后，以磁铁固定磁珠去除反应溶液后，于磁珠中加入一由70%质量浓度的乙醇(Ethanol )、1%质量浓度的丙三醇(Glycerin)及IOOmM的醋酸铵(Ammonium Acetate)组成的清洗溶液900 μ I混合均匀，再以磁铁固定磁珠去除清洗后的溶液，并于磁珠中加 入由20 mM的三轻甲基氨基甲烧盐酸盐(Tris-Hydrogen Chloride,Tris-HCl)及 I mM 的乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic Acid, EDTA)组成的溶解溶液80 μ I混合均匀，接着再置于70°C反应10分钟后，以磁铁固定磁珠，收集所得溶液，即为RNA溶液；
(B)cDNA合成步骤12:将上述RNA溶液置于70°C反应10分钟后，加入一由300ng/ul的寡核苷酸引子(dT primer)及100ng/ul的随机引子(Random primer)组成的引子溶液3 μ I混合均匀，并置于0°C反应2分钟，接着加入由250mM的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、375mM 的氯化钾(Potassium Chloride, KCl)、15mM 的氯化续(Magnesium Chloride, MgCl)及100 mM的二硫代苏糖醇(Dithiothreitol, DTT)组成的反转录溶液8 μ I混合均匀，再与一由200unit的反转录酵素(Reverse Transcriptase MMLV)及25unit的核糖核酸酶抑制剂(Ribonuclease Inhibitor)组成的反转录酵素溶液4 μ I混合均匀，置于42°C反应120分钟后，取得cDNA溶液；
(C)探针标志步骤13:将上述cDNA溶液40 μ I置于95°C反应5分钟后，再置于0°C反应2分钟，之后加入一由80 ng/ml的随机引子、2 U/ul的Klen Taq聚合酶(KlenTaq Polymerase)、ImM 的脱氧腺苷三憐酸(Deoxyadenosine Triphosphate, dATP)、ImM的脱氧胞苷三磷酸(Deoxycytidine Triphosphate, dCTP)、lmM的脱氧鸟苷三磷酸(Deoxyguanosine Triphosphate, dGTP)、0.6mM 的脱氧胸苷三憐酸(DeoxythymidineTriphosphate, dTTP)、0.4mM的生物素化脱氧三磷酸尿苷(Biotin_dUTP)、20%质量浓度的Klen Taq缓冲液(Klen Taq Buffer)及20%质量浓度的丙三醇组成的标志溶液4 μ I混合均匀，置于42°C反应240分钟后,取得探针溶液；
(D)杂交反应步骤14:将一基因芯片置入一反应盒，加入由10%质量浓度的聚乙二醇(Polyethylene Glycol)、10% 质量浓度的十二基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS)及2 M的氯化钠组成的杂交溶液6ml混合均匀，置于42°C反应10分钟，另将上述探针溶液置于95°C反应5分钟后，再置于0°C反应2分钟，之后将此探针溶液加入该反应盒中，置于42°C反应480分钟后,取得探针反应溶液；以及 (E)讯号侦测步骤15:将上述探针反应溶液移除，留下基因芯片于反应盒中，于反应盒中加入由0.5%质量浓度的十二基硫酸钠及0.05 X的柠檬酸钠(Saline Sodium Citrate,SSC) (SSC溶液的标准浓度标示是为「倍」，英文标示为X，一般库存的SSC是20X，「第一清洗溶液」中含有SSX的浓度是0.05X，表示要稀释400倍体积，下面提及的2 X表示要稀释10倍。)组成的第一清洗溶液6 ml，清洗芯片5分钟后移除，重复两次。继之，加入2 X的柠檬酸钠作为第二清洗溶液6ml，置于42°C清洗芯片5分钟后移除，重复两次。接着，加入1.5%质量浓度的阻断缓冲剂(Blocking Reagent)作为填补溶液6 ml,反应30分钟后移除，再加入一 0.7 ug/ml的碱性磷酸酵素连结抗生物素免疫球蛋白G (AlkalinePhosphatase-conjugated IgG Ant1-Biotin)作为抗体溶液 6 ml,反应 90 分钟后移除，之后加入由I %质量浓度的十二基硫酸钠、1%质量浓度的聚乙二醇辛基苯基醚、及1%质量浓度的丙三醇组成的第三清洗溶液6 ml，反应5分钟后移除，重复两次。最后加入5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑兰染色液(BCIP/NBT SoIution)作为呈色溶液，置于42°C反应直到讯号产生，之后加入水清洗，直到讯号停止继续产生，于烘干后即得到侦测结果。
[0018]上述步骤(D)所提的基因芯片可为尼龙膜(Nylon membrane)或热塑性复合材料等可让核苷酸附着于其上的材料，其中该热塑性复合材料并可为聚丙烯(Polypropylene,PP)或聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl Methacrylate, PMMA)。该基因芯片选定一寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量控管依据的管家基因(Housek^ping Gene)，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于芯片上，形成在该基因芯片上被覆有标定特定序列。其中，该寡核苷酸片段为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于IOmM~200mM，序列长度介于40~60喊基,并与目标基因上所具有的特殊序列呈现互补的关系。该基因芯片系将该寡核苷酸溶液以30标准升(nL)以上之量，分布于芯片基质上，并以现有规划的方式将寡核苷酸片段重复及排列，干燥后以紫外光照射固化，结束后即完成基因芯片的制作。
[0019]藉此，透过本发明提出的酵素型基因芯片的侦测法，可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现，相较传统技术，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，达到一次满足高灵敏度及便利性的需求。
[0020]综上所述，本发明的一种酵素型基因芯片的侦测法，可有效改善现有技术的种种缺点，可于临床检验检查时，不需进行放大，直接从血液检测，透过基因芯片就可以检测血液里的基因表现，相较传统技术，具有较高的灵敏度及较佳的方便性，能达到一次满足高灵敏度及便利性的需求，进而使本发明的产生能更进步、更实用、更符合使用者所须，确已符合发明专利申请的要件，依法提出专利申请。
[0021]惟以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围。故，凡依本发明申请专利范围及发明说明书内容所作的简单的等效变化与修饰，皆应仍属本发明专利涵盖的范 围内。
【权利要求】
1.一种酵素型基因芯片的侦测法，其特征在于，该方法至少包括下列步聚: (A)RNA萃取步骤:取200~500 μ I欲处理的血液检体与20~50 μ I蛋白酶溶液及200~500 μ I裂解溶液混合均匀，置于45~67 V反应8~12分钟后，加入20~50 μ I磁珠溶液与300~500 μ I结合溶液混合均匀，置于20~30°C反应8~12分钟后，以磁铁固定磁珠去除反应溶液，于磁珠中加入700~1200 μ I清洗溶液混合均匀，再以磁铁固定磁珠去除清洗后的溶液，并于磁珠中加入一 20~100 μ I溶解溶液混合均匀，接着再置于56~84°C反应8~12分钟后，以磁铁固定磁珠，收集所得溶液，即为RNA溶液； (B)cDNA合成步骤:将上述RNA溶液置于56~84°C反应8~12分钟后，加入I~5μI引子溶液混合均匀，并置于-0.5~0.5°C反应1.5~2.5分钟，接着加入5~10 μ I反转录溶液与I~5μ I反转录酵素溶液混合均匀，置于34~50°C反应96~144分钟后,得到cDNA溶液； (C)探针标志步骤:取10~50μ I上述cDNA溶液置于76~114°C反应4~6分钟后，降温至-0.5~0.5°C反应1.5~2.5分钟，再加入I~5 μ I标志溶液混合均匀，置于34~50°C反应192~288分钟后，取得探针溶液； (D)杂交反应步骤:将一基因芯片置入一反应盒，加入2~8ml杂交溶液混合均匀，置于34~50°C反应8~12分钟，另将上述探针溶液置于76~114°C反应4~6分钟后，降温至-0.5~0.5°C反应1.5~2.5分钟，再将此探针溶液加入该反应盒中，置于34~50°C反应384~576分钟后，取得探针反应溶液，其中，该基因芯片选定寡核苷酸片段，并以两个作为基因芯片反应质量控管依据的管家基因，将此包含多种目标基因的寡核苷酸片段固着于芯片上，形成在该基因芯片上被覆有标定特定序列；以及 (E)讯号侦测步骤:将上述探针反应溶液移除，留下基因芯片于反应盒中，于反应盒中加入2~8 ml第一清洗溶液，清洗芯片4~6分钟后移除，重复两次，接着加入2~8 ml第二清洗溶液，置 于34~50°C清洗4~6分钟后移除,重复两次，加入2~8 ml填补溶液，反应24~36分钟后移除，加入2~8 ml抗体溶液，反应72~108分钟后移除，加入2~8 ml第三清洗溶液,反应4~6分钟后移除,重复两次，最后加入2~8 ml呈色溶液,置于34~50°C反应直到讯号产生，之后加入水清洗，直到讯号停止继续产生，烘干后即得到侦测结果。
2.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述基因芯片为尼龙膜或热塑性复合材料，该热塑性复合材料为聚丙烯或聚甲基丙烯酸甲酯。
3.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述寡核苷酸片段为人工合成的寡核苷酸溶液，其浓度介于IOmM~200mM,序列长度介于40~60碱基，并与目标基因上所具有的特殊序列呈现互补关系，该基因芯片是将该寡核苷酸溶液以30标准升以上之量，分布于芯片上，将寡核苷酸片段重复及排列，干燥后以紫外光照射固化所成。
4.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(A)中的蛋白酶溶液为蛋白酶K溶液。
5.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(A)中的裂解溶液由4-羟乙基哌嗪乙磺酸、氯化钠及聚乙二醇辛基苯基醚所组成。
6.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(A)中的磁珠溶液为氧化硅基羟基磁珠。
7.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(A)中的结合溶液由聚乙二醇及氯化钠所组成。
8.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(A)中的清洗溶液由乙醇、丙三醇及醋酸铵所组成。
9.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(A)中的溶解溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐及乙二胺四乙酸所组成。
10.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(B)中的引子溶液由寡核苷酸引子及随机引子所组成。
11.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(B)中的反转录溶液由三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、氯化钾、氯化镁及二硫代苏糖醇所组成。
12.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(B )中的反转录酵素溶液由反转录酵素及核糖核酸酶抑制剂所组成。
13.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(C)中的标志溶液由随机引子、KlenTaq聚合酶、脱氧腺苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、生物素化脱氧三磷酸尿苷、Klen Taq缓冲液及丙三醇所组成。
14.如权利要求1所述的酵素型基因芯`片`侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(D)中的杂交溶液由聚乙二醇、十二基硫酸钠及氯化钠所组成。
15.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(E)中的第一清洗溶液由十二基硫酸钠及柠檬酸钠所组成。
16.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(E)中的第二清洗溶液为柠檬酸钠。
17.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(E)中的第三清洗溶液由十二基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、及丙三醇所组成。
18.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(E)中的填补溶液为阻断缓冲剂。
19.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(E)中的抗体溶液为碱性磷酸酵素连结抗生物素免疫球蛋白G。
20.如权利要求1所述的酵素型基因芯片侦测试剂组的侦测法，其特征在于，所述步骤(E)中的呈色溶液为5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-氯化硝基四氮唑兰染色液。
【文档编号】C12Q1/68GK103849679SQ201310300440
【公开日】2014年6月11日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2012年11月28日
【发明者】吴昌翰, 林绣茹, 刘雪娇 申请人:康隽生物科技股份有限公司, 辅英科技大学附设医院