专利名称：Glp-1类似物的反相hplc纯化的制作方法
技术领域：
本发明涉及人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)类似物的纯化，特别涉及用于纯化具有SEQ ID N0.1 的氨基酸序列的 GLP-1 类似物的方法:His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser_Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Aib-Arg-NH2,其中，这些氨基酸中的26个氨基酸是天然L构型，而4个氨基酸是非手性构型。Aib表示通过反相高效液相层析(RP-HPLC)纯化的人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的α-氨基异丁酸类似物。该肽也称为(Aib8，35)GLP-1(7-36)NH2，并在PCT公布TO 2000/34331 中描述了其药物用途及其通过固相肽合成(SPPS)的制备。
背景技术：
可遵循这样的混合方法合成GLP-1类似物，所述混合方法包括固相肽合成(SPPS)和溶液中的片段偶联。例如，PCT公布WO 2007/147816描述了通过制备三条片段并在溶液中偶联这些片段来制备(Aib8’35)GLP-1 (7-36)NH2。各合成步骤一般是高选择性的，然而，在多步化学合成结束时，产物通常不纯，不足以用作药物。因此，粗产品可以经过反向高效液相层析(RP-HPLC)来进一步纯化肽并获得96至99%(面积)范围内的纯度。经RP-HPLC阶段后，通常获得一般具有I到15%(w/w)肽浓度的溶液形式的产物。`为了获得适合于药物制剂的干燥终产物，溶液可以进行沉淀、冻干或喷雾干燥技术。已在本领域广泛描述了用于人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)的RP-HPLC纯化。例如根据PCT公布WO 2007/147816, GLP-1类似物进行了两步RP-HPLC方法；在pH 2下进行第一步层析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和少量TFA组成的混合物A和由四氢呋喃(15%)、乙腈(70%)、水(15%)和少量TFA组成的混合物B作为流动相，并且在pH 8.8下进行第二步层析，其利用由乙腈(15%)、水(85%)和乙酸铵缓冲液组成的混合物A，和由含四氢呋喃(15%)、乙腈(60%)、水(25%)和乙酸铵缓冲液组成的混合物B作为流动相。由于四氢呋喃倾向于形成过氧化物，因此在大规模上洗脱液对于RP-HPLC是至关重要的。EP-Bl 1664 109公开了利用pH缓冲的醇，特别是乙醇作为洗脱剂来纯化胰高血糖素样肽的RP-HPLC方法，由此pH值范围可以设定在pH 4和pH 10之间，但不能与pH设定点差别超过+/_1.0pH单位。为了获得所需纯度，因此本方法需要严格的pH控制。然而，发现以乙醇作为洗脱剂时，无法获得想要的纯度，特别是无法有效去除杂质des-Ser17, Ser18-[Aib8’35]hGLP-1 (7-36)NH2。
因此，本发明的目标在于开发RP-HPLC方法，其在技术规模上易于应用，并且在溶剂方面安全并能够提供具有极好纯度的GLP-1溶液。发明详述发现利用如下文概述的本发明的方法能够实现该目标。应用反向高效液相层析(RP-HPLC)纯化GLP-1肽类似物的方法包括以水性缓冲液和有机溶剂的混合物用于洗脱的第一个和第二个层析步骤，其特征在于用于第二个层析步骤的有机溶剂为乙腈并且用PH值在8.0至11.0之间的碱性缓冲液进行第二步层析。水性缓冲液为含防止pH变化的缓冲剂的水溶液。根据所用的缓冲剂，该缓冲液可以是酸性的或碱性的。术语“GLP-1肽类似物”包含天然人胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)类似物GLP-1 (7-37)和 GLP-1 (7-36) NH2 和 GLP-1 肽的合成类似物(GLP-1 类似物)。优选的GLP-1类似物为具有根据SEQ ID N0.1的氨基酸序列的人GLP-1类似物:His-Aib-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-1Ie-Ala-Trp-Leu-Val-LyS-Aib-Arg-NH2,即(Aib8，35)GLP-1(7-36)NH2，和如 PCT 公布 WO 2000/34331 中描述的其它类似物。特别感兴趣的是(Aib8’35)GLP-1 (7-36)NH2。短的形式指通过缺失I至6位氨基酸残基、在C末端酰胺化并由α-氨基异丁酸(Aib)取代第8位(Ala)和第35位(Gly)中天然存在的氨基酸残基而在形式上来源于天然人GLP-1 (1-37)的类似物。GLP-1 肽的合适的类似物还可以选自 GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36) NH2, (Gly8)GLP-1 (7-37)、(Gly8) GLP-1 (7-36)、(Ser34) GLP-1 (7-37), (Val8) GLP-1 (7-37), (Val8, Glu22)GLP-1 (7-37)、(N- ε - ( Y -Glu (N- α -十六酰基)))-Lys26Arg34-GLP-1 (7-37) (Liraglutide)和D-Ala8Lys37-(2-(2-(2-马来酰亚胺基丙酰氨基(乙氧基)乙氧基)乙酰胺))GLP-1(7-37)(CJC-1131)。GLP-1肽的又一类似物可以是选自以下的exendin类似物:exendin_3、具有根据SEQ ID N0.2:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH2的氨基酸序列的exendin_4(依泽那太)exendin-4 酸、exendin-4 (1-30)、exendin-4 (1-30)酉先胺、exendin-4 (1-28)、exendin-4 (1-28)酉先胺、14Leu, 25Phe exendin-4 酉先胺和 14Leu, 25Pheexendin_4 (1-28)酉先胺以及AVE-0010，其为具有根据SEQ ID N0.3的氨基酸序列的exendin类似物:His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-AIa-Val-Arg-Leu-Phe-1le-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Ser-Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_LyS-NH2 ο附1a: (Aib8，35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步层析的 RP-HPLC 层析图；20mM 乙酸铵，ρΗ=9.2 ；Kromasil C18 100-16 ;乙醇(100%)。
图1b: (Aib8，35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步层析的 RP-HPLC 层析图；20mM 乙酸铵，ρΗ=9.5 ；Kromasil C18 100-16 ;乙腈(100%)。
与图la)相比，用乙腈作为洗脱剂有效地去除了杂质des-Ser17，Ser18-[Aib8'35]hGLP-1(7-36)NH2。图2a: (Aib8'35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步层析的 RP-HPLC 层析图；20mM 乙酸铵，pH=9.5 ；Kromasi I C18 100-16 ;乙腈(100%)。图2b: (Aib8'35)GLP-1 (7-36)NH2 的第二步层析的 RP-HPLC 层析图；20mM 乙酸铵，pH=9.5 ； Kromasi I C18 100-16 ;乙腈/甲基叔丁基醚(95:5 v:v)。使用甲基叔丁基醚作为有机改性剂可增加纯度和产率。本发明的具体实施方案如下概述。如上概述，用乙腈作为有机溶剂并使用pH在8.0至11.0之间，更特别pH在9.0至10.0之间并且甚至更特别pH为9.5+/-0.2的碱性缓冲液进行第二个层析步骤。在本发明的具体实施方案中，将乙腈与甲基叔丁基醚混合作为有机改性剂。合适地应用99/1 (v/v)至 80/20 (v/v)，特别为 97.5/2.5 (v/v)至 90/10 (v/v)，甚至更特别为95/5 (v/v)的乙腈/甲基叔丁基醚混合物。碱性缓冲液可选自本领域技术人员公知的商品化缓冲液。发现乙酸铵或碳酸氢铵尤其合适。缓冲液浓度可在10至25mM范围内变化，由此优选20mM的缓冲液浓度。用乙腈作为有机溶剂和pH在1.0至4.0之间，更特别pH在2.0至3.0之间并且甚至更特别pH在2.3至2.5之间，最特别pH为2.5的酸性缓冲液进行第一个层析步骤。酸性缓冲液可选自本领域技术人员公知的商品化缓冲液。发现磷酸铵尤其合适。缓冲液浓度可在100至400mM范围内变化，由此优选300mM的缓冲液浓度。使用硅胶吸着剂作为固定相方便地进行RP-HPLC。合适的娃胶类型可选自但不限于以下娃胶吸着剂:Kromasil C18100 - 16、Kromasi1 C18 100 - 10、Kromasil C8 100 - 16、Kromasil C4 100 - 16、KromasiI Phenyl 100 - 10、KromasiI C18Eternity 100 - 5、KromasiI C4 Eternity 100 - 5、Chromatorex C18SMB 100-15 HE,Chromatorex C8 SMB 100-15 HE,Chromatorex C4 SMB100-15 HE、Daisopak SP 120-15 ODS-AP, Daisopak SP120-10-C4_Bio、Daisopak SP200-10-C4-Bio、Zeosphere C18100-15、Zeosphere C8 100-15,Zeosphere C4 100-15、SepTech ST150-10 C18、Luna C18 100-10、Gemini C18 110-10、YMC Triart C18120-5 和YMC Triart C8 200-10。发现上文列出的Kromasil 硅胶类型尤其合适。或者，可使用基于聚合物的固定相进行RP-HPLC。合适的聚合物相可选自但不限于PLRP-S 100-10 或 Amberchrom Profile XT20。用流动相梯度进行第一个和第二个层析步骤的RP-HPLC，所述流动相梯度通常开始于较低浓度的有机溶剂并经洗脱时间后结束于较高浓度的有机溶剂。洗脱参数如事件时间、流动相梯度和上样方面可由本领域技术人员更改，以优化纯化过程。如PCT 公布 WO 2007/147816 所描述，任选地将含纯化的(Aib8，35)GLP_1 (7-36)NH2的级分浓缩并随后冻干。或者，可通过本领域技术人员公知的沉淀或喷雾干燥技术从RP-HPLC 级分中分离纯化的(Aib 8，35)GLP-1 (7-36)NH20以下实施例将更详细地说明本发明的方法而不限制其范围。实施例实施例A:肽的制备可以根据WO 2007/147816和WO 2009/074483中描述的方法，通过产生三条片段并在溶液中偶联这些片段来制备粗肽(Aib8，35)GLP-1 (7-36)NH2。纯化包括在pH 2.5的第一步层析纯化，及随后在pH 9.5的第二步层析纯化。实施例BI:RP-HPLC 技术参数:
权利要求
1.应用反向高效液相层析(RP-HPLC)纯化GLP-1肽类似物的方法，所述方法包括用水性缓冲液和有机溶剂的混合物进行洗脱的第一个和第二个层析步骤，其特征在于用于第二个层析步骤的有机溶剂为乙腈并且使用pH在8.0至11.0之间的碱性缓冲液进行第二步层析。
2.权利要求1的方法，其特征在于乙腈还与甲基叔丁基醚混合作为有机改性剂。
3.权利要求2的方法，其特征在于使用99/1(v/v)至80/20(v/v)的乙腈/甲基叔丁基醚的混合物。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其特征在于所述碱性缓冲液选自乙酸铵或碳酸氢铵。
5.权利要求1至4中任一项的方法,其特征在于以IOmMol至25mMol的浓度使用所述碱性缓冲液。
6.权利要求1的方法，其特征在于第一个层析步骤的水性有机溶剂为乙腈并且使用pH在1.0至4.0之间的酸性缓冲液进行第一步层析。
7.权利要求6的方法，其特征在于所述酸性缓冲液为磷酸铵。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其特征在于使用硅胶吸着剂作为固定相进行所述RP-HPLC。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述GLP-1肽类似物选自由GLP-1 (7-37)、GLP-1 (7-36) NH2、(Gly8)GLP-1 (7-37) , (Gly8)GLP-1 (7-36) , (Ser34)GLP-1 (7-37)、(Val8)GLP-1 (7-37)、(Val8, Glu22) GLP-1 (7-37), (Aib8’35) hGLP—1 (7_36) NH2.、(N- ε - ( y -Glu (N- α -十六酰基)))-Lys26Arg34-GLP-1 (7-37)、D-Ala Lys- (2_ (2_ (2-马来酸亚胺基丙酸氨基(乙氧基)乙氧基)乙酸胺))GLP-1 (7-37)、exendin-3、exendin-4、exendin-4 酸、exendin-4 (1-30)、exendin-4 (1-30)酉先胺、exendin-4 (1-28)、exendin-4 (1-28)酸胺、14Leu, 25Phe exendin-4 酸胺和 14Leu, 25Phe exendin-4 (1-28)酸胺和 AVE-OO10。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述GLP-1肽类似物为(Aib8，35)hGLP-l(7-36)NH2。
11.用权利要求1至10的方法可以获得的GLP-1肽类似物。
全文摘要
本发明包括应用反相高效液相层析(RP-HPLC)来纯化GLP-1肽类似物的方法。
文档编号C07K14/605GK103080128SQ201180029074
公开日2013年5月1日 申请日期2011年6月17日 优先权日2010年6月21日
发明者C·卡尔, M·罗特, C·萨拉丁, D·斯特鲁布, F·维克斯 申请人:益普生制药股份有限公司