本发明涉及一种活菌计数方法，具体涉及一种氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，属于微生物菌种培养领域。
背景技术：
氧化硫硫杆菌(thiobacillusthiooxidans，t.t)是一种化能无机自养型细菌，它能够以单质硫为能源进行生长，在微生物脱硫以及生物选矿中有着重要作用。由于该自养型硫杆菌能将单质硫或硫化物氧化成为硫酸，因此氧化硫硫杆菌在利用微生物方法从硫矿石中过滤金属时起着非常重要的作用。
在利用自养型硫杆菌进行的微生物选矿过程中，很大一部分硫细菌会被吸附在矿石表面上，也就是说这一部分细菌会直接接触在硫表面上。传统的工艺中用于直接测定溶液中游离细菌的方法并不能用来测定吸附在硫矿石表面的细菌数目。
实际上，吸附在固体表面的细菌的数目是很难估算的。有很多学者利用lowry的总蛋白含量测定方法来测定硫矿石上吸附的细菌含量，然而，这种方法对菌体浓度是有一定限制的，它要求菌体浓度要很高，在实际应用中这一点是很难实现的。另外的一些方法，例如荧光检测法以及sem法，要求在硫粉表面直接进行检测，这种测定方法的应用要求有高精密的仪器，在有些时候是很难达到的。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，测定活菌数目的可靠性高，操作过程简单、方便。
为了实现上述目的，本发明采用一种氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，具体包括以下步骤，
1)培养液的配制：按照尿素0.5-0.8g/l、硫酸镁0.3-0.6g/l、磷酸二氢钾0.8-1.2g/l、单质硫粉15-25g/l的用量，加入去离子水配制菌体培养液；
2)接种：向步骤1)的培养液中接种需要计数的氧化硫硫杆菌5ml；
3)培养：在小型发酵罐中培养20-30小时；
4)测定：培养结束后，取10ml发酵液，测定发酵液中的脲酶活性；
5)活菌数目测定：由于一个脲酶酶活单位对应需计数接种液中3.7×109个氧化硫硫杆菌，因此利用下式计算接种液中的氧化硫硫杆菌活菌数目：
氧化硫硫杆菌数＝3.7×109×脲酶酶活力单位u。
作为改进，所述步骤3)中的培养温度为37℃，通气量为3.5l\min。
作为改进，所述步骤4)中测定脲酶活性，具体包括以下操作：
取10ml发酵液在7200r/min条件下离心20min，将上清液倒掉取沉淀用蒸馏水冲洗并离心四次，充分洗掉与菌体黏附的氨离子，离心后用漩涡振荡器混匀，再用超声波破碎菌体，破碎后摇匀，摇匀后用玻氏比色法测定脲酶活力。
作为改进，所述超声波为200w，超声时间为2min，间歇处理3次。
作为改进，所述步骤1)中采用尿素0.6g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，单质硫粉20g/l的用量。
本发明的原理是基于氧化硫硫杆菌可以利用尿素诱导产生诱导性脲酶，并发现这种脲酶为胞内酶，存在于氧化硫硫杆菌的细胞内，因此可以通过培养并测定发酵液中脲酶活力来间接计算出接种液中氧化硫硫杆菌活菌的数目。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1)本发明采用尿素、硫酸镁、磷酸二氢钾、单质硫粉和去离子水配制培养液，通过尿素诱导产生诱导性脲酶，然后通过培养并测定发酵液中脲酶活力间接计算出接种液中氧化硫硫杆菌活菌的数目。
2)本发明采用间接测量氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，遵循典型的活菌计数，实验结果可靠性强。
3)本发明提供的间接测量氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，解决了传统的工艺中不能测定吸附在硫矿石表面的细菌数目的技术难题，推动了相关科研的技术进步。
4)本发明的活菌计数方法，采用的原料易得、成本低，培养液配制方便；各步骤易操作，易实现。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过实施例，对本发明进行进一步详细说明。但是应该理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限制本发明的范围。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术术语和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一种氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，具体包括以下步骤，
1)培养液的配制：按照尿素0.5-0.8g/l、硫酸镁0.3-0.6g/l、磷酸二氢钾0.8-1.2g/l、单质硫粉15-25g/l的用量，加入去离子水配制菌体培养液；
2)接种：向步骤1)的培养液中接种需要计数的氧化硫硫杆菌5ml；
3)培养：在小型发酵罐中培养20-30小时；
4)测定：培养结束后，取10ml发酵液，测定发酵液中的脲酶活性；
5)活菌数目测定：由于一个脲酶酶活单位对应需计数接种液中3.7×109个氧化硫硫杆菌，因此利用下式计算接种液中的氧化硫硫杆菌活菌数目：
氧化硫硫杆菌数＝3.7×109×脲酶酶活力单位u。
其中，一个脲酶酶活单位对应需计数接种液中3.7×109个氧化硫硫杆菌，是根据每次接种之前用血球计数板法测定接种液中氧化硫硫杆菌数目，测定得到氧化硫硫杆菌数和脲酶活性成线性关系，线性公式为氧化硫硫杆菌数＝3.7×109×脲酶酶活力单位u。
作为实施例的改进，所述步骤3)中的培养温度为37℃，通气量为3.5l\min。
所述步骤4)中测定脲酶活性，具体包括以下操作：取10ml发酵液在7200r/min条件下离心20min，将上清液倒掉取沉淀用蒸馏水冲洗并离心四次，充分洗掉与菌体黏附的氨离子，离心后用漩涡振荡器混匀，再用超声波破碎菌体，破碎后摇匀，摇匀后用玻氏比色法测定脲酶活力。其中，在常压，温度为37℃、ph为5.8的条件下，每1min分解底物尿素产生1μmol的氨定义为一个酶活单位(u)。通过步骤4)测得的吸光值可以计算出脲酶活性。
作为实施例的改进，所述超声波为200w，超声时间为2min，间歇处理3次。
作为实施例的改进，所述步骤1)中采用尿素0.6g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，单质硫粉20g/l的用量。
实施例一
选取需要计数的氧化硫硫杆菌样品一，采用血球计数板法测定其菌数为4.98×107个。
采用本发明提供的一种氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，具体包括以下步骤，
1)培养液的配制：按照尿素0.5g/l、硫酸镁0.3g/l、磷酸二氢钾0.8g/l、单质硫粉15g/l的用量，加入去离子水配制菌体培养液；
2)接种：向步骤1)的培养液中接种需要计数的氧化硫硫杆菌5ml；
3)培养：在小型发酵罐中培养20小时，培养温度为37℃，通气量为3.5l\min；
4)测定：培养结束后，取10ml发酵液在7200r/min条件下离心20min，将上清液倒掉取沉淀用蒸馏水冲洗并离心四次，充分洗掉与菌体黏附的氨离子，离心后用漩涡振荡器混匀，再用超声波破碎菌体，所述超声波为200w，超声时间为2min，间歇处理3次，超声破碎后摇匀，摇匀后用玻氏比色法测定脲酶活力；
5)活菌数目测定：由于一个脲酶酶活单位对应需计数接种液中3.7×109个氧化硫硫杆菌，因此利用下式计算接种液中的氧化硫硫杆菌活菌数目：
氧化硫硫杆菌数＝3.7×109×脲酶酶活力单位u。
按照上述方法接种、培养，间接测定出其氧化硫硫杆菌数量为4.979×107个。
实施例二
需要计数的氧化硫硫杆菌样品二，血球计数板法测定其菌数为8.42×1010个。
采用本发明提供的一种氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，具体包括以下步骤，
1)培养液的配制：按照尿素0.6g/l，硫酸镁0.5g/l，磷酸二氢钾1g/l，单质硫粉20g/l的用量，加入去离子水配制菌体培养液；
2)接种：向步骤1)的培养液中接种需要计数的氧化硫硫杆菌5ml；
3)培养：在小型发酵罐中培养24小时，培养温度为37℃，通气量为3.5l\min；
4)测定：培养结束后，取10ml发酵液在7200r/min条件下离心20min，将上清液倒掉取沉淀用蒸馏水冲洗并离心四次，充分洗掉与菌体黏附的氨离子，从而消除发酵液中氨离子对脲酶活性的影响，离心后用漩涡振荡器混匀，再用超声波破碎菌体，所述超声波为200w，超声时间为2min，间歇处理3次，超声破碎后摇匀，摇匀后用玻氏比色法测定脲酶活力，其中，在常压，温度为37℃、ph为5.8的条件下，每1min分解底物尿素产生1μmol的氨定义为一个酶活单位(u)，通过步骤4)测得的吸光值可以计算出脲酶活性；
5)活菌数目测定：由于一个脲酶酶活单位对应需计数接种液中3.7×109个氧化硫硫杆菌，因此利用下式计算接种液中的氧化硫硫杆菌活菌数目：
氧化硫硫杆菌数＝3.7×109×脲酶酶活力单位u。
按照上述方法接种、培养，间接测定出其氧化硫硫杆菌数量为8.4202×1010个。
实施例三
需要计数的氧化硫硫杆菌样品三，血球计数板法测定其菌数为3.16×1018个。
采用本发明提供的一种氧化硫硫杆菌的活菌计数方法，具体包括以下步骤，
1)培养液的配制：按照尿素0.8g/l、硫酸镁0.6g/l、磷酸二氢钾1.2g/l、单质硫粉25g/l的用量，加入去离子水配制菌体培养液；
2)接种：向步骤1)的培养液中接种需要计数的氧化硫硫杆菌5ml；
3)培养：在小型发酵罐中培养30小时，培养温度为37℃，通气量为3.5l\min；
4)测定：培养结束后，取10ml发酵液在7200r/min条件下离心20min，将上清液倒掉取沉淀用蒸馏水冲洗并离心四次，充分洗掉与菌体黏附的氨离子，从而消除发酵液中氨离子对脲酶活性的影响，离心后用漩涡振荡器混匀，再用超声波破碎菌体，所述超声波为200w，超声时间为2min，间歇处理3次，超声破碎后摇匀，摇匀后用玻氏比色法测定脲酶活力，其中，在常压，温度为37℃、ph为5.8的条件下，每1min分解底物尿素产生1μmol的氨定义为一个酶活单位(u)，通过步骤4)测得的吸光值可以计算出脲酶活性；
5)活菌数目测定：由于一个脲酶酶活单位对应需计数接种液中3.7×109个氧化硫硫杆菌，因此利用下式计算接种液中的氧化硫硫杆菌活菌数目：
氧化硫硫杆菌数＝3.7×109×脲酶酶活力单位u。
按照上述方法接种、培养，间接测定出其氧化硫硫杆菌数量为3.16×1018个。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。