专利名称：极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法
技术领域：
本发明涉及一种基于同源重组原理的基因敲除方法，尤其涉及一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除方法。
背景技术：
极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans,简称 A. ferrooxidans)是一类典型的专性化能自养细菌，能够从亚铁离子0 2+)及还原性硫化合物(RISCs)的氧化过程中获得能量进行生长，是目前硫化矿生物冶金应用中的优势高效浸矿菌种，同时也是研究浸矿微生物铁、硫氧化代谢机制的模式菌。但是，A. ferrooxidans 专性自养，生长十分缓慢，细胞得率低，遗传操作非常困难，极大地限制了 A. ferrooxidans 的基础研究和工业应用，因此有必要对其进行遗传改造。发明人的实验室在国际上率先建立了大肠杆菌一极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的接合转移系统(J B Peng, W M Yan, and X Z Bao.，J Bacteriol. 1994 May ；176(10) 2892 2897.)，并实现了 A. ferrooxidans中以质粒形式携带外源基因进行表达(Ji-Bin Peng, Wang-Ming Yan, and Xue-Zhen Bao. , Appl Environ Microbiol. 1994 July ；60 (7) 沈53 沈56.)。基于这一策略，成功地实现了对A. ferrooxidans的遗传改造，提高了其外源有机质利用能力和重金属抗性。但是由于在A. ferrooxidans生长的pH < 2. 0的极端酸性条件下，能稳定有效地发挥作用的抗生素种类非常少(目前仅卡那霉素和链霉素)， 在A. ferrooxidans中能够进行自主复制的广泛宿主范围特性质粒分子量大，拷贝数少，质粒的稳定性也有限，不能同时改造多个性状，而且质粒携带的抗性基因的使用不利于生物安全，也无法实现工业应用。因此，有必要建立更稳定的染色体水平的遗传操作——基因敲除。基因敲除技术是研究基因功能、改造遗传性状的重要手段，目前已经在各种模式生物中得到广泛的应用。但是由于遗传操作非常困难，在嗜酸性硫杆菌属中仅有两例报道，其中一例是极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Zhenying Liu, Nicolas Guiliani, Corinne Appia-Ayme,Frangoise Borne, Jeanine Ratouchniak, and Violaine Bonnefoy, J Bacteriol. 2000 April ； 182 (8) :2269 2276.)，另一例是该属中的极端嗜酸性喜温硫杆菌(Leonardo J. van Zyl, Jolanda Μ. van Munster, and Douglas Ε· Rawlings, Appl Environ Microbiol. 2008 September ；74 (18) :5686 5694.)。这两例基因敲除方法不仅效率低，而且都是通过同源重组标记替换，在靶基因内部插入抗性基因的方式实现的。这种方式虽然可以使靶基因丧失功能，但是由于每敲除一个基因会使一种抗性基因保留在染色体上，因此带来了诸多不便之处，如抗生素的使用以及多位点敲除的限制等。
发明内容
针对以上A. ferrooxidans中质粒载体的不稳定性，较少种类抗生素的可使用性， 已有敲除方法中抗生素抗性基因的残留，不便进行多基因敲除研究的问题，本发明提供了一种基于同源重组原理的A. ferrooxidans无标记基因敲除方法。本发明实现A. ferrooxidans的高效无标记基因敲除所采用的技术方案是构建含有卡那霉素抗性基因、酵母内切核酸酶HceI特异识别作用位点、能够进行接合转移的初始质粒，将要敲除的靶基因上、下游同源片段分别按一定方向克隆至初始质粒上，获得能够进行基因敲除的自杀质粒，将自杀质粒通过接合转移的方法转移到受体菌 A. ferrooxidans中，在选择平板上获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的A. ferrooxidans单交换子，然后构建含有链霉素抗性基因、酵母内切核酸酶HceI基因、具有接合转移功能的广泛宿主范围特性质粒作为诱导质粒，将诱导质粒通过接合转移的方法转移到受体菌A. ferrooxidans单交换子中，实现I-SceI基因在A. ferrooxidans 单交换子中表达，表达产物HceI内切酶能够切断染色体上的HceI位点，诱导第二次同源重组，在选择平板上获得发生第二次同源重组且实现靶基因敲除的A. ferrooxidans 突变菌株，最后在无选择压力的条件下转接3 5次连续传代培养，获得质粒丢失的 A. ferrooxidans靶基因敲除突变株。上述初始质粒携带接合转移必需的or iT区，能够通过接合转移导入 A. ferrooxidans中；携带能在大肠杆菌中复制、而不能在A. ferrooxidans中复制的复制原点；携带酵母内切核酸酶HceI特异识别并作用的位点；携带多克隆位点MCS ；携带在酸性条件下对A. ferrooxidans稳定有效的卡那霉素的抗性基因。上述自杀质粒是通过将A. ferrooxidans染色体上要敲除的靶基因上游和下游、 长度为0. 5 2. Okb的同源序列片段分别按一定方向克隆至初始质粒的多克隆位点获得。上述自杀质粒转化到具有接合转移能力的大肠杆菌中作为供体菌， A. ferrooxidans作为受体菌，收集对数期的供体菌细胞和稳定期的受体菌细胞，以1 2的比例混勻，涂布到放置于2 2接合培养基表面的滤膜上，^ 32°C培养5 9天，使供、 受体菌充分接触以实现质粒的接合转移过程。上述筛选和鉴定A. ferrooxidans单交换子的方法是收集接合滤膜上的菌体，用 2 2无机盐溶液悬浮菌体并涂布于含80 110ug/mL卡那霉素的2 2固体培养基平板，28 32°C培养12 16天平板上长出单菌落，即为A. ferrooxidans单交换子；挑取 A. ferrooxidans单交换子到10mL9K亚铁培养基中复苏，28 32°C培养5 7天后转接到 30mL含250 300 μ g/mL卡那霉素的9K硫粉培养基，28 32°C培养5 7天后离心收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证。上述诱导质粒携带具有广泛宿主范围特性的复制原点，能够在大肠杆菌和 A. ferrooxidans中都能自主稳定复制；携带接合转移必需的oriT区，能够通过接合转移导入A. ferrooxidans中；携带在酸性条件下对A. ferrooxidans稳定有效的链霉素的抗性基因；携带酵母内切核酸酶HceI基因，能在A. ferrooxidans中表达出有活性的HceI内切核酸酶。上述获得A. ferrooxidans靶基因敲除突变株的方法是将表达酵母内切核酸酶 I-SceI的广泛宿主范围特性的诱导质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌中作为供体菌， A. ferrooxidans单交换子作为受体菌，收集对数期的供体菌和稳定期的受体菌细胞，以 1 2的比例混勻，涂布到放置于2 2接合培养基表面的滤膜上，28 32°C培养2 4 天，收集接合滤膜上的菌体，用2 2无机盐溶液悬浮菌体，并涂布于含80 110 μ g/mL链霉素的2 2固体培养基平板，^ 32°C培养12 16天后平板上长出单菌落；挑取单菌落到IOmL 9K亚铁培养基中复苏，28 32°C培养5 7天后转接到30mL含250 300 μ g/ mL链霉素的9K硫粉培养基，28 32°C培养5 7天后离心收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证和Southern杂交验证；对获得的双交换靶基因敲除突变子通过不加链霉素的9K硫粉培养基和2 2固体平板培养基单菌落转接 3 5次连续传代培养，获得质粒丢失的靶基因敲除突变株。上述2 2 无机盐溶液配方为=(NH4)2SO4 4. 5g/L，KCl 0. 15g/L，MgSO4 · 7H20 0. 75g/L, ρΗ4· 6。上述2 2 固体平板培养基配方为(NH4)2SO4 4. 5g/L，KCl 0. 15g/L，MgSO4 · 7H20 0. 75g/L, Na2S2O3 · 5H20 2g/L, FeSO4 · 7H20 2g/L，琼脂粉 6g/L, pH 4. 6。上述2 2 固体接合培养基配方为(NH4)2SO4 4. 5g/L，KCl 0. 15g/L，MgSO4 · 7H20 0. 75g/L，Na2S2O3 · 5H20 2g/L，FeSO4 · 7H20 0. 075g/L,琼脂粉 6g/L，酵母提取物 5g/L，pH 4. 6。上述9K 亚铁培养基配方为(NH4)2SO4 3. Og/L，KCl 0. lg/L，K2HPO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, Ca(NO3)2 0. Olg/L, FeSO4 · 7H20 18g/L, pH 2. 5。上述9K 硫粉培养基配方为(NH4) 2S04 3. Og/L, KCl 0. lg/L, K2HPO4 0. 5g/L， MgSO4 · 7H20 0. 5g/L, Ca(N。3)2 0. 01g/L，升华硫 5g/L, pH 3. 0。上述基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法中所述初始质粒优选插入酵母内切核酸酶HceI特异识别并作用位点的大肠杆菌质粒pSW^T。所述自杀质粒的构建优选把要敲除靶基因上游和下游长度为0. 9 1. Ikb的同源序列片段分别按一定方向克隆至初始质粒的多克隆位点。所述自杀质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌优选大肠杆菌SMlO或S17-1 λ
ρ Γο所述含自杀质粒的供体菌与受体菌接合培养条件优选30°C，7天，筛选 A. ferrooxidans单交换子优选含100ug/mL卡那霉素的2 2固体培养基平板，30°C培养 14天，A. ferrooxidans单交换子的复苏条件优选含300 μ g/mL卡那霉素的9K硫粉培养基， 30°C培养6天。所述诱导质粒优选插入HceI基因的广泛宿主范围特性质粒pMSDl。所述诱导质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌优选大肠杆菌SMlO或S17-1 λ
ρ Γο所述含诱导质粒的供体菌与受体菌A. ferrooxidans单交换子的接合培养条件优选30°C，3天，筛选A. ferrooxidans双交换靶基因敲除突变子优选含100 μ g/mL链霉素的 2 2固体培养基平板，30°C培养14天，A. ferrooxidans双交换靶基因敲除突变子的复苏条件优选含300 μ g/mL链霉素的9K硫粉培养基，30°C培养6天，对鉴定的A. ferrooxidans 双交换靶基因敲除突变子优选通过不加链霉素的9K硫粉培养基和不含链霉素的2 2固体培养基转接4次连续传代培养，获得质粒丢失的A. ferrooxidans靶基因敲除突变株。本发明针对A. ferrooxidans中质粒载体的不稳定性，较少种类抗生素的可使用性，已有敲除方法中抗生素抗性基因的残留，不便进行多基因敲除研究的问题，提出了一种基于同源重组原理的无标记基因敲除方法。本发明在国际上率先把无标记基因敲除技术应用于A. ferrooxidans，可以实现A. ferrooxidans中任何一个基因和多基因的敲除，且不残留任何抗生素抗性基因。使用本方法第一次单交换发生频率为10_7，第二次双交换发生频率为1. 5 2. 0%。本发明能快速、稳定、高效地敲除A. ferrooxidans的基因，不仅可用于研究 A. ferrooxidans基因的功能和代谢机制，实现A. ferrooxidans的遗传性状改造，构建高效浸矿基因工程菌；而且所得的突变株不携带任何抗生素抗性基因，既可以作为出发菌株进行后续不同位点的基因敲除和改造，还可以安全地用于大规模工业生产。
图1为用于基因敲除的初始质粒pKIT的结构示意图。图2为A. ferrooxidans AFE_1807 (pfkB)基因敲除的构建流程示意图。图 3 为 A. ferrooxidans AFE_1807 基因敲除的 PCR 验证图。图中:M, DNA Marker，从上到下大小依次为 8，OOObp,5, OOObp,3, OOObp,2, OOObp, 1，OOObp、750bp、500bp、250bp。两个Marker之间从左到右模板依次为质粒pKOT、 A. ferrooxidans ATCC 23270 基因组 DNA、A. ferrooxidans ATCC 23270 第一种单交换子基因组 DNA、A. ferrooxidans ATCC 23270 第二种单交换子基因组 DNA、A. ferrooxidans ATCC 23270敲除突变子基因组DNA。其中1 5，引物是AFlF和AFlR ;6 10，引物是AF2F和 AF2R ； 11 15，引物是K59和K629 ；16 20，引物是DOF和D0R。图4为诱导质粒pMSDlUcel的结构示意图。图5为A. ferrooxidans AFE_1807基因敲除的杂交验证图。图中 MT-ApaI，A. ferrooxidans ATCC 23270 敲除突变子基因组 DNA/Apal ； WT-ApaI, A. ferrooxidans ATCC 23270 基因组 DNA/Apal。图6为A. ferrooxidans AFE_0029 (tetH)基因敲除的构建流程示意图。图7为A. ferrooxidans AFE_0269 (sdo)基因敲除的构建流程示意图。
具体实施例方式一般性说明本发明所用极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌标准菌株A. ferrooxidans ATCC 23270购自ATCC(美国典型微生物菌种保藏中心)。所述质粒pSW^T的来源见feielle Demarre, Anne-Marie Guerout, Chiho Matsumoto-Mashimo, Dean A. Rowe-Magnus, Philippe Marliere, Didier Mazel :A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid(Incff) and RP4 plasmid(IncP α ) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Research in Microbiology, 2005,156 :245 255。所述质粒 pUC19RP12 的来源见 Gyorgy Posfai, Vitaliy Kolisnychenko, Zsuzsa Bereczki, Frederick R. Blattner:Markerless gene replacement inEscherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome. Nucleic Acids Research，1999，27 :4409 4415。所述质粒pUC19购自上海生工生物工程技术有限公司。所述质粒PMSDl购自济南鑫兴生物科技有限公司。所述大肠杆菌菌株DH5 α 购自TaKaRa公司。所述大肠杆菌菌株S17-1 λ pir和SMlO购自济南鑫兴生物科技有限公司。细菌基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒均购自Omega Bio_tek公司。PCR 反应使用的试剂以及 TaKaRa Taq 禾口 PrimeSTAR HS DNA Polymerase 购自 TaKaRa 公司。酶切连接所用的各种限制性内切酶和iMDNA连接酶购自TaKaRa公司。Southern blot 使用的Amersham Hybond -N+尼龙膜购自GE Healthcare公司，引物标记和检测杂交试剂 i (DIG High prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I) _ 自 Roche &目。实施例1 极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌磷酸果糖激酶基因(pfkB，AFE_1807基因) 的无标记敲除(1)构建用于敲除 A. ferrooxidans ATCC 23270AFE_1807 基因的自杀质粒1.构建用于A. ferrooxidans基因敲除的初始质粒根据GenBank :AY733073. 1公布的质粒pSW^T的序列信息设计引物29TKpnI 5 ‘ -CGGCGGTACCTAGGGATAACAGGGTAATAGCGCTTTTCCGCTGCATAACCC-3‘29TSalI 5 ‘ -CTAAGTCGACTGATCAACGCGTCTCGAGGCCGGCCAGCCTCGCAGAGCAGG-3‘29TKpnI* ^TSalI引物以质粒pSW^T为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有oriT区的片段。其中在上游引物的Kpn I位点内侧加上18bp的HceI识别和作用位点序列，在下游引物的Ml I位点内侧加上Bcl I、Mlu I和Xho I识别位点序列。PCR反应体系如下(引物浓度为20 μ mol/L)10X 缓冲液5yL;25mmol/LMgC12 4μ L ；10mmol/L 四种 dNTP 混合液 1 μ L ；上下游引物各 IyL;TransEco FastPfu 0. 5 μ L ；模板DNA 1 μ 1，加水补至50 μ L ；PCR反应条件97°C预变性10分钟，941变性608，551退火308，721延伸508，30 个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，再用Kpn I和Ml I双酶切后连入同样进行双酶切的pSW^T，获得初始质粒pKIT(图1)。2.构建用于敲除A. ferrooxidans ATCC 23270 AFE_1807基因的自杀质粒根据GenBank :CP001212. 1 公布 A. ferrooxidans 标准株 ATCC 23270 基因组序列中的AFE_1807基因及其上下游基因序列设计引物HRlF 5 ‘ -GACGGAATTCCCGCGGCCTGACGCTGGAAG-3‘HRlR 5' -GCCGTCTAGACGGTCATGACCGCGCCTCC-3‘HR2F 5 ‘ -GCCGTCTAGAGGGTACCCCAAAAAAGGCCC-3‘HR2R
5 ‘ -GACGGAGCTCCCATCAGTATAGAACAGTCGGGG-3‘HRlF 和 HRlR 引物，HR2F 和 HR2R 引物，分别以提取的 A. ferrooxidans ATCC 23270 基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有AFE_1807基因上游 IOOObp 同源臂 HRl (1572178 — 1571179)和下游 1004bp 同源臂 HR2 (1570227 — 1569224) 的片段。其中根据PKIT质粒MCS中的酶切位点，分别在上游同源臂HRl的两端添加了 EcoR I和)(ba I酶切位点序列，在下游同源臂HR2的两端添加了 )(ba I和Mc I酶切位点序列。 PCR反应体系如下(引物浓度为20 μ mol/L)IOX 缓冲液 5yL;25mmol/LMgC12 4μ L ；10mmol/L 四种 dNTP 混合液 1 μ L ；上下游引物各IyL;TransEco FastPfu 0. 5 μ L ；模板DNA 1 μ 1，加水补至50 μ L ；PCR反应条件97°C预变性10分钟，94°C变性60s，55°C退火30s，72°C延伸70s， 30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，上游同源臂HRl 片段用EcoR I和)(ba I双酶切，下游同源臂HR2片段用)(ba I和Mc I双酶切，分别连入 PKIT质粒MCS中相应酶切位点之间，获得自杀质粒ρΚΟΤ (图2)。(2)获得发生第一次同源重组的A. ferrooxidans单交换子1. A. ferrooxidans ATCC 23270 AFE_1807基因敲除的构建流程示意图见图2。2.将质粒 ρΚΟΤ 转化 E. coli S17-1 λ pir，作为接合转移供体菌，A. ferrooxidans ATCC 23270 作为受体菌。将 E. coli S17-1 λ pir (ρΚΟΤ)在含 100 μ g/mL 卡那霉素的 LB 液体培养基中，37°C，150r/min振荡培养过夜，2%转接到含100 μ g/mL卡那霉素的新鲜LB 液体培养基中，37°C，120r/min缓慢振荡培养3 4小时至对数期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；将A. ferrooxidans ATCC 23270培养在9K硫粉培养基中，30°C，150r/ min振荡培养5 7天至稳定期， 2%转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30°C，150r/min 振荡培养5 7天至稳定期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体菌以 1 2的比例混合、稀释，取100 μ L混合菌液，约IO8个细胞，涂布到放置于2 2接合培养基表面的0. 45 μ m孔径滤膜上，30°C培养箱中培养7天。3.将接合滤膜取出，用2 2无机盐溶液1 2mL悬浮附着的菌体，涂布于含 100 μ g/mL卡那霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，平板上长出单菌落即为A. ferrooxidans单交换子。挑取A. ferrooxidans单交换子到IOmL 9K亚铁培养基中复苏，30°C培养6天后转接到30mL含300 μ g/mL卡那霉素的9K硫粉培养基，30°C，150r/ min振荡培养6天至稳定期。提取A. ferrooxidans单交换子的基因组DNA，设计引物进行 PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证。分别利用K59 5' -ATACCGTAAAGCACGAGG-3‘K629 5' -CCCTGAATGAACTCCAAG-3‘检测插入染色体上的来源于质粒ρΚΟΤ的Km基因(图3)；利用
AFlF 5' -TTGCCAAAGGGTTCGTGT-3‘AFlR 5' -GGGTTGAGGGTGAGGGTAG-3‘检测发生第一种单交换的形式(图2和3)；利用AF2F 5' -TAACGGAAGCGCGTGTACTC-3‘AF2R 5‘ -TGACATGGGAATTGCGCGC-3‘检测发生第二种单交换的形式(图2和3)。获得的A. ferrooxidans单交换子包含两种单交换情况(见图幻，二者数量比约为 1 1。单交换子发生频率约为10_7。(3)获得发生第二次同源重组的A. ferrooxidans AFE_1807基因敲除突变株1.用Xba I和I^st I双酶切将质粒pUC19RP12上携带的HceI基因片段连接到广泛宿主范围特性质粒PMSDl的相应酶切位点，获得诱导质粒pMSDl-1-keI (图4)。2.将质 SpMSDlUcelR 化大肠杆菌 E. coli SM10,以 E. coli SMlO(pMSDl-I-Scel)作为接合转移供体菌，A. ferrooxidans单交换子作为受体菌。将 E. coli SMlO(pMSDl-I-Scel)在含 100 μ g/mL 链霉素的 LB 液体培养基中 37 °C，150r/ min振荡培养过夜，2%转接到含100 μ g/mL链霉素的新鲜LB液体培养基中，37°C，120r/ min缓慢振荡培养3 4小时至对数期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；将 A. ferrooxidans单交换子培养在9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期， 2%转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体菌以1 2的比例混合、稀释， 取100 μ L混合菌液，约IO8个细胞，涂布到放置于2 2接合培养基表面的0. 45 μ m孔径滤膜上，30°C培养箱中培养3天。3.将接合滤膜取出，用2 2无机盐溶液1 2mL悬浮附着的菌体，涂布于含 100 μ g/mL链霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，平板上长出单菌落。挑取单菌落到IOmL 9K亚铁培养基中复苏，30°C培养6天后转接到30mL含300yg/ mL链霉素的9K硫粉培养基，300C，150r/min振荡培养6天至稳定期。收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测用以筛选和鉴定发生双交换的 A. ferrooxidans AFE_1807 基因敲除突变株。利用DOF 5' -GGTGCTCACTTACAACTTCCG-3‘DOR 5' -GGCCATCTGTTACTCCTCGTC-3‘检测发生第二次双交换的A. ferrooxidans AFE_1807基因敲除突变株(图3)。在发生第二次同源重组的双交换子中，一种是回复成野生型，另一种是AFE_1807 基因敲除突变株(原理见图2)。4.取PCR验证的发生双交换的A. ferrooxidans AFE_1807基因敲除突变子100 μ L 菌液，涂布于不含链霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，挑取平板上长出的单菌落到IOmL不含链霉素的9K硫粉培养基，30°C培养6天，取100 μ L菌液再次涂布不含链霉素的2 2固体培养基平板，如此转接4次连续传代培养，最后转接30mL 不含链霉素的9K硫粉培养基，30°C培养6天，收集菌体，提取基因组DNA，设计引物PCR扩增质粒上的序列片段并琼脂糖凝胶电泳检测，进行质粒丢失的验证，最终获得不含质粒的 A. ferrooxidans AFE_1807 基因敲除突变株。利用SMF 5' -TGTCAGAGGCGGAGAATC-3‘SMR 5' -CAAGTCAGAGGGTCCAATC-3‘扩增质粒上的链霉素抗性基因片段，检测质粒的丢失。5.利用Southern blot验证A. ferrooxidans AFE_1807基因敲除突变株的结果如图5。利用probe-F 5‘ -CGCGGAATTCGATTCATATGCAGATGATC-3‘probe-R 5‘ -CAGCAAGCTTGAAGTTGTAAGTGAGCAC-3‘扩增上游同源臂HRl内部364bp的片段，PCR反应体系如下(引物浓度为 20ymol/L)10X 缓冲液 5yL;25mmol/LMgC12 4μ L ；10mmol/L 四种 dNTP 混合液 IyL;上下游引物各IyL;TransEco FastPfu 0. 5 μ L ；模板DNA 1 μ 1，加水补至50 μ L ；PCR反应条件97°C预变性10分钟，941变性608，601退火308，721延伸408，30 个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，用EcoR I和Hind III双酶切，连接至质粒PUC19获得重组质粒，转化大肠杆菌DH5 α，在含有lOOug/mL氨苄青霉素的LB培养基上获得重组子，提取重组质粒用作探针。分别提取A. ferrooxidans野生型和AFE_1807基因敲除突变株的基因组DNA，用Apa I酶切后经琼脂糖凝胶进行检测，然后转膜进行Southern杂交，操作步骤按Roche公司的Southern blot试剂盒的说明进行。 杂交结果见图5。实施例2 极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌连四硫酸盐水解酶基因(tetH，AFE_0029基因)的无标记敲除(1)构建用于敲除 A. ferrooxidans ATCC 23270 AFE_0(^9 基因的自杀质粒1.构建用于A. ferrooxidans基因敲除的初始质粒(同实施例1，略)2.构建用于敲除AFE_0(^9基因的自杀质粒根据GenBank :CP001212. 1 公布 A. ferrooxidans 标准株 ATCC 23270 基因组序列中的AFE_0(^9基因及其上下游基因序列设计引物HAlF 5' -GCTGAATTCCTCGTCCATCATTTTTTGCGG-3‘HAlR 5' -TACAAGCTTCTCTAGACAGATGGTGCGTTTTCC-3'HA2F 5' -CGCGAATTCTCTAGACCGTCTACCTGACCAACTC-3'
HA2R 5' -GCTAAGCTTGAGCTCCGTCACGTCACTGCGAAAT-3'HAlF 和 HAlR 引物，HA2F 和 HZ^R 引物，分别以提取的 A. ferrooxidans ATCC 23270 基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有AFE_0(^9基因上游 1002bp 同源臂 HAl (30709 — 31710)和下游 1009bp 同源臂 HA2 (32974 — 33982)的片段。 其中根据PKIT质粒MCS中的酶切位点，分别在上游同源臂HAl的两端添加了 EcoR I和)(ba I酶切位点序列，在下游同源臂HA2的两端添加了 )(ba I和Mc I酶切位点序列。PCR反应体系如下(引物浓度为20 μ mol/L)IOX 缓冲液 5yL;25mmol/LMgC12 4μ L ；10mmol/L 四种 dNTP 混合液 1 μ L ；上下游引物各IyL;TransEco FastPfu 0. 5 μ L ；模板DNA 1 μ 1，加水补至50 μ L ；PCR反应条件97°C预变性10分钟，94°C变性60s，55°C退火30s，72°C延伸70s， 30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，上游同源臂HAl 片段用EcoR I和)(ba I双酶切，下游同源臂HA2片段用)(ba I和Mc I双酶切，分别连入 PKIT质粒MCS中相应酶切位点之间，获得自杀质粒pKIT-KtetH(图6)。(2)获得发生第一次同源重组的A. ferrooxidans单交换子1. A. ferrooxidansATCC 23270 AFE_0029基因敲除的构建流程示意图见图6。2.将质粒pKIT-KtetH转化E. coli S17-1 λ pir，作为接合转移供体菌， A. ferrooxidans ATCC23270 作为受体菌。将 E. coli S17-1 λ pir (pKIT-KtetH)在含 100 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37 °C，150r/min振荡培养过夜，2 %转接到含 100μ g/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37°C，120r/min缓慢振荡培养3 4小时至对数期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；将A. ferrooxidans ATCC 23270培养在 9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期， 2%转接到新鲜的9K 硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体菌以1 2的比例混合、稀释，取IOOyL混合菌液，约IO8个细胞， 涂布到放置于2 2接合培养基表面的0.45 μ m孔径滤膜上，30°C培养箱中培养7天。3.将接合滤膜取出，用2 2无机盐溶液1 2mL悬浮附着的菌体，涂布于含 100 μ g/mL卡那霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，平板上长出单菌落即为单交换子。挑取单交换子到IOmL 9K亚铁培养基中复苏，30°C培养6天后转接到 30mL含300 μ g/mL卡那霉素的9K硫粉培养基，30°C，150r/min振荡培养6天至稳定期。提取A. ferrooxidans单交换子的基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证。分别利用K59 5' -ATACCGTAAAGCACGAGG-3‘K629 5' -CCCTGAATGAACTCCAAG—3‘检测插入染色体上的来源于质粒pKIT-KtetH的Km基因(图6)；
利用DlF 5' -TGCCAAAGGGTTCGTGTA-3‘DlR 5' -GGATACCGTTCGATAG-3‘检测发生第一种单交换的形式(图6)；利用D2F 5' -AGTTCGGGATCGAAAGC-3‘D2R 5' -GGATGTAACGCACTGAG-3‘检测发生第二种单交换的形式(图6)。获得的A. ferrooxidans单交换子包含两种单交换情况，二者数量比约为1 1。 单交换子发生频率约为10_7。(3)获得发生第二次同源重组的A. ferrooxidans AFE_0029基因敲除突变株1.诱导质粒pMSDl-1-SceI的构建与实施例1相同(略)。2.将质 SpMSDlHcelR 化大肠杆菌 E. coli SM10,以 E. coli SMlO(pMSDl-I-Scel)作为接合转移供体菌，A. ferrooxidans单交换子作为受体菌。将 E. coli SMlO(pMSDl-I-Scel)在含 100 μ g/mL 链霉素的 LB 液体培养基中 37 °C，150r/ min振荡培养过夜，2%转接到含100 μ g/mL链霉素的新鲜LB液体培养基中，37°C，120r/ min缓慢振荡培养3 4小时至对数期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；将 A. ferrooxidans单交换子培养在9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期， 2%转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体菌以1 2的比例混合、稀释， 取100 μ L混合菌液，约IO8个细胞，涂布到放置于2 2接合培养基表面的0. 45 μ m孔径滤膜上，30°C培养箱中培养3天。3.将接合滤膜取出，用2 2无机盐溶液1 2mL悬浮附着的菌体，涂布于含 100 μ g/mL链霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，平板上长出单菌落。挑取单菌落到IOmL 9K亚铁培养基中复苏，30°C培养6天后转接到30mL含300yg/ mL链霉素的9K硫粉培养基，300C，150r/min振荡培养6天至稳定期。收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测用于筛选和鉴定发生双交换的 A. ferrooxidans AFE_0029 基因敲除突变株。利用SOF 5' -TCCGCCGCTGTTGCTGTT-3‘SOR 5' -TGGGGTTCGCATGCTGAT-3‘检测发生第二次双交换的A. ferrooxidans AFE_0029基因敲除突变株。在发生第二次同源重组的双交换子中，一种是回复成野生型，另一种是AFE_0(^9 基因敲除突变株(原理见图6)。4.取PCR验证的发生双交换的A. ferrooxidans AFE_0(^9基因敲除突变子100 μ L 菌液，涂布于不含链霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，挑取平板上长出的单菌落到IOmL不含链霉素的9K硫粉培养基，30°C培养6天，取100 μ L菌液再次涂布不含链霉素的2 2固体培养基平板，如此转接4次连续传代培养，最后转接30mL 不含链霉素的9K硫粉培养基，30°C培养6天，收集菌体，提取基因组DNA，设计引物PCR扩增质粒上的序列片段并琼脂糖凝胶电泳检测，进行质粒丢失的验证，最终获得不含质粒的 A. ferrooxidans AFE_0029 基因敲除突变株。利用SMF 5' -TGTCAGAGGCGGAGAATC-3‘SMR 5' -CAAGTCAGAGGGTCCAATC-3‘扩增质粒上的链霉素抗性基因片段，检测质粒的丢失。实施例3 极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌金属β -内酰胺酶基因(AFE 0269基因，简称sdo)的无标记敲除(1)构建用于敲除 A. ferrooxidans ATCC 23270 AFE_0269 基因的自杀质粒1.构建用于A. ferrooxidans基因敲除的初始质粒(同实施例1，略)2.构建用于敲除AFE_0269基因的自杀质粒根据GenBank :CP001212. 1 公布 A. ferrooxidans 标准株 ATCC 23270 基因组序列中的AFE_0269基因及其上下游基因序列设计引物HBlF 5 ‘ -CACGAATTCCACGGACTGGGCGGATTAT-3‘HBlR 5 ‘ -CACTCTAGAATCACCCCTTGTCGGCAATG-3‘HB2F 5 ‘ -CCGTCTAGAGAGGAGTACTTAAGATGAGCAAACA-3‘HB2R 5' -GATGAGCTCTGGTCGGTGATGACGGTACGG-3‘HBlF 和 HBlR 引物，HB2F 和 HB^ 引物，分别以提取的 A. ferrooxidans ATCC 23270 基因组DNA为模板，通过PCR(聚合酶链式反应)体外扩增获得带有AFE_0269基因上游 1022bp 同源臂 HBl (244891 — 243870)和下游 1028bp 同源臂 HB2 (243178 — 242151)的片段。其中根据PKIT质粒MCS中的酶切位点，分别在上游同源臂HBl的两端添加了 EcoR I和 XbaI酶切位点序列，在下游同源臂ΗΒ2的两端添加了 )(ba I和Mc I酶切位点序列。PCR 反应体系如下(引物浓度为20 μ mol/L)10X 缓冲液5yL;25mmol/LMgC12 4μ L 10mmol/L 四种 dNTP 混合液 1 μ L ；上下游引物各IyL;TransEco FastPfu 0. 5 μ L ；模板DNA 1 μ 1，加水补至50 μ L ；PCR反应条件97°C预变性10分钟，94°C变性60s，55°C退火30s，72°C延伸70s， 30个循环后72°C延伸10分钟，4°C保存。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶回收，上游同源臂HBl 片段用EcoR I和)(ba I双酶切，下游同源臂HB2片段用)(ba I和Mc I双酶切，分别连入 PKIT质粒MCS中相应酶切位点之间，获得自杀质粒pKIT-Ksdo (图7)。(2)获得发生第一次同源重组的A. ferrooxidans单交换子1. A. ferrooxidans ATCC 23270 AFE_0269基因敲除的构建流程示意图见图7。
2.将质粒pKIT-Ksdo转化E. coli S17-1 λ pir,作为接合转移供体菌， A. ferrooxidans ATCC23270 作为受体菌。将Ε. coli S17-1 λ pir (pKIT-Ksdo)在含 100 μ g/ mL卡那霉素的LB液体培养基中，370C，150r/min振荡培养过夜，2%转接到含100 μ g/mL卡那霉素的新鲜LB液体培养基中，37°C，120r/min缓慢振荡培养3 4小时至对数期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；将A. ferrooxidans ATCC 23270培养在9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期， 2%转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次； 供体菌和受体菌以1 2的比例混合、稀释，取IOOyL混合菌液，约IO8个细胞，涂布到放置于2 2接合培养基表面的0.45 μ m孔径滤膜上，30°C培养箱中培养7天。3.将接合滤膜取出，用2 2无机盐溶液1 2mL悬浮附着的菌体，涂布于含 100 μ g/mL卡那霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，平板上长出单菌落即为单交换子。挑取单交换子到IOmL 9K亚铁培养基中复苏，30°C培养6天后转接到 30mL含300 μ g/mL卡那霉素的9K硫粉培养基，30°C，150r/min振荡培养6天至稳定期。提取A. ferrooxidans单交换子的基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证。利用K59 5' -ATACCGTAAAGCACGAGG-3‘K629 5' -CCCTGAATGAACTCCAAG—3‘检测插入染色体上的来源于质粒pKIT-Ksdo的Km基因(图7)利用SDlF 5' -GGATTTTGCCAAAGGGTTCG-3‘SDlR 5' -GGATGTAGGTGTAGGTGCTG-3‘检测发生第一种单交换的形式(图7)；利用SD2F 5' -GGCGGAACTCCACTTGTCAG-3‘SD2R 5‘ -GGGATGTAACGCACTGAGAA-3‘检测发生第二种单交换的形式(图7)。获得的A. ferrooxidans单交换子包含两种单交换情况，二者数量比约为1 1。 单交换子发生频率约为10_7。(3)获得发生第二次同源重组的A. ferrooxidans AFE_0269基因敲除突变株1.诱导质粒pMSDl-1-SceI的构建与实施例1相同(略)。2.将质 SpMSDlUcelR 化大肠杆菌 E. coli SM10,以 E. coli SMlO(pMSDl-I-Scel)作为接合转移供体菌，A. ferrooxidans单交换子作为受体菌。将 E. coli SMlO(pMSDl-I-Scel)在含 100 μ g/mL 链霉素的 LB 液体培养基中 37 °C，150r/ min振荡培养过夜，2%转接到含100 μ g/mL链霉素的新鲜LB液体培养基中，37°C，120r/ min缓慢振荡培养3 4小时至对数期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；将 A. ferrooxidans单交换子培养在9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期， 2%转接到新鲜的9K硫粉培养基中，30°C，150r/min振荡培养5 7天至稳定期，收集菌体，用2 2无机盐溶液洗涤两次；供体菌和受体菌以1 2的比例混合、稀释，取100 μ L混合菌液，约IO8个细胞，涂布到放置于2 2接合培养基表面的0. 45 μ m孔径滤膜上，30°C培养箱中培养3天。3.将接合滤膜取出，用2 2无机盐溶液1 2mL悬浮附着的菌体，涂布于含 lOOyg/mL链霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，平板上长出单菌落。挑取单菌落到IOmL 9K亚铁培养基中复苏，30°C培养6天后转接到30mL含300yg/ mL链霉素的9K硫粉培养基，300C，150r/min振荡培养6天至稳定期。收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测用于筛选和鉴定发生双交换的 A. ferrooxidans AFE_0269 基因敲除突变株。利用SDF 5' -ATCATCATTCAGTTTCCT-3‘SDR 5' -AGCGGTCTCGGATGTTTTC-3‘检测发生第二次双交换的A. ferrooxidans AFE_0269基因敲除突变株。在发生第二次同源重组的双交换子中，一种是回复成野生型，另一种是AFE_0269 基因敲除突变株(见图7)。4.取PCR验证的发生双交换的A. ferrooxidans AFE_0269基因敲除突变子100 μ L 菌液，涂布于不含链霉素的2 2固体培养基平板上，30°C培养箱中培养14天，挑取平板上长出的单菌落到IOmL不含链霉素的9K硫粉培养基，30°C培养6天，取100 μ L菌液再次涂布不含链霉素的2 2固体培养基平板，如此转接4次连续传代培养，最后转接30mL 不含链霉素的9K硫粉培养基，30°C培养6天，收集菌体，提取基因组DNA，设计引物PCR扩增质粒上的序列片段并琼脂糖凝胶电泳检测，进行质粒丢失的验证，最终获得不含质粒的 A. ferrooxidans AFE_0269 基因敲除突变株。利用SMF 5' -TGTCAGAGGCGGAGAATC-3‘SMR 5' -CAAGTCAGAGGGTCCAATC-3‘扩增质粒上的链霉素抗性基因片段，检测质粒的丢失。以上具体描述了本发明技术方案的操作实例，不视为对本发明的应用限制。凡操作条件的等同替换，均在本发明的保护范围之内。
权利要求
1. 一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，步骤包括(1)构建含有卡那霉素抗性基因、酵母内切核酸酶HceI特异识别作用位点、能够进行接合转移的初始质粒；(2)将要敲除的靶基因上、下游同源片段分别按一定方向克隆至初始质粒上，获得能够进行基因敲除的自杀质粒；(3)将自杀质粒通过接合转移的方法转移到受体菌A.ferrooxidans中，在选择平板上获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的A. ferrooxidans单交换子；(4)构建含有链霉素抗性基因、酵母内切核酸酶HceI基因、具有接合转移功能的广泛宿主范围特性质粒，作为诱导质粒；(5)将诱导质粒通过接合转移的方法转移到受体菌A.ferrooxidans单交换子中，在选择平板上获得发生第二次同源重组且实现靶基因敲除的A. ferrooxidans突变菌株；(6)对验证的靶基因敲除突变株在无选择压力的条件下转接3 5次连续传代培养，获得质粒丢失的A. ferrooxidans靶基因敲除突变株；其特征是步骤(1)所述构建含有卡那霉素抗性基因、酵母内切核酸酶HceI特异识别作用位点、能够进行接合转移的初始质粒的方法是选择含有卡那霉素抗性基因、oriT区、多克隆位点MCS、不能在A. ferrooxidans中自主复制的大肠杆菌质粒，或者选择含有卡那霉素抗性基因、多克隆位点MCS、不能在A. ferrooxidans中自主复制的大肠杆菌质粒，引入能够进行接合转移的oriT区；通过引物合成再引入18bp的酵母内切核酸酶HceI特异识别作用位点，用PCR产物置换质粒上的相应片段获得初始质粒；步骤( 所述将要敲除的靶基因上、下游同源片段分别克隆至初始质粒上，获得能够进行基因敲除的自杀质粒的方法是用PCR方法分别扩增A. ferrooxidans靶基因上游和下游、长度为0. 5 2. Okb的同源序列片段，先后按一定方向连入初始质粒的多克隆位点，构成敲除该靶基因的自杀质粒；步骤C3)所述将自杀质粒通过接合转移的方法转移到受体菌A. ferrooxidans中，在选择平板上获得发生第一次同源重组使质粒整合到受体菌染色体上的A. ferrooxidans 单交换子及A. ferrooxidans单交换子的验证方法是将构建好的自杀质粒转化到具有接合转移能力的大肠杆菌中作为供体菌，收集对数期的供体菌细胞和稳定期的受体菌 A. ferrooxidans细胞，以1 2的比例混勻，涂布到放置于2 2接合培养基表面的滤膜上， ^ 32°C培养5 9天，收集接合滤膜上的菌体，用2 2无机盐溶液悬浮菌体并涂布于含80 110ug/mL卡那霉素的2 2固体培养基平板，28 32°C培养12 16天平板上长出单菌落，即为A. ferrooxidans单交换子；挑取A. ferrooxidans单交换子到IOmL 9K亚铁培养基中复苏，28 32°C培养5 7天后转接到30mL含250 300 μ g/mL卡那霉素的9K 硫粉培养基，观 32°C培养5 7天后离心收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR 扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证；步骤(4)所述构建含有链霉素抗性基因、酵母内切核酸酶HceI基因、具有接合转移功能的广泛宿主范围质粒作为诱导质粒的方法是选择具有广泛宿主范围特性的复制原点，能够在大肠杆菌和A. ferrooxidans中都能自主稳定复制；携带接合转移必需的oriT区、携带链霉素抗性基因的质粒；连入酵母内切核酸酶HceI基因构成诱导质粒；步骤( 所述将诱导质粒通过接合转移的方法转移到受体菌A. ferrooxidans单交换子中，在选择平板上获得发生第二次同源重组且实现靶基因敲除的A. ferrooxidans 突变菌株的方法是将表达酵母内切核酸酶I-Scel、具有广泛宿主范围特性的诱导质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌中作为供体菌，收集对数期的供体菌和稳定期的 A. ferrooxidans单交换子受体菌细胞，以1 2的比例混勻，涂布到放置于2 2接合培养基表面的滤膜上，^ 32°C培养2 4天，收集接合滤膜上的菌体，用2 2无机盐溶液悬浮菌体，并涂布于含80 110 μ g/mL链霉素的2 2固体培养基平板，28 32°C培养 12 16天后平板上长出单菌落；挑取单菌落到10mL9K亚铁培养基中复苏，观 32°C培养 5 7天后转接到30mL含250 300 μ g/mL链霉素的9K硫粉培养基，28 32°C培养5 7天后离心收集菌体，提取基因组DNA，设计引物进行PCR扩增并琼脂糖凝胶电泳检测验证和Southern杂交验证；对获得的双交换靶基因敲除突变子通过不加链霉素培养基转接3 5次连续传代培养，获得质粒丢失的靶基因敲除突变株。
2.根据权利要求1所述一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，其特征是所述初始质粒选插入酵母内切核酸酶HceI特异识别并作用位点的大肠杆菌质粒pSW^T。
3.根据权利要求1所述一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，其特征是所述自杀质粒的构建选把要敲除靶基因上游和下游长度为 0. 9 1. Ikb的同源序列片段分别按一定方向克隆至初始质粒的多克隆位点。
4.根据权利要求1所述一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，其特征是所述自杀质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌选大肠杆菌 SMlO或大肠杆菌S17-1 λ pir0
5.根据权利要求1所述一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，其特征是所述含自杀质粒的供体菌与受体菌接合培养条件选30°C，7天， 筛选A. ferrooxidans单交换子选含100ug/mL卡那霉素的2 2固体培养基平板，30°C培养14天，A. ferrooxidans单交换子的复苏条件选含300 μ g/mL卡那霉素的9K硫粉培养基， 30°C培养6天。
6.根据权利要求1所述一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，其特征是所述诱导质粒选插入HceI基因的广泛宿主范围特性质粒 pMSDl。
7.根据权利要求1所述一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，其特征是所述诱导质粒转化具有接合转移能力的大肠杆菌选大肠杆菌 SMlO或大肠杆菌S17-1 λ pir0
8.根据权利要求1所述一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，其特征是所述含诱导质粒的供体菌与受体菌A. ferrooxidans单交换子的接合培养条件选30°C，3天，筛选A. ferrooxidans双交换靶基因敲除突变子选含100 μ g/ mL链霉素的2 2固体培养基平板，30°C培养14天，A. ferrooxidans双交换靶基因敲除突变子的复苏条件优选含300 μ g/mL链霉素的9K硫粉培养基，30°C培养6天，对鉴定的 A. ferrooxidans双交换靶基因敲除突变子选通过不加链霉素的9K硫粉培养基和不含链霉素的2 2固体培养基转接4次连续传代培养，获得质粒丢失的A.ferr00Xidans靶基因敲除突变株。
全文摘要
本发明公开了一种基于同源重组原理的极端嗜酸性氧化亚铁硫杆菌无标记基因敲除方法，步骤包括初始质粒、含有要敲除靶基因上下游同源片段的自杀质粒和含酵母核酸内切酶I-SceI基因的诱导质粒的构建，自杀质粒和诱导质粒向嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的接合转移，发生第一次同源重组单交换子和第二次同源重组双交换突变株的筛选和鉴定。本发明首次实现了嗜酸性氧化亚铁硫杆菌的无标记基因敲除，能快速、稳定、高效地敲除该菌的基因，不仅可用于该菌基因的功能和代谢机制研究，进行遗传性状改造，构建高效浸矿工程菌；而且获得的突变株不携带任何抗性基因，既可以作为出发菌株进行后续不同位点的基因敲除和改造，还可以安全用于大规模工业生产。
文档编号C12N15/74GK102260699SQ20111018847
公开日2011年11月30日 申请日期2011年7月6日 优先权日2011年7月6日
发明者于洋洋, 刘双双, 刘相梅, 庞昕, 林建强, 林建群, 王慧妍 申请人:山东大学