一个烟草阳离子/氯离子共转运基因及其应用的制作方法

本发明涉及烟草氯离子转运相关基因，特别是涉及一个烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc在盐碱地土壤改良上的应用。

背景技术：

目前，土壤盐碱化已成为一个全球性的问题。盐碱地是各种盐土和碱土以及不同程度盐化和碱化土壤的总称。由于土体中含有大量盐碱成分，并具有不良理化性质，知识植物生长受到抑制，甚至不能生长。根据联合国教科文组织和粮农组织不完全统计，全世界盐碱地的面积为9.54亿公顷，我国约为9900万公顷，居世界第三位，而目前已开垦种植的烟碱土仅有六分之一。此外，我国耕地中盐碱化面积约占耕地总面积的6.62%。作为我国重要的后备耕地资源，改良和利用盐碱地对补偿日益减少的耕地面积、保障国家粮食安全具有重要意义。

盐碱化的土壤中，由于土体中含有大量盐碱成分，土壤理化性质也常常不良，进而导致植物生长受到抑制，甚至不能生长。植物在盐碱地上不容易生长是因为植物通过根吸收水分和养料，也会把盐碱成分（主要为氯离子和钠离子）运输到整个植物体。如果吸收到体内的盐碱成分浓度过高，植物就会死去。为改良和开发利用盐碱地，培育能够在盐碱地上正常生长的植物，特别是筛选和培育新的高耐盐性的植物新品种，是进行盐碱地改良的主要出路。

现有技术中，通过基因工程筛选和开发新的耐盐基因，并通过基因工程技术培育新的耐盐植物新品种是一个重要的研究途径，并且已经有一定数量的耐盐基因得到了初步研究和应用，但由于盐碱地类型多样，因而所需要的植物类型和耐盐基因也是多样的，筛选和开发新的耐盐基因仍然具有十分重要的研究和应用意义。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一个新的烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc（cation-chloridecotransporter，ccc），从而为培育耐盐植物新品种、富集土壤中氯离子并最终改良土壤奠定基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一个烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc，包括1113bp个碱基，该基因来源于烟草（nicotianatabacum），与氯离子转运相关，其碱基序列如seqidno.1所示；其中第5位-477位核苷酸为特异性核酸片段。

烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc所编码共转运蛋白，包括370个氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

所述烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc所编码共转运蛋白在烟草中的应用，用于转运氯离子。

所述烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc在烟草中的应用，将该基因沉默后，植物体内氯离子可以得到富集。

用于沉默烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc的瞬时沉默vigs载体，构建方法为：利用病毒诱导的基因沉默（vigs）技术，以所述烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc的特异性核苷酸片段作为引导序列，将特异性核酸片段接到瞬时表达载体trv上，转化大肠杆菌dh5α，从而构建获得瞬时表达载体trv-ntccc。

所述用于瞬时沉默烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc的vigs载体在烟草中的应用，用于沉默烟草中阳离子/氯离子共转运基因ntccc，沉默共转运基因ntccc后，植物体中氯离子含量得到积累。

利用所述用于沉默烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc的vigs载体所构建的ntccc瞬时沉默植物新品种的方法，利用病毒诱导的基因沉默技术，将瞬时沉默载体trv-ntccc转化本氏烟后，筛选、鉴定获得阳离子/氯离子共转运基因ntccc瞬时沉默植株，相较于未沉默植株，ntccc基因沉默植株中氯离子含量得到明显富集。

所述阳离子/氯离子共转运基因ntccc瞬时沉默植物新品种在盐碱地土壤改良中的应用，植株可以积累、富集土壤中氯离子，从而改良土壤。

本发明中烟草中阳离子/氯离子共转运基因ntccc是烟草氯离子代谢的关键调控基因，通过real-timepcr发现该基因是在烟草各个组织中都表达，且在烟草茎和叶芽中表达相对较高；

通过病毒诱导的基因沉默（vigs）的技术，构建了用于沉默ntccc基因的vigs载体，转化后成功获得了抑制ntccc在本氏烟草中表达的沉默植株，所获得的沉默植株拥有氯离子含量相对对照植株明显升高的特异表型；检测本氏烟草中植物氯离子的含量，发现基因沉默植株中氯离子含量显著升高，升高了至少50%，表明沉默该基因可以显著的提高植物的氯离子含量。

综上可以看出，利用基因沉默技术或敲除ntccc基因能够获得氯离子含量升高的基因沉默植株，这使得高氯离子含量烟草育种成为可能，从而为烟草适应不同种植环境及改良盐碱地土壤提供了一种新的技术途径。

附图说明

图1为不同组织器官中ntccc的相对表达量；

图2为沉默植株中ntccc基因的相对表达量；

图3为烘干后病毒诱导基因沉默的烟叶及对照烟叶中的氯离子含量。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分生物材料、实验试剂、实验仪器等基本情况简要介绍如下。

生物材料：

烟草材料：本氏烟草（nicotianabenthamiana），一种商品化烟草品种；

干扰载体：trv，购自中国质粒载体菌细胞基因保藏中心；

基因测序及引物合成，由上海生工提供完成；

实验试剂：

lataq酶、psti限制性内切酶，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒等购自takara公司，

in-fusion一步法克隆试剂盒购自clontech公司；

rna提取试剂盒购自于geneanswer公司；

反转录试剂盒、rt-pcr试剂盒购自roche公司；

蛋白胨、酵母提取物等购自oxoid公司；

部分试剂配方及配制方法简要说明如下：

（1）lb液体培养基（1l）：10g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），10g氯化钠（nacl），5g酵母抽提物（yeastextract），高温高压灭菌；

（2）yeb液体培养基（1l）：5g牛肉浸膏（beefextract），5g细菌蛋白胨（bacteriologicalpeptone），5g蔗糖（sucrose），1g酵母抽提物（yeastextract），2ml1m硫酸镁（mgso4），高温高压灭菌；

（3）1m2-(n-吗啉)乙磺酸（mes）储备液：ddh2o溶解mes，过滤灭菌，-20℃储存备用；

（4）200mm乙酰丁香酮（acetosyringone）储备液：二甲基亚砜（dsmo）溶解乙酰丁香酮，-20℃储存备用；

（5）mma（1l）：20g蔗糖（sucrose），5gmssalts（duchefabiochemie），1.95gmes，1ml乙酰丁香酮（200mm，），ph=5.6；

实验仪器：

pcr仪tgradient，biometra公司产品，

实时定量pcr仪lightcycler96，roche公司产品。

实施例1

本实施例主要就烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc的获得过程，简要介绍如下。

以栽培种烟草叶片为样品，利用rna提取试剂盒提取烟草叶片总rna，反转录为cdna备用；

通过同源比对的方法，参考拟南芥atccc基因的序列及已知烟草部分基因序列，设计扩增引物序列如下：

f：5’-cgcgagctcggtaccatgacctgcaataaacat-3’，

r：5’-gctcaccatggatccctatgtaaacaaagtgac-3’；

以上述所制备cdna为模板，利用上述引物进行pcr扩增，对扩增产物进行提纯后测序，获得烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc基因序列，其碱基序列如seqidno.1所示，共包括1113bp个碱基，其中第5位-477位核苷酸为特异性核酸片段。

对该基因序列进行翻译后，其所编码蛋白序列如seqidno.2所示，共包括370个氨基酸，进一步对比分析表明，该蛋白含有同源性很高的序列，高度保守。

为了检测ntccc基因在不同组织中的表达特异性，分别对栽培烟种子、成熟期烟草叶片、茎、根、叶芽、雄蕊、雌蕊和花萼等器官进行取样，提取rna并反转录成相应器官的cdna，利用real-timepcr技术进行检测该基因在不同组织中的表达。结果表明，烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc在烟草各个组织中都有表达，且在烟草茎和叶芽中表达相对较高（结果如图1所示）。

实施例2

利用实施例1中所获得烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc，发明人进一步构建了基因瞬时沉默用载体，相关构建过程简要介绍如下。

选择此基因中较特异的一段核酸片段（序列表seqidno.1的第5位-477位核苷酸序列）为vigs的引导序列，设计引物序列如下，扩增获得此序列；

vigs瞬时沉默载体构建时引物序列设计如下：

ntccc-f：5’-cgacgacaagaccctcctgcaataaacatccaat-3’，

ntccc-r：5’-gaggagaagagcccttactgccttgtttgcaac-3’；

扩增长度：473bp。

利用in-fusion的方法将上述扩增片段连接到trv载体上（50℃连接15min），构建获得trv-ntccc载体（实际应用时记录为trv2-ntccc载体）。

测序正确后，采用冻融法将上述重组质粒转化农杆菌gv3101，30℃培养48h，挑取单菌落，液体培养后，利用菌液pcr的方法验证确保目的片段转化正确。

实施例3

利用实施例2所构建的vigs瞬时沉默载体，以本氏烟草为例，发明人进一步进行了栽培试验，以沉默植物体内的烟草阳离子/氯离子共转运基因ntccc，相关实验过程简要介绍如下。

将烟草种子播种于育苗钵中育苗，待发芽后两周进行分苗，种于塑料钵（10cm×10cm）中，于22℃、16h光/8h暗条件下进行日常肥水管理等，生长4~5w，选取长势一致12盆烟草幼苗备用。

将含有trv1、trv2、trv2-pds（阳性对照）、trv2-ntccc的农杆菌单菌落分别接入yeb（5ml）培养基中(卡那霉素，50μg/ml)，28℃、250r/min过夜振荡培养约48h后，转接至50ml的yeb中；

28℃过夜振荡培养，4000r/min离心8min收集农杆菌到50ml离心管中，并用含有10mmol/l2-n-吗琳基乙磺酸(mes)、20μl/l乙酰丁香酮(acetosyringone，as)和10mmol/l的mgcl2的混合溶液将上述菌液的od值调至1.0左右，室温放置3~6h。

接种前，在含有trv2、trv2-pds、trv2-ntccc的农杆菌的mma悬浮液中等体积加入含trv1农杆菌的mma悬浮液混匀。

接种时挑选长势一致的约4~5片叶子，用1ml无针头无菌注射器通过压滤法把含有不同trv重组质粒的农杆菌悬浮液从叶片背面压入全部展开的叶片中，使菌液充满整个叶片，于22℃、75%湿度中培养；其中，含trv2-pds阳性对照的注射植株接种4盆，其余含trv2空载体、含trv2-ntccc的注射植株各接种6盆。

接种6周后，检测沉默植株中及对照植株中ntccc基因表达量，结果如图2所示。

从图2的基因表达情况可以看出，基因沉默植株中ntccc基因被较好抑制了表达。

对所获得的沉默植株及对照植株进行氯离子含量的检测。其检测方法如下：

对上述植株叶片进行取样，每个植株取3-4片叶子，用锡箔纸包裹后放入烘箱90℃烘干过夜；

将烘干的样品用研磨仪打碎，称取0.05g烟叶（精确至0.0001g），加入15ml、5%的乙酸溶液，置于恒温振荡器（30℃摇床），恒温震荡30min；

滤纸过滤后上连续流动分析仪测定氯离子含量。

结果如图3所示。结果表明，trv2-ntccc病毒诱导基因沉默植株中氯离子含量约是对照植株氯离子含量的两倍。即，基因沉默后，植株中氯离子得到了明显富集。

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<110>中国烟草总公司郑州烟草研究院

<120>一个烟草阳离子/氯离子共转运基因及其应用

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