血管生成素样3（ANGPTL3）iRNA组合物及其使用方法与流程

本申请是申请日为2012年6月20日和发明名称为“血管生成素样3(angptl3)irna组合物及其使用方法”的201280041047.1号发明专利申请的分案申请。相关申请本申请要求2011年6月21日提交的美国临时申请号61/499,620以及2012年4月25日提交的美国临时申请号61/638,288的优先权，将它们每个的全部内容通过引用结合在此。序列表本申请包含已经以ascii格式经由efs-web呈交的序列表，并且通过引用以其全文结合在此。所述ascii复件产生于2012年7月11日，命名为12130100.txt并且大小为444,346比特。
背景技术：
：血管生成素样3(angptl3)是调节脂质新陈代谢并主要在肝脏中表达的分泌因子的血管生成素样家族的一员(koishi(小石)，r.等人，(2002)nat.genet.(自然·遗传学)30(2)：151-157)。angptl3双重抑制脂蛋白脂肪酶(lpl)的催化活性，其催化甘油三酸酯的水解以及内皮脂肪酶(el)的水解，该内皮脂肪酶水解高密度脂蛋白(hdl)磷脂。在降低血脂的又肥胖的kk/snk小鼠中，angptl3表达的缩减通过促进甘油三酸酯的清除对高血脂症和动脉粥样硬化具有一个保护效应(ando(安藤)等人，(2003)j.lipidres.(脂质研究杂志)，44：1216-1223)。人类的angptl3血浆浓度与血浆hdl胆固醇和hdl磷脂水平正相关(shimamura(岛村)等人，(2007)arterioscler.thromb.vasc.biol.(动脉粥样硬化、血栓和血管生物学)，27：366-372)。脂质代谢作用的失调会导致血脂例如甘油三酸酯和/或胆固醇的水平提高。提高的血脂与高血压、心血管疾病、糖尿病以及其他病理学病症高度相关。高甘油三酯血症是脂质代谢作用失调的一个实例，其特征为高血液水平的甘油三酸酯。它已经与动脉粥样硬化相关，甚至在没有高胆固醇水平(高胆固醇血症)的情况下。当甘油三酸酯浓度过多时(即高于1000mg/dl或12mmol/l)，高甘油三酯血症还会导致胰腺炎。高血脂症是脂质代谢作用失调的另一个实例，其特征为血液中脂质和/或脂蛋白中的任一种或全部的水平提高。针对脂质代谢作用失调的当前治疗包括节食、锻炼和用他汀类药物或其他药物治疗，这些不总是有效的。因此，本领域中存在对患有脂质代谢作用失调的受试者的替代治疗的需求。技术实现要素：本发明提供irna组合物，该组合物影响rna诱导的沉默复合物(risc)介导的angptl3基因的rna转录物的切割。angptl3基因可以在一个细胞内，例如在一个受试者例如一个人的体内的一个细胞内。本发明还提供使用本发明的irna组合物的方法，用于抑制angptl3基因的表达和/或用于治疗将受益于angptl3基因表达抑制或减少的受试者，例如一个经受或易于经受脂质代谢作用失调的受试者，例如一个经受或易于经受高血脂症或高甘油三酯血症的受试者。因此，在一个方面，本发明提供用于抑制angptl3基因的表达的双链核糖核酸(dsrna)。该dsrna包括一个正义链和一个反义链，其中该正义链包括与seqidno：1的核苷酸序列区别在于不多于3个核苷酸的至少15个连续的核苷酸，并且该反义链包括与seqidno：5的核苷酸序列区别在于不多于3个核苷酸的至少15个连续的核苷酸。在另一个方面，本发明提供用于抑制angptl3基因的表达的双链核糖核酸(dsrna)。该dsrna包括一个正义链和一个反义链，该反义链包括一个互补性区域，该互补性区域包括与在表2、3、7、8、9和10中所列出的反义链序列中的任一个区别在于不多于3个核苷酸的至少15个连续的核苷酸。在一个实施例中，该正义链和反义链包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：表7和表8的ad-53063.1、ad-53001.1、ad-53015.1、ad-52986.1、ad-52981.1、ad-52953.1、ad-53024.1、ad-53033.1、ad-53030.1、ad-53080.1、ad-53073.1、ad-53132.1、ad-52983.1、ad-52954.1、ad-52961.1、ad-52994.1、ad-52970.1、ad-53075.1、ad-53147.1、ad-53077.1。在本发明的某些实施例中，该dsrna包括至少一个修饰核苷酸。在一个实施例中，修饰的核苷酸的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：2′-o-甲基修饰的核苷酸、包括5′-硫代磷酸酯基的核苷酸，和与胆甾烯基衍生物或十二烷酸双癸酰胺基连接的末端核苷酸。在另一个实施例中，修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、2′-脱氧修饰的核苷酸、锁定核苷酸、非碱基核苷酸、2′-氨基修饰的核苷酸、2′-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、磷酰胺酯，和包括非天然碱基的核苷酸。该dsrna的互补性区域可能是至少17个核苷酸的长度、19个和21个核苷酸之间的长度、或19个核苷酸的长度。在一个实施例中，该dsrna的每个链不多于30个核苷酸长度。dsrna的至少一个链包括至少1个核苷酸或至少2个核苷酸的的3’突出。在某些实施例中，一个dsrna进一步包括一个配体。在一个实施例中，该配体轭合至该dsrna的正义链的3’末端。在一些实施例中，该配体是通过二价或三价分支连接物而附接的一个或多个n-乙酰半乳胺糖(galnac)衍生物。在具体实施例中，该配体是在一些实施例中，该rnai剂共轭至如在以下示意图中所示出的配体在一些实施例中，该rnai剂进一步包括至少一种硫代磷酸或甲基膦酸酯核苷酸间键合。在一些实施例中，该硫代磷酸和甲基膦酸酯核苷酸间键合是在一个链的3’末端。在一些实施例中，该链是反义链。在另外的实施例中，该链是正义链。在一个实施例中，一个dsrna的互补性区域由表2、3、7、8、9和10的反义序列之一组成。在另一个实施例中，一个dsrna包括由选自表2、3、7、8、9和10的序列的正义链序列组成的一个正义链和由选自表2、3、7、8、9和10的序列的反义序列组成的一个反义链。在另一方面，本发明提供一种细胞，例如包含本发明的dsrna的一种肝细胞。在仍另一个方面，本发明提供一种编码dsrna的至少一个链的载体，其中该dsrna包括编码angptl3的mrna的至少一部分的互补性区域，其中该dsrna是30个或更少碱基对长度，并且其中该dsrna靶向该mrna用于切割。该互补性区域可以是至少15个核苷酸的长度或19个至21个核苷酸的长度。在另一个方面中，本发明提供包含一种编码dsrna的至少一个链的载体的一种细胞，其中该dsrna包括编码angptl3的mrna的至少一部分的互补性区域，其中该dsrna是30个或更少碱基对长度，并且其中该dsrna靶向该mrna用于切割。在一个方面，本发明提供用于抑制包括本发明的dsrna或载体的angptl3基因表达的一种药用组合物。在一个实施例中，该药用组合物包括一种脂质配制品，例如mc3、snalp或xtc配制品。在另一个方面，本发明提供抑制angptl3在细胞中表达的方法。这些方法包括：将该细胞与本发明的dsrna或载体进行接触并且将产生的细胞维持一段时间，该时间足以获得angptl3基因的mrna转录物的降解，由此抑制细胞中的angptl3基因表达。该细胞可以在一个受试者，例如在一个人类受试者，例如一个患有脂质代谢作用失调(例如高血脂症或高甘油三酯血症)的人类受试者体内。在本发明的方法的一个实施例中，angptl3表达受到至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的抑制。在另一个方面，本发明提供治疗将受益于angptl3表达减少的患有一种失调的受试者的方法，例如一种脂质代谢作用失调，例如高血脂症或高甘油三酯血症。该方法包括向该受试者给予一个治疗有效量的本发明的dsrna或载体，由此治疗该受试者。该失调可以是脂质代谢作用失调，例如高血脂症或高甘油三酯血症。在一个实施例中，向该受试者给予dsrna引起血脂、甘油三酸酯、胆固醇和/或自由脂肪酸水平的降低，和/或angptl3蛋白累积的降低。在一个实施例中，向该受试者给予dsrna引起ldl-c、hdl-c、vldl-c、idl-c和/或总胆固醇水平的降低。在一个实施例中，按以下剂量给予dsrna：约0.01mg/kg至约10mg/kg，例如约0.05mg/kg至约5mg/kg、约0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.2mg/kg至约5mg/kg、约0.2mg/kg至约10mg/kg、约0.3mg/kg至约5mg/kg、约0.3mg/kg至约10mg/kg、约0.4mg/kg至约5mg/kg、约0.4mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1.5mg/kg至约5mg/kg、约1.5mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约about2.5mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约3mg/kg至约10mg/kg、约3.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约4.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约10mg/kg、约4.5mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约5.5mg/kg至约10mg/kg、约6mg/kg至约10mg/kg、约6.5mg/kg至约10mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约7.5mg/kg至约10mg/kg、约8mg/kg至约10mg/kg、约8.5mg/kg至约10mg/kg、约9mg/kg至约10mg/kg、或约9.5mg/kg至约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。例如，可以按以下剂量给予dsrna：约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。在另一个实施例中，按以下剂量给予dsrna：约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kb、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kb、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kb、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kb、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kb、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。例如，可以给予受试者治疗量的irna：例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。在另一个方面，本发明提供抑制angptl3在受试者体内表达的方法。该方法包括向该受试者给予一个治疗有效量的本发明的dsrna或载体，由此抑制angptl3在受试者体内表达。在仍另一个方面，本发明提供用于执行本发明的方法的试剂盒。在一个方面，本发明提供用于执行抑制angptl3基因在细胞中表达的方法的一种试剂盒，该抑制是通过用一个抑制angptl3在细胞中表达的有效量的一种双链rnai剂接触细胞来进行的。该试剂盒包括一种rnai剂和使用说明书以及任选地用于将该rnai剂给予一个受试者的工具。特别地，本发明涉及以下各项：1.一种用于抑制angptl3表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包括一个正义链和一个反义链，其中所述正义链包括与seqidno：1的核苷酸序列区别在于不多于3个核苷酸的至少15个连续的核苷酸，并且所述反义链包括与seqidno：5的核苷酸序列区别在于不多于3个核苷酸的至少15个连续的核苷酸。2.一种用于抑制angptl3表达的双链核糖核酸(dsrna)，其中所述dsrna包括一个正义链和一个反义链，该反义链包括一个互补性区域，所述互补性区域包括与表2、3、7、8、9和10中列出的反义序列中任一个区别在于不多于3个核苷酸的至少15个连续核苷酸。3.如第2项所述的dsrna，其中该正义链和反义链包括选自下组的序列，该组由以下各项组成：表7和表8的ad-52981.1、ad-53063.1、ad-53001.1、ad-53015.1、ad-52986.1、ad-52953.1、ad-53024.1、ad-53033.1、ad-53030.1、ad-53080.1、ad-53073.1、ad-53132.1、ad-52983.1、ad-52954.1、ad-52961.1、ad-52994.1、ad-52970.1、ad-53075.1、ad-53147.1、ad-53077.1。4.如第1或2项所述的dsrna，其中所述dsrna包括至少一个修饰的核苷酸。5.如第4项所述的dsrna，其中所述修饰的核苷酸的至少一个选自下组，该组由以下各项组成：一种2′-0-甲基修饰的核苷酸、一种包括5′-硫代磷酸酯基的核苷酸、以及与一种胆甾烯基衍生物或一种十二烷酸双癸酰胺基连接的一种末端核苷酸。6.如第4项所述的dsrna，其中所述的经修饰的核苷酸选自下组，该组由以下各项组成：一种2′-脱氧-2′-氟修饰的核苷酸、一种2′-脱氧修饰的核苷酸、一种锁定的核苷酸、一种脱碱基核苷酸、一种2’-氨基修饰的核苷酸、一种2’-烷基修饰的核苷酸、一种吗啉代核苷酸、一种氨基磷酸酯、以及一种包括非天然碱基的核苷酸。7.如第2项所述的dsrna，其中该互补性区域是至少17个核苷酸长度。8.如第2项所述的dsrna，其中该互补性区域是在19个和21个核苷酸长度之间。9.如第8项所述的dsrna，其中该互补性区域是19个核苷酸长度。10.如第1或2项所述的dsrna，其中每个链不多于30个核苷酸长度。11.如第1或2项所述的dsrna，其中至少一个链包括至少1个核苷酸的3′突出端。12.如第1或2项所述的dsrna，其中至少一个链包括至少2个核苷酸的3′突出端。13.如第1或2项所述的dsrna，进一步包括一个配体。14.如第13项所述的dsrna，其中该配体轭合至该dsrna的正义链的3’末端。15.如第13项所述的dsrna，其中该配体是一种n-乙酰半乳糖胺(galnac)衍生物。16.如第13项所述的dsrna，其中该配体是17.如第2项所述的dsrna，其中该互补性区域由表2、3、7、8、9和10的反义序列之一组成。18.如第1或2项所述的dsrna，其中该dsrna包括由选自表2、3、9和10的序列的一个正义序列组成的一个正义链和由选自表2、3、7、8、9和10的序列的一个反义序列组成的一个反义链。19.一种细胞，其包含如第1或2项所述的dsrna。20.一种编码dsrna的至少一个链的载体，其中所述dsrna包括与编码angptl3的mrna的至少一部分互补的一个区域，其中所述dsrna是30个或更少碱基对长度，并且其中所述dsrna靶向所述mrna用于切割。21.如第20项所述的载体，其中该互补性区域是至少15个核苷酸长度。22.如第20项所述的载体，其中该互补性区域是19个至21个核苷酸长度。23.一种细胞，包含如第20项所述的载体。24.一种用于抑制一种angptl3基因表达的药物组合物，包括如第1或2项所述的dsrna或如第20项所述的载体。25.如第24项所述的药物组合物，进一步包括一种脂质配制品。26.如第24项所述的药物组合物，其中该脂质配制品包括snalp、或xtc。27.如第24项所述的药物组合物，其中该脂质配制品包括一种mc3。28.一种抑制细胞中angptl3表达的方法，该方法包括：(a)用如第1或2项所述的dsrna或如第20项所述的载体接触该细胞；以及(b)维持步骤(a)中产生的细胞一段时间，该时间足以获得angptl3基因的mrna转录物的降解，由此抑制该细胞中的angptl3基因的表达。29.如第28项所述的方法，其中所述细胞是在一个受试者体内。30.如第29项所述的方法，其中该受试者是一个人。31.如第30项所述的方法，其中该人类受试者患有一种脂质代谢作用失调。32.如第31项所述的方法，其中该脂质代谢作用失调是高脂血症或高甘油三酯血症。33.如第28-32项中任一项所述的方法，其中angptl3表达被抑制至少约30％。34.一种治疗患有一种失调的受试者的方法，该受试者将受益于angptl3表达的减少，该方法包括将一个治疗有效量的如第1或2项所述的dsrna或如第20项所述的载体给予该受试者，由此治疗所述受试者。35.如第34项所述的方法，其中该失调是一种脂质代谢作用失调。36.如第35项所述的方法，其中该脂质代谢作用失调是高脂血症或高甘油三酯血症。37.如第34项所述的方法，其中向该受试者给予该dsrna造成一种或多种血脂的减少和/或angptl3蛋白累积的降低。38.如第34项所述的方法，其中将该dsrna以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予。39.一种在一个受试者体内抑制angptl3表达的方法，该方法包括将一个治疗有效量的如第1或2项所述的dsrna或如第20项所述的载体给予所述受试者，由此抑制所述受试者体内的angptl3表达。40.如第39项所述的方法，其中将该dsrna以约0.01mg/kg至约10mg/kg或约5mg/kg至约50mg/kg的剂量给予所述受试者。附图说明图1是用于实例2中所述的体内实验的实验程序的示意图。图2，小图a是示出在用指定irna处理之后的野生小鼠或对照中的angptl3蛋白的测量水平的图表。图2，小图b是示出在用指定irna处理之后的ob/ob小鼠或对照中的angptl3蛋白的测量水平的图表。图3，小图a是示出在用指定irna处理之后的野生小鼠或对照中的ldl-c的测量水平的图表。图3，小图b是示出在用指定irna处理之后的ob/ob小鼠或对照中的ldl-c的测量水平的图表。图4，小图a是示出在用指定irna处理之后的野生小鼠或对照中的甘油三酸酯的测量水平的图表。图4，小图b是示出在用指定irna处理之后的ob/ob小鼠或对照中的甘油三酸酯的测量水平的图表。图5，小图a是示出在用指定irna处理之后的野生小鼠或对照中的总胆固醇(tc)的测量水平的图表。图5，小图b是示出在用指定irna处理之后的ob/ob小鼠或对照中的总胆固醇(tc)的测量水平的图表。图6，小图a是示出在用指定irna处理之后的野生小鼠或对照中的hdl-c的测量水平的图表。图6，小图b是示出在用指定irna处理之后的ob/ob小鼠或对照中的hdl-c的测量水平的图表。图7是示出在用单剂量的指定irna处理之后的人类pcs转基因小鼠或对照中的angptl3蛋白的测量水平的图表。具体实施方式本发明提供irna组合物，该组合物影响rna诱导的沉默复合物(risc)介导的angptl3基因的rna转录物的切割。angptl3可以在一个细胞内，例如在一个受试者例如一个人的体内的一个细胞内。本发明还提供使用本发明的irna组合物的方法，用于抑制angptl3基因的表达和/或用于治疗将受益于angptl3基因表达抑制或减少的患有一种失调(例如一种脂质代谢作用失调，例如高血脂症或高甘油三酯血症)的受试者。本发明的irna包括一个具有约30个核苷酸或更少的长度，例如15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24，20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸的长度的区域的rna链(反义链)，该区域基本上与angptl3基因的mrna转录物的至少一部分互补。这些irna的使用使得能够在哺乳类动物中靶向降解angptl3基因的mrna。非常低剂量的angptl3irna，尤其可以特别且高效地介导rna干扰(rnai)，导致angptl3基因表达的显著抑制。使用基于细胞的测定法，本发明的诸位发明人已经展示靶向angptl3的irna可以介导rnai，导致angptl3基因表达的显著抑制。因此，包括这些irna的方法和组合物对于治疗将从通过减少angptl3蛋白的水平和/或活性获益的受试者，例如患有脂质代谢作用失调，例如高血脂症或高甘油三酯血症的受试者是有用的。以下详述说明书披露了如何制造和使用包含irna的组合物以抑制angptl3基因表达，连同用于治疗将受益于该基因的表达的抑制和/或减少的患有疾病和失调的受试者的组合物和方法。i.定义为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。此外，应指出，每当引用一个参数的值或范围时，它是指这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。此处使用的冠词“一个”和“一种”(a或an)是指该物品的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。通过举例，“一个元件”是指一个元件或多于一个元件，例如多个元件。在此使用的术语“包括(including)”是指短语“包括但不局限于”，并与其互换使用。除非上下文另外明确指示，否则在此使用的术语“或”是指术语“和/或”，并与其互换使用。除非另有说明，否则术语“angptl3”是指具有一个来自任何脊椎动物或哺乳动物来源的氨基酸序列的血管生成素样蛋白3，这些来源包括但不局限于人、牛、鸡、啮齿动物、小鼠、大鼠、猪、绵羊、灵长类、猴、以及豚鼠。该术语还指维持了天然angptl3的至少一种体内或体外活性的天然angptl3的片段和变体。该术语涵盖全长未加工的前体形式的angptl3，连同得自信号肽的翻译后切割的成熟形式和得自纤维蛋白原样域的蛋白酶解加工的形式。人angptl3mrna转录物的序列可以按例如genbank登录号gi：41327750(nm014495.2；seqidno：1)找到。恒河猴angptl3mrna的预测序列可以按例如genbank登录号gi：297278846(xm_001086114.2；seqidno：2)找到。小鼠angptl3mrna的序列可以按例如genbank登录号gi：142388354(nm_013913.3；seqidno：3)找到。大鼠angptl3mrna的序列可以按例如genbank登录号gi：68163568(nm_001025065.1；seqidno：4)找到。如在此使用的术语“angptl3”还指在细胞中通过angptl3基因的天然发生的dna序列变化，例如angptl3基因的单核苷酸多态性表达的具体多肽。已经鉴定了angptl3基因内的众多的snp并可以在例如ncbidbsnp(见例如www.ncbi.nlm.nih.gov/snp)中找到。angptl3基因内的snp的非限制实例可以在ncbidbsnp登录号rs193064039、rs192778191、rs192764027、rs192528948、rs191931953、rs191293319、rs191171206、rs191145608、rs191086880、rs191012841、或rs190255403中找到。如在此使用，“靶序列”指的是在angptl3基因的转录期间形成的mrna分子的核苷酸序列的连续部分，包括为初级转录产物的rna加工产物的mrna。在一个实施例中，序列的靶部分将至少足够地长，以充当irna指导在angptl3基因的转录期间形成的mrna分子的核苷酸序列的部分或其附近切割的底物。该靶序列可以是从约9-36个核苷酸的长度，例如约15-30个核苷酸的长度。例如，该靶序列可能是从约15-30个核苷酸，15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24，20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸的长度。以上引用的范围与长度的中间范围与长度也预期成为本发明的一部分。如在此使用，术语“包含序列的链”指的是包含由称为使用标准核苷酸命名法的序列描述的核苷酸链的寡核苷酸。“g”、“c”、“a”以及“u”每一者通常分别代表包含鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸苷以及尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应理解术语“核糖核苷酸”或“核苷酸”还可以指一种经修饰的核苷酸(如以下进一步详述)或一种替代性的置换部分。技术人员充分了解，鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和尿嘧啶可以由其他部分替换，而基本上不改变包括携带这类替换部分的核苷酸的寡核苷酸的碱基配对特性。例如，而不局限于，包括肌苷作为其碱基的核苷酸可以与包含腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸发生碱基配对。因此，包含尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可以在本发明中表征的dsrna的核苷酸序列中由包含例如肌苷的核苷酸替换。在另一个实例中，寡核苷酸中任何地方的腺嘌呤和胞嘧啶可以分别地替换为鸟嘌呤和尿嘧啶，以形成与靶mrna的g-u摇摆碱基配对。包含这类替换部分的序列适用于在本发明中表征的组合物和方法。如此处互换使用的术语“irna”、“rnai剂”、“irna剂”、“rna干扰剂”是指包含rna(如在此处定义的术语)的一种剂，并且其经由rna诱导的沉默复合物(risc)通路介导rna转录物的靶向切割。irna通过被称为rna干扰(rnai)的过程指导mrna的序列特异性降解。该irna调节例如抑制angptl3在一个细胞，例如在一个受试者例如一个哺乳动物受试者的体内的一个细胞内的表达。在一个实施例中，本发明的rnai剂包括与一个靶rna序列例如一个angptl3靶mrna序列相互作用的单链rna以指导靶rna的切割。不希望受理论约束，引入细胞中长双链rna由称作dicer的iii型核酸内切酶分解成sirna(sharp(夏普)等人，genesdev.(基因和发育)2001，15：485)。dicer，一种核糖核酸酶-iii-样酶将dsrna加工成至具有特征性双碱基3′突出端的19-23碱基对短干扰性rna(bernstein(伯恩斯坦)等人，(2001)nature(自然)409：363)。这些sirna然后掺入rna诱导性沉默复合物(risc)中，在其中一种或多种解旋酶解开sirna双螺旋，这使得实现互补性反义链指导靶识别(nykanen(奈凯恩)等人，(2001)cell(细胞)107：309)。一旦与适当的靶mrna结合，risc内部的一种或多种核酸内切酶切割靶以诱导沉默(elbashir(厄尔巴瑟)等人，(2001)genesdev.(基因和发育)15：188)。因此，在一个方面，本发明涉及在细胞内生成的并促进影响靶基因(即angptl3基因)沉默的risc复合物形成的单链rna(sirna)。因此，术语“sirna”还可以在此用来指以上所述的rnai。在另一个方面，该rnai剂是一种单链的反义rna分子。反义rna分子与靶mrna内的一个序列互补。反义rna能以化学计量的方式通过与该mrna碱基配对并且物理性地阻碍翻译机器来抑制翻译，参见dias(蒂尔斯)，n.等人，(2002)mol.cancerther.(分子癌症治疗学)1：347-355。单链的反义rna分子可以是约13至约30个核苷酸长并且具有与一个靶序列互补的序列。例如，该单链的反义rna分子可以包括以下这样一个序列：该序列是来自表2、3、7、8、9和10的反义序列之一的至少约13、14、15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸。在另一个实施例中，用于在本发明的组合物和方法中使用的“irna”是双链rna并且在此称为“双链rnai剂”、“双链rna(dsrna)分子”、“dsrna剂”或“dsrna”。术语“dsrna”是指核糖核酸分子的复合物，具有包括两个反向平行的并且基本上互补的核酸链的双螺旋结构，被称为具有相对于靶rna(即angptl3基因)的“正义”和“反义”取向。在本发明的一些实施例中，双链rna(dsrna)通过在此被称为rna干扰或rnai的转录后基因沉默机制引起靶rna(例如mrna)的降解。双螺旋区可以具有允许通过risc通路特异性降解所需靶的任何长度，并且可以在从约9至36碱基对长度的范围内，例如，约15-30个碱基对长度，例如约9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、或36个碱基对长度，例如约15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24，20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对长度。以上这些引用范围与长度的中间范围与长度也预期成为本发明的一部分。形成双链结构的两个链可以是一个更大rna分子的不同部分，或者它们可以是单独的rna分子。在这两个链是一个更大分子的部分并且因此通过一个链的3’-末端与形成该双链结构的对应另一个链的5’-末端之间的非间断核苷酸链而连接的情况下，这一连接的rna链称作“发夹环”。发夹环可以包括至少一个非配对核苷酸。在一些实施例中，发夹环可以包括至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少20个、至少23个或更多个非配对核苷酸。在dsrna的两个基本上互补的链式是由分离的rna分子组成时，那些分子不必但可以被共价地连接。在这两个链是通过除了一个链的3’-末端与形成该双链结构的对应另一个链的5’-末端之间的非间断核苷酸链以外的方式而共价连接的情况下，该连接结构称为“连接物(linker)”。这些rna链可以具有相同或不同数目的核苷酸。碱基对的最大数目是该dsrna的最短链中的核苷酸数目减去存在于该双螺旋中的任何突出。除了双链结构，一个rnai可以包括一个或多个核苷酸突出。如在此使用，术语“核苷酸突出”是指从irna(例如dsrna)的双螺旋结构突出的至少一个未配对核苷酸。例如，当dsrna的一个链的3′-端延伸超过另一个链的5′-端时或反之亦然，存在核苷酸突出端。dsrna可以包括至少一个核苷酸的突出端；可替代地，该突出端可以包括至少两个核苷酸、至少三个核苷酸、至少四个核苷酸、至少五个或更多个核苷酸。核苷酸突出端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。这一个或多个突出端可以处于正义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsrna的反义或正义链的5′末端、3′末端或两个末端上。在一个实施例中，dsrna的反义链在3′末端和/或5′末端具有一个1-10个核苷酸的突出端，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸的突出端。在一个实施例中，dsrna的正义链在3′末端和/或5′末端具有一个1-10个核苷酸的突出端，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个核苷酸的突出端。在另一个实施例中，将突出端中的一个或多个核苷酸替换为硫代磷酸核苷。如在此使用的关于dsrna的术语“平端”或“平末端”意思是在dsrna的给定的末端没有非配对的核苷酸或核苷酸类似物，即，没有核苷酸的突出端。dsrna的一个或两个末端可以是齐平的。在dsrna的两端都是齐平的情况下，该dsrna被称为平端的。要明确的是，一个“平端的”dsrna是两端都是齐平的dsrna，即，在该分子的任何一端都没有核苷酸的突出端。大多数情况下，这种分子将在其整个长度范围内是双链的。术语“反义链”或“引导链”指的是irna例如dsrna的链，该链包括与一个靶序列例如angptl3mrna基本上互补的区域。如在此使用，术语“互补性区域”指的是该反义链上与一个序列，例如，如在此定义的一个靶序列例如angptl3核苷酸序列基本上互补的区域。其中互补性区域不与靶序列完全互补的情况下，错配可以存在于分子的内部或末端区域内。通常，最耐受的错配存在于末端区域内，例如，在该irna的5′和/或3′末端的5、4、3或2个核苷酸内部。如在此所使用的术语“正义链”或“随从链”指的是包含与反义链区域基本上互补的区域的irna链，反义链是如此处定义的那个术语。如在此使用，除非另有陈述，术语“互补”当用于相对于第二核苷酸序列描述第一核苷酸序列时，指的是包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一定条件下和包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸杂交并形成双链结构的能力，如本领域普通技术人员所理解。这样的情况可以是例如严格条件，这里严格条件可以包括：400mmnacl，40mmpipesph6.4，1mmedta，50℃或70℃持续12-16小时，随后洗涤(参见例如″molecularcloning：alaboratorymanual.(分子克隆实验指南)″，sambrook(萨姆布鲁克)等人(1989)coldspringharborlaboratorypress(冷泉港实验室出版社))。可以应用其他条件，例如在如有机体内部可能遭遇的生理相关条件。技术人员将能够根据杂交核苷酸的最终应用，确定最适宜于检验两个序列的互补性的条件集合。在irna内部(例如，在如在此所述的dsrna内部)的互补序列包括包括第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸与包括第二核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在一个或两个核苷酸序列的整个长度范围内的碱基配对。此类序列在此可以称作相对于彼此“完全互补”。然而，在此在一个第一序列被称作相对于一个第二序列“基本上互补”的情况下，这两序列可以是完全互补的，或者对于一个达30个碱基对的双螺旋它们可以在杂交时形成一个或多个，但是总体上不多于5个、4个、3个或2个错配碱基配对，同时保留了在与它们的最终应用(例如经由risc通路抑制基因表达)最相关的条件下杂交的能力。然而，其中在两个寡核苷酸设计成杂交时形成一个或多个单链突出端的情况下，就确定互补性而言，这类突出端不应当视作错配。例如，出于在此描述的目的，以下这样一种dsrna也可以称作“完全互补”：该dsrna包括一个长度为21个核苷酸的寡核苷酸以及一个长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸，其中更长的寡核苷酸包括一个与更短的寡核苷酸完全互补的21个核苷酸的序列。如在此使用，就满足以上相对于它们杂交的能力而言的要求来说，“互补”序列还可以包括或完全形成自非watson(沃森)-crick(克里克)碱基对和/或从非天然的以及经修饰的核苷酸形成的碱基对。此类非watson(沃森)-crick(克里克)碱基对包括但不局限于g：u摇摆碱基配对或hoogstein(胡格斯腾)碱基配对。在此术语“互补”、“完全互补”和“基本上互补”可相对于在dsrna的正义链与反义链之间，或irna剂的反义链与靶序列之间的碱基配对使用，如将从其使用的上下文理解。如在此使用，与信使rna(mrna)的“至少一部分基本上互补”的多核苷酸指与感兴趣的mrna(例如，编码angptl3的mrna))的一个连续部分基本互补的多核苷酸。例如，如果一个多核苷酸与编码angptl3的mrna的一个非间断部分基本上互补，那么该序列则与angptl3mrna的至少一部分互补。总体上，每一链的大部分的核苷酸是核糖核苷酸，但是如在此详述的，两个链的每一者或两者还可以包括一种或多种非核糖核苷酸，例如，一种脱氧核糖核苷酸和/或一种经修饰的核苷酸。此外，“irna”可以包括具有化学修饰的核糖核苷酸。这样的修饰可以包括在此所披露的或本领域内已知的所有类型的修饰。出于本说明书以及权利要求书的目的，如在irna分子中所使用的任何此类修饰被“irna”所涵盖。如在此使用，术语“抑制”可与“减少”、“沉默”、“下调”、“制止”以及其他相似的术语互换使用并包括任何水平的抑制。如在此使用，短语“抑制angptl3的表达”包括抑制任何angptl3基因(例如，例如小鼠angptl3基因、大鼠angptl3基因、猴angptl3基因、或人angptl3基因)连同编码angptl3蛋白的angptl3基因的变体或突变体的表达。“抑制angptl3的表达”包括对angptl3基因任何水平的抑制，例如至少部分地制止angptl3基因的表达，例如抑制至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％。angptl3基因的表达可以基于与angptl3基因表达相关联的任何变量的水平，例如angptl3mrna水平或angptl3蛋白水平进行评估。angptl3的表达还可基于血脂、甘油三酸酯、胆固醇(包括ldl-c、hdl-c、vldl-c、idl-c和总胆固醇)、或游离脂肪酸的水平进行间接评估。抑制可通过这些变量中的一种或多种与对照水平相比的绝对或相对水平的降低来评估。对照水平可以是本领域中利用的任何类型的对照水平，例如给药前基线水平或从未处理的或用对照(例如，例如仅缓冲液对照或非活性剂对照)处理的相似受试者、细胞或样品确定的水平。在一个实施例中，angptl3基因的表达的至少部分制止是通过以下进行评估的：可以从angptl3基因在其中转录的一个第一细胞或一组第一细胞(已经过处理，这样使得angptl3基因的表达被抑制)中分离的或检测到的angptl3mrna的量减少，这是与一个第二细胞或一组第二细胞(对照细胞)相比，其与该一个第一细胞或一组第一细胞基本上相同，除了未经受如此的处理。抑制程度可按照以下表示：如在此使用，短语“用一种rnai剂(例如dsrna)接触细胞”包括通过任何可能的手段接触细胞。用一种rnai剂接触细胞包括用该irna体外接触细胞或用该irna体内接触细胞。该接触可以是直接或间接进行的。因此，例如该rnai剂可以通过个体实施该方法与该细胞进行物理接触，或可替代地，可以使该rnai剂处于将允许或引起它随后达到与该细胞接触的情况下。体外接触细胞可以例如通过用该rnai剂孵育该细胞进行。体内接触细胞可以例如通过将该rnai剂注射入或靠近该细胞所处的组织，或通过将该rnai剂注射入另一个区域例如血液流动区域或皮下间隙，这样使得该剂将随后到达待接触的细胞所处的组织来进行。例如，该rnai剂可以包含和/或偶联至一种配体，例如galnac3，该配体将该rnai剂引导至感兴趣的位点例如肝脏。组合体外和体内接触方法也是可能的。例如，还可以用一种rnai剂体外接触细胞并且随后移植入受试者。在一个实施例中，用一种irna剂接触细胞包括通过促进或影响向细胞内的摄取或吸收“引介”或“递送该irna进入细胞”。吸收或摄取irna可以通过无协助扩散过程或主动细胞过程或借助助剂或装置发生。引介irna进入细胞可以是体外和/或体内的。例如，对于体内引介，可以将irna注射入组织部位中或全身给予。体内递送也可以通过β葡聚糖递送系统，例如在美国专利号5,032,401和5,607,677以及美国申请号2005/0281781中所述的那些进行，将它们的全部内容通过引用结合在此。体外引入细胞内包括本领域内已知的方法，例如电穿孔以及脂质转染法。其他方法在下文描述和/或是本领域已知的。术语“snalp”指一种稳定的核酸-脂质颗粒。snalp是指包覆少量水性内部的脂质囊泡，该水性内部包括一种核酸，例如irna或irna从其转录的质粒。snalp是在例如美国专利申请公开号20060240093、20070135372中以及在国际申请号wo2009082817中所述的，将它们的全部内容通过引用结合在此。“snalp”配制品的实例描述于以下。如在此使用，受试者是一种动物，例如一种哺乳动物，包括灵长类(如人类、非人类灵长动物例如猴或黑猩猩)、非灵长类(例如奶牛、猪、骆驼、美洲驼、马、山羊、兔、绵羊、仓鼠、豚鼠、猫、狗、大鼠、小鼠、马、以及鲸)、或鸟(例如鸭或鹅)。在一个实施例中，受试者是人类，例如正被治疗的或针对一种疾病、失调或病况评估的将受益于angptl3表达减少的人；对一种疾病、失调或病况有风险的将受益于angptl3表达减少的人；患有一种疾病、失调或病况的将受益于angptl3表达减少的人；和/或正针对一种疾病、失调或病况进行治疗的将受益于angptl3表达减少的人，如在此所述。如在此使用，术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”指有益的或所希望的结果，包括如降低受试者体内的甘油三酸酯的水平。术语“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”还包括但不局限于减轻或改善脂质代谢作用失调的一种或多种症状，例如出疹性黄瘤尺寸的减小。“治疗”也可以指与没有治疗的预期存活相比的延长存活。上下文中的一种疾病标记或症状的“减少”意为此类水平的统计学上的显著减少。下降可以是例如至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或更多，并且优选地降至作为不患此类失调的个体的正常范围内所接受的水平。如在此使用，“预防(prevention)”或“预防(preventing)”，当关于将受益于angptl3基因表达减少的其一种疾病、失调或病况使用时，是指受试者将发展与这类疾病、失调或病况相关的症状，例如高甘油三酸酯水平或出疹性黄瘤的可能性减少。发展高甘油三酸酯水平或出疹性黄瘤的可能性减少，例如，当对高甘油三酸酯水平或出疹性黄瘤具有一种或多种风险因子的个体未能发展高甘油三酸酯水平或出疹性黄瘤抑或发展了相对于具有相同风险因子但未接受如在此所述的治疗的群体而言更不严重的高甘油三酸酯水平或出疹性黄瘤。未能发展一种疾病、失调或病况，或减少了与此类疾病、失调或病况相关的症状的发展(例如减少对于那种疾病或失调的临床上接受的比例的至少约10％)，或延迟症状的显示延迟(例如按天、周、月或年)被认为是有效的预防。如在此使用，术语“血脂”是指血液中存在的任何主要脂质。血脂可以按自由形式抑或作为蛋白复合物(例如脂蛋白复合物)的一部分存在于血液中。血脂的非限制性实例可包括甘油三酸酯和胆固醇，例如总胆固醇(gt)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、非常低密度脂蛋白胆固醇(vldl-c)以及中等密度脂蛋白胆固醇(idl-c)。如在此使用，“脂质代谢作用失调”是指与脂质代谢作用中的扰动相关的或由其引起的任何失调。例如，该术语包括可以导致高血脂症的任何失调、疾病或病况，或特征为血液中任何或所有脂质和/或脂蛋白的水平异常升高的病况。该术语指遗传性失调，例如家族性高甘油三酯血症，或获得性失调，例如因为膳食或摄取某些药物而获得的失调。示例性的脂质代谢作用失调包括但不局限于动脉硬化、血脂障碍、高甘油三酯血症(包括药物诱导的高甘油三酯血症、利尿剂诱导的高甘油三酯血症、酒精诱导的高甘油三酯血症、β-肾上腺素能阻断剂诱导的高甘油三酯血症、雌性激素诱导的高甘油三酯血症、糖皮质激素诱导的高甘油三酯血症、类视黄醇诱导的高甘油三酯血症、甲腈咪胍诱导的高甘油三酯血症、以及家族性高甘油三酯血症)、与高甘油三酯血症有关的急性胰腺炎、乳糜微粒综合征(chylomicronsyndrom)、家族性乳糜微粒血症(familialchylomicronemia)、apo-e缺陷或抗性、lpl缺陷或活动衰减、高血脂症(包括家族性复合高脂血症)、高胆固醇血症、与高胆固醇血症有关的痛风、黄瘤病(皮下胆固醇沉积)。与脂质代谢作用失调有关的心血管疾病还被认为“脂质代谢作用失调”，如在此定义。这些疾病可以包括冠状动脉疾病(还称为缺血性心脏病)、与冠状动脉疾病相关的炎症、再狭窄、周围性血管疾病、以及中风。与体重有关的失调还被认为“脂质代谢作用失调”，如在此定义。此类失调可以包括肥胖、包括代谢性综合征的独立组分(例如向心性肥胖、fbg/糖尿病前期/糖尿病、高胆固醇血症、高甘油三酯血症、以及高血压)的代谢性综合征，、甲状腺功能减退、尿毒症，以及其他与体重增加(包括快速体重增加)、体重减少、体重减少的维持、或在体重减少之后的体重再增加的风险相关的病况。血糖失调还进一步被认为“脂质代谢作用失调”，如在此定义。此类失调可以包括糖尿病、高血压、和与胰岛素耐受性相关的多囊卵巢综合征。其他示例性的脂质代谢作用失调还可以包括肾移植、肾病综合征、库兴综合症、肢端肥大症、系统性红斑性狼疮、血球蛋白异常、脂质营养不良、糖原病i型、以及阿狄森病。如在此使用，“治疗有效量”意在包括该量的rnai剂，当给予一个患有脂质代谢作用失调的受试者时是足够影响该疾病的治疗的(例如通过减小、改善或维持目前的疾病或疾病的一种或多种症状)。该“治疗有效量”可以取决于该rnai剂、该剂是如何给予的、该疾病及其严重度以及病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、先前的或伴随的治疗的类型，如果有，以及待治疗的受试者的其他个体特征。如在此使用，“预防有效量”意在包括该量的irna，当给予一个患有脂质代谢作用失调的受试者时是足够预防或改善该疾病或该疾病的一种或多种症状。改善该疾病包括减缓该疾病的进程或减少后期发展疾病的严重度。“预防有效量”可以取决于该irna、该剂是如何给予的、疾病的风险等级、以及病史、年龄、体重、家族史、遗传组成、先前的或伴随的治疗的类型，如果有，以及待治疗的患者的其他个体特征。“治疗有效量”或“预防有效量”还包括产生一些适用于任何治疗的以合理的益处/风险比的所希望的局部的或全身的效果的一个量的rnai剂。在本发明的这些方法中所采用的irna还可以按产生一个适用于此类治疗的合理的益处/风险比的一个足够的量给予。此处采用的短语“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人类受试者和动物受试者的组织相接触使用，而无过度毒性、刺激、过敏反应、或其他问题或并发症，同时具有相称的合理受益/风险比的那些化合物、材料、组合物、和/或剂型。在此使用的短语“药学上可接受的载体”是指一种药学上可接受的材料、组合物或运载体，例如一种液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、制造助剂(例如滑润剂，滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或硬脂酸锌，或硬脂酸)、或溶剂封装材料，涉及将该受试化合物从一个器官、或身体的部分搬运或输送至另一种器官或身体的部分。在与配制品其它成分相容的意义上来讲，每种载体必须是“可接受的”，并且对正治疗的受试者无害。可以充当药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：(1)糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和纤维素乙酸酯；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)润滑剂，例如镁盐(magnesiumstate)，月桂基硫酸钠和滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；(9)油，例如花生油、棉花籽油、红花油，香油，橄榄油，玉米油和豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格溶液；(19)乙醇；(20)ph缓冲溶液；(21)多酯，聚碳酸酯和/或聚酐；(22)膨松剂，例如多肽和氨基酸(23)血清成分，例如血清白蛋白、hdl和ldl；以及(22)其他用于药物配制品中的无毒的相容的物质。如在此使用，术语“样品”包括从受试者分离的相似流体、细胞或组织连同存在于受试者体内的流体、细胞或组织的采集物。生物流体的实例包括血液、血清和浆膜液、血浆、脑脊髓液、眼内液、淋巴液、尿、唾液、等。组织样品可以包括来自组织、器官或局部区域的样品。例如，样品可以源自具体的器官、部分器官、或那些器官内的流体或细胞。在某些实施例中，样品可以源自从肝脏(例如整个肝脏或肝脏的某些段或肝脏中的细胞的某些类型，例如肝细胞)。在一些实施例中，“源自受试者的样品”是指取自受试者的血液或血浆。ii.本发明的irna在此描述了抑制angptl3基因表达的irna。在一个实施例中，irna剂包括双链核糖核酸(dsrna)分子，用于抑制细胞，例如受试者(例如哺乳动物，例如患有脂质代谢作用失调(例如家族性高脂血症)的人)体内的细胞中angptl3基因表达。dsrna包括反义链，所述反义链具有与angptl3基因表达中形成的mrna的至少一部分互补的互补性区域。该互补性区域是约30个核苷酸或更少的长度(例如约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19或18个核苷酸或更少的长度)。当与表达angptl3基因的细胞接触时，该irna抑制angptl3基因(例如人、灵长类、非灵长类、或鸟的angptl3基因)的表达至少约10％，如通过例如基于pcr或分支dna方法或基于蛋白的方法，例如免疫荧光分析，使用例如蛋白印迹法或流式细胞计数技术测定。dsrna包括互补并在其中将使用dsrna的条件下杂交以形成双螺旋结构的两个rna链。dsrna的一个链(反义链)包括与靶序列基本上互补并且通常与靶序列完全互补的互补性区域。靶序列可以源自angptl3基因表达期间形成的mrna的序列。另一个链(正义链)包括与反义链互补的区域，这样使得在适合的条件下组合时，这两个链杂交并形成双螺旋结构。如本文中他处描述并且如本领域已知，与处在分立的寡核苷酸上相反，dsrna的互补序列也可以作为单一核酸分子的自我互补区域而包含。通常，该双螺旋结构为在15与30个碱基对之间的长度，例如在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24，20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对之间的长度。以上这些引用范围与长度的中间范围与长度也预期成为本发明的一部分。类似地，靶序列的互补性区域具有15和30个核苷酸之间的长度，例如在15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24，20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个核苷酸之间的长度。以上这些引用范围与长度的中间范围与长度也预期成为本发明的一部分。在一些实施例中，该dsrna是在约15与约20个核苷酸之间的长度，或在约25与约30个核苷酸之间的长度。通常，该dsrna是足够长来充当dicer酶的底物。例如，本领域内熟知比约21-23个核苷酸更长的dsrna可以充当dicer酶的底物。如普通技术人员还将认识到，被靶向用于切割的rna的区域将最经常是更大rna分子(通常是mrna分子)的一部分。在相关的情况下，mrna靶的一“部分”是mrna靶的连续序列，其长度足够允许它作为rnai指导的切割的底物(即，通过risc通路的切割)。本领域普通技术人员也将认识到，双螺旋区域是dsrna的主要功能性部分，例如，约9至36个碱基对，例如，约10-36、11-36、12-36、13-36、14-36、15-36、9-35、10-35、11-35、12-35、13-35、14-35、15-35、9-34、10-34、11-34、12-34、13-34、14-34、15-34、9-33、10-33、11-33、12-33、13-33、14-33、15-33、9-32、10-32、11-32、12-32、13-32、14-32、15-32、9-31、10-31、11-31、12-31、13-32、14-31、15-31、15-30、15-29、15-28、15-27、15-26、15-25、15-24、15-23、15-22、15-21、15-20、15-19、15-18、15-17、18-30、18-29、18-28、18-27、18-26、18-25、18-24、18-23、18-22、18-21、18-20、19-30、19-29、19-28、19-27、19-26、19-25、19-24、19-23、19-22、19-21、19-20、20-30、20-29、20-28、20-27、20-26、20-25、20-24，20-23、20-22、20-21、21-30、21-29、21-28、21-27、21-26、21-25、21-24、21-23、或21-22个碱基对的双螺旋区域。因此，在一个实施例中，为了达到变得被加工成靶向所希望的rna切割的(例如，15-30个碱基对)功能性双螺旋的程度，具有大于30个碱基对的双螺旋区的rna分子或rna分子复合物是dsrna。因此，普通技术人员将认识到在一个实施例中mirna是dsrna。在另一个实施例中，dsrna不是天然存在的mirna。在另一个实施例中，对于靶向angptl3表达有用的irna剂不是在靶细胞中通过切割更大dsrna产生的。如在此所述的dsrna可以进一步包括一个或多个单链核苷酸突出端，例如1、2、3、或4个核苷酸。具有至少一个核苷酸突出端的dsrna相对于它们的平端化对应物，可以具有出乎意料优越的抑制性特性。核苷酸突出端可以包括核苷酸/核苷类似物(包括脱氧核苷酸/核苷)或由其组成。一个或多个突出端可以处于正义链、反义链或其任何组合上。此外，突出端的一个或多个核苷酸可以存在于dsrna的反义抑或正义链的5′末端、3′末端或两个末端上。dsrna可以通过如下文进一步讨论的本领域已知的标准方法合成，例如，通过使用自动化dna合成仪，例如从biosearch，appliedbiosystems，inc.(百思勤，应用生物系统公司)可商购。本发明的irna化合物可以使用一种二步程序制备。第一步，分别制备该双链rna分子的个链。然后，退火这些组分链。可以使用溶液相或固相有机合成或两者制备该sirna化合物的个链。有机合成提供以下优势：可以容易地制备包括非天然或修饰的核苷酸的寡核苷酸链。本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固相有机合成或两者制备。在一个方面，本发明的dsrna包括至少两个核苷酸序列，一个正义序列和一个反义序列。该正义链是选自表2、3、7、8、9和10中提供的序列的组中，并且该正义链的相应的反义链是是选自表2、3、7、8、9和10的序列的组中。在这个方面，两个序列的一者与两个序列的另一者互补，其中所述序列中的一者与angptl3基因表达中产生的mrna的序列基本上互补。就这一点而论，在这个方面，dsrna将包括两个寡核苷酸，其中将一个寡核苷酸描述为表2、3、7、8、9和10中的正义链并且将第二寡核苷酸描述为表2、3、7、8、9和10中的正义链的相应反义链。在一个实施例中，该dsrna的基本上互补的序列包含于分离的寡核苷酸上。在另一个实施例中，该dsrna的基本上互补的序列包含于单个寡核苷酸上。技术人员将很好的意识到，具有约20与23个碱基对之间(例如21个碱基对)的双链结构的dsrna被誉为是尤其有效地诱导rna干扰(elbashir(厄尔巴瑟)等人，(2001)emboj.(embo期刊)，20：6877-6888)。然而，其他人已经发现更短或更长的rna双螺旋结构物也可以是有效的(chu(朱)和rana(拉纳)(2007)rna14：1714-1719；kim(金姆)等人(2005)natbiotech(自然·生物技术)23：222-226)。在上文描述的实施例中，由于表2、3、7、8、9和10中提供的寡核苷酸序列的性质，在此所述的dsrna可以包括长度最小21个核苷酸的至少一个链。可以合理地预期，具有表2、3、7、8、9和10中的序列之一的、在一个末端或两个末端减去仅数个核苷酸的更短的双螺旋与以上描述的dsrna相比可以类似地有效。因此，在本发明的范围内预期这样的dsrna，它们具有源自表2、3、7、8、9和10中的一个序列的至少15个、16个、17个、18个、19个、20个或更多个连续核苷酸的序列，并且在它们抑制angptl3基因表达不多于约5％、10％、15％、20％、25％或30％的能力方面与包括全序列的dsrna不同。此外，表2、3、7、8、9和10中提供的rna鉴定在angptl3转录物中对risc介导切割敏感的一个或多个位点。就这一点而论，本发明进一步表征了靶向这些位点之一内部的irna。如在此使用，如果一种irna促进在某个具体位点内部任何地方切割rna转录物，则称这种irna靶向该转录物内部的这个具体位点。这种irna通常将包括来自表2、3、7、8、9和10中提供的一个序列的至少约15个连续核苷酸，所述连续核苷酸与从angptl3基因中的选择序列保持连续的区域所取得的额外核苷酸序列连接。尽管靶序列总体上是约15-30个核苷酸长度，但是在这个范围内的具体序列指导任何给定靶rna切割的适用性方面存在广泛变异。此处提出的不同的软件包和这些指南为识别任何给定的基因靶的最佳靶序列提供指引，但是还可采取一个实证方法，其中给定尺寸(例如非限制性实例，21个核苷酸)的一个“窗”或“模”被逐字地或象征性地(包括，例如电脑模拟)放置于该靶rna序列上以鉴定该尺寸范围内可以充当靶序列的序列。通过渐进地移动该序列“窗”，初始靶序列位置，下一个潜在靶序列的一个核苷酸上游或下游可被鉴定，直至全套可能的序列被鉴定出选定的任何给定靶大小。该过程与用来鉴定那些最佳执行的序列的鉴定序列(使用此处所述的或本领域内已知的测定)的系统合成和测试相结合，可以鉴定那些rna序列，当用一种irna剂靶定时，这些rna序列介导靶基因表达的最佳抑制。因此，当被鉴定的序列，例如表2、3、7、8、9和10中的，代表了有效的靶序列时，它预期通过渐进地“推进该窗”沿给定序列向上游或下游一个核苷酸，可以实现抑制效率的进一步优化，以鉴定具有相等的或更好的抑制特征的序列。另外，预期对于鉴定的任何序列，例如表2、3、7、8、9和10中的序列，可以通过以下方式实现进一步优化：系统添加抑或移出核苷酸以产生更长或更短的序列，并且测试通过将更长或更短尺寸的窗从该点沿靶rna向上或向下推进所产生的那些序列。再次，使这种方法与产生新候选物靶联系，同时在如本领域已知和/或如在此所述的抑制测定法中基于这些靶序列测试irna的有效性，可以导致效率抑制的进一步改善。再者，可以例如通过引入如在此所述或如本领域已知的修饰核苷酸、添加或改变突出端或如本领域已知和/或在此讨论的其他修饰，调节此类优化的序列以便进一步优化该分子(例如，增加血清稳定性或循环半寿期、增加热稳定性、增强跨膜递送、靶向具体位置或细胞类型、增加与沉默通路酶的相互作用、增加从内涵体释放)作为表达抑制剂。如在此所述的irna可以包含一个或多个相对于靶序列的错配。在一个实施例中，如在此所述的irna包含不多于3个错配。如果irna的反义链包含靶序列的错配，则优选错配区域不位于互补性区域的中心内。如果irna的反义链包含靶序列的错配，则优选错配区域应当局限于距互补性区域5′抑或3′末端的最末5个核苷酸内。例如，对于一个23个核苷酸的、与一个angptl3基因的一个区域互补的irna剂链而言，通常在中心13个核苷酸内不包含任何错配。在此所述的方法或本领域已知的方法可以用来确定包含靶序列的错配的irna是否有效抑制angptl3基因表达。考虑具有错配的irna在抑制angptl3基因表达方面的功效是重要的，尤其是如果angptl3基因中的具体互补性区域已知在群体内具有多态性序列变异。iii.本发明的修饰irna在一个实施例中，将本发明的irna(例如，dsrna)的rna化学修饰以增强稳定性或其他有益特征。本发明所表征的核酸可以通过本领域内良好建立的方法来进行合成和/或修饰，例如描述于“currentprotocolsinnucleicacidchemistry(当前核酸化学方案)”，beaucage，s.l.(比尤克居，s.l.)(编)，johnwiley&sons，inc.(约翰威利父子公司)，纽约，纽约州，美国中的那些，通过引用将其结合在此。修饰包括例如末端修饰，例如，5′末端修饰(磷酸化、共轭、倒置键)或3′末端修饰(共轭、dna核苷酸、倒置键等)；碱基修饰，例如，替换为稳定性碱基、去稳定性碱基、或与扩充的配偶物库发生碱基配对的碱基、移除碱基(非碱基核苷酸)、或共轭的碱基；糖修饰(例如，在2′位置或4′位置)或糖的替换；和/或主链修饰，包括修饰或替换磷酸二酯键。在此所述的实施例中的有用的irna化合物的特定实例包括但不局限于包含修饰主链或无天然核苷间键的rna。除此以外，具有修饰主链的rna包括在主链中不具有磷原子的那些。出于本说明书的目的和如有时本领域中谈及，也可以将在其核苷间主链中不具有磷原子的修饰rna视为寡核苷酸。在一些实施例中，修饰的irna将在其核苷间主链中具有磷原子。修饰的rna主链包括例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯，包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯、次膦酸酯、磷酰胺酯，包括3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯、硫代羰基磷酰胺酯、硫代羰基烷基膦酸酯、硫代羰基烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键的硼烷磷酸酯、这些酯的2′-5′连接的类似物，和具有反转极性的那些酯，其中相邻对的核苷单位为3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接。也包括不同盐、混合盐和游离酸形式。教授制备以上含磷键的代表性美国专利包括但不局限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利re39464，将它们每个的全部内容通过引用结合在此。其中不包括磷原子的修饰的rna主链具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或者一个或多个短链杂原子核苷间键或杂环核苷间键形成的主链。这些包括具有以下结构的那些：吗啉代键(从核苷的糖部分中部分地形成)；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基主链；含亚烷基的主链；氨基磺酸盐主链；亚甲亚氨基和亚甲肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链；和具有混合n、o、s和ch2组分部分的其他主链。教授制备以上寡核苷的代表性美国专利包括但不局限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439，将它们每个的全部内容通过引用结合在此。在其他实施例中，预期了适合的rna模拟物用于在irna中使用，其中将该核苷酸单位的糖和核苷间键即主链两者都替换为新基团。维持碱基单位用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物，已经示出具有优异杂交特性的rna模拟物，称作肽核酸(pna)。在pna化合物中，rna的糖主链替换为包含酰胺的主链，尤其氨基乙基甘氨酸主链。核碱基保留并且直接或间接地与主链的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教授制备pna化合物的代表性美国专利包括但不局限于美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262，将它们每个的全部内容通过引用结合在此。适合于在本发明的irna中使用的额外的pna化合物是在例如nielsen(尼尔森)等人，science(科学)，1991，254，1497-1500中描述的。本发明中表征的一些实施例包括具有硫代磷酸酯主链的rna和具有杂原子主链的寡核苷，并且尤其上文所参考美国专利号5,489,677的--ch2--nh--ch2-，--ch2--n(ch3)--o--ch2--[称作亚甲基(甲基亚氨基)或mmi主链]、--ch2--o--n(ch3)--ch2--，--ch2--n(ch3)--n(ch3)--ch2--和--n(ch3)--ch2--ch2--[其中天然磷酸二酯主链表述为--o--p--o--ch2--]，和上文所参考美国专利号5,602,240的酰胺主链。在一些实施例中，在此表征的rna具有上文所参考美国专利号5,034,506的吗啉代主链结构。修饰的rnas也可以包含一个或多个取代的糖部分。在此表征的irna(例如，dsrna)可以在2′位置包括以下之一：oh；f；o-、s-或n-烷基；o-、s-或n-烯基；o-、s-或n-炔基；或o-烷基-o-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的c1至c10烷基或c2至c10烯基和炔基。示例性的适合修饰包括o[(ch2)no]mch3、o(ch2).noch3、o(ch2)nnh2、o(ch2)nch3、o(ch2)nonh2、和o(ch2)non[(ch2)nch3)]2，其中n和m是从1至约10。在其他实施例中，dsrna在2′位置包括以下之一：c1至c10低级烷基、取代的低级烷基、烷芳基、芳烷基、o-烷芳基或o-芳烷基、sh、sch3、ocn、cl、br、cn、cf3、ocf3、soch3、so2ch3、ono2、no2、n3、nh2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨烷基氨基、聚烷氨基、取代的甲硅烷基、rna切割基团、报告子基团、嵌入剂、用于改善irna的药物代谢动力学特性的基团或用于改善irna的药效特性的基团、和具有相似特性的其他取代基。在一些实施例中，该修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-o--ch2ch2och3，也称作2′-o-(2-甲氧基乙基)或2′-moe)(martin(马丁)等人，helv.chim.acta(瑞士化学学报)，1995，78，486-504)，即，一个烷氧基-烷氧基基团。另一种示例性修饰是2’-二甲基氨基氧乙氧基，即o(ch2)2on(ch3)2基团，如在以下实例中所描述的也称作2′-dmaoe，以及2’-二甲基氨基乙氧基乙氧基(在本领域中也称作2’-o-二甲基氨基乙氧基乙基或2’-dmaeoe)，即2′-o--ch2--o--ch2--n(ch2)2。其他修饰包括2′-甲氧基(2′-och3)、2′-氨基丙氧基(2′-och2ch2ch2nh2)和2′-氟(2′-f)。也可以在irna的rna上的其他位置处作出相似的修饰，尤其在3′末端核苷酸上或在2′-5′连接的dsrna中糖的3′位置和5′末端核苷酸的5′位置。irna还可以具有糖模拟物，例如替代呋喃戊糖的环丁基部分。教授制备此类修饰糖结构的代表性美国专利包括但不局限于，美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，所述专利的某些由本申请共同所有。将前述的每个的全部内容通过引用结合在此。irna还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰物或取代物。如在此使用，“非修饰”或“天然”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(a)和鸟嘌呤(g)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(t)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)。经修饰核碱基包括但不局限于其他合成以及天然核碱基例如5-甲基胞嘧啶(5-me-c)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基以及其他烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶以及2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶以及胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶以及胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶以及胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-卤基，8-氨基，8-氢硫基，8-硫烷基，8-羟基以及其他8-取代腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤基尤其是5-溴，5-三氟甲基以及其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤，7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤，以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。另外的核碱基包括在美国专利号3,687,808中披露的那些、在modifiednucleosidesinbiochemistry(生物化学种的修饰核苷)，biotechnologyandmedicine(生物技术和医药)，herdewijn(赫德维金)，p.编辑.wiley(威利)-vch，2008中披露的那些；在theconciseencyclopediaofpolymerscienceandengineering(聚合物科学与工程简明百科全书)，第858-859页，kroschwitz(克洛舍维奇)，j.l编辑，johnwiley&sons(约翰威利出版公司)，1990年中披露的那些、在englisch(恩利施)等人，(1991)angewandtechemie(应用化学)，国际版，30，613中披露的那些、以及在sanghvi(赛格维)，y.s.，第15章，dsrnaresearchandapplications(dsrna研究与应用)，第289-302页，crooke(克鲁克)，s.t.和lebleu(拉布列)，b.编辑，crc出版社，1993中披露的那些。这些核碱基的某些对于增加本发明中表征的寡聚化合物的结合亲和力特别有用。这些碱基包括5-取代的嘧啶、6-氮嘧啶以及n-2、n-6以及0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶以及5-丙炔基胞嘧啶。已经示出，5-甲基胞嘧啶取代提高核酸双螺旋的稳定性0.6℃-1.2℃(sanghvi，y.s.(桑格威，y.s.)，crooke，s.t.(克鲁克，s.t.)以及lebleu，b.(勒布鲁，b.)，eds.，dsrnaresearchandapplications(dsrna研究与应用)，crcpress(crc出版社)，bocaraton(波卡拉顿)，1993，第276-278页)，并是示例性的碱基取代，甚至更加特别地为当与2’-o-甲氧基乙基糖修饰组合时。教授制备某些上述修饰的核碱基连同其他修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不局限于上述的美国专利号3,687,808；4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088，将它们每个的全部内容通过引用结合在此。也可以修饰irna的rna以包括一个或多个锁核酸(lna)。a锁核酸是具有修饰核糖部分的核苷酸，其中所述核糖部分包括连接2′碳和4′碳的额外桥。该结构有效地将该核糖“锁”在3′-内切结构构象中。向sirna添加锁核酸已经示出增加血清中的sirna稳定性并且减少脱靶效应(elmen(埃尔曼)，j.等人，(2005)nucleicacidsresearch(核酸研究)33(1)：439-447；mook(穆克)，or.等人，(2007)molcancther(分子癌症治疗学)6(3)：833-843；grunweller(格仁威尔)，a.等人，(2003)nucleicacidsresearch(核酸研究)31(12)：3185-3193)。教授制备锁核酸核苷酸的代表性美国专利包括但不局限于以下：美国专利号6,268,490；6,670,461；6,794,499；6,998,484；7,053,207；7,084,125；和7,399,845，将它们每个的全部内容通过引用结合在此。对rna分子的末端的潜在稳定修饰可包括n-(乙酰基氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(hyp-c6-nhac)、n-(己酰基-4-羟脯氨醇(hyp-c6)、n-(乙酰基-4-羟脯氨醇(hyp-nhac)、胸苷-2′-0-脱氧胸苷(醚)、n-(氨基己酰基)-4-羟脯氨醇(hyp-c6-氨基)、2-二十二醇基-尿苷-3″-磷酸酯、反向碱基dt(idt)以及其他。此修饰的披露可以在pct申请号wo2011/005861中找到。iv.irna共轭至配体本发明的irna的rna的另一种修饰涉及使rna化学连接至一种或多种增强irna的活性、细胞分布、或细胞摄取的配体、部分或共轭物。此类部分包括但不局限于脂质部分，例如胆固醇部分(letsinger(乐欣格)等人，(1989)proc.natl.acid.sci.usa(美国科学院院刊)，86：6553-6556)，胆酸(manoharan(马诺汗)等人，(1994)biorg.med.chem.let.(生物有机化学与医药化学快报)，4：1053-1060)，硫醚，例如beryl基-s-三苯甲基硫醇(manoharan(马诺汗)等人，(1992)ann.n.y.acad.sci.(纽约科学院年报)，660：306-309；manoharan(马诺汗)等人，(1993)biorg.med.chem.let.(生物有机化学与医药化学快报)，3：2765-2770)，硫代胆固醇(oberhauser(奥博汗瑟)等人，(1992)nucl.acidsres.(核酸研究)，20：533-538)，脂肪链，例如十二烷基二醇或十一烷基残基(saison-behmoaras(赛森-博和马拉)等人，(1991)emboj(embo期刊)，10：1111-1118；kabanov(卡波诺)等人，(1990)febslett.(febs通讯)，259：327-330；svinarchuk(斯伍那区克)等人，(1993)biochimie(生物化学)，75：49-54)，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基-铵1，2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-磷酸酯(manoharan(马诺汗)等人，(1995)tetrahedronlett.(四面体通讯)，36：3651-3654；shea(舍阿)等人，(1990)nucl.acidsres.(核酸研究)，18：3777-3783)，聚胺或聚乙烯乙二醇链(manoharan(马诺汗)等人，(1995)nucleosides&nucleotides(核苷&核苷酸)，14：969-973)或金刚烷乙酸(manoharan(马诺汗)等人，(1995)tetrahedronlett.(四面体通讯)，36：3651-3654)，十六烷基部分(mishra(米莎)等人，(1995)biochim.biophys.acta(生物化学与生物物理学学报)，1264：229-237)，或十八胺或己胺-羰基羟胆固醇部分(crooke(克鲁克)等人，(1996)j.pharmacol.exp.ther.(药理学与实验治疗学杂志)，277：923-937)。在一个实施例中，配体改变向其中并入该配体的irna剂的分布、靶向或寿命。在优选的实施例中，如例如与不存在这样一个配体的种类相比，这种配体提供针对所选靶(例如，分子、细胞或细胞类型、区室(例如，细胞的或器官的区室、组织、器官或身体的区域)的增强的亲和力。优选的配体将不参与双螺旋核酸中的双螺旋配对。配体可以包括天然存在的物质，例如蛋白(例如，人血清白蛋白(has)、低密度脂蛋白(ldl)或球蛋白)；碳水化合物(例如，葡聚糖、茁霉多糖、壳多糖、壳聚糖、菊糖、环糊精、n-乙酰葡糖胺、n-乙酰半乳糖胺或透明质酸)；或脂质。配体也可以是重组或合成分子，例如合成聚合物，例如，合成的聚氨基酸。聚氨基酸的实例包括以下聚氨基酸：聚赖氨酸(pll)、聚l-天冬氨酸、聚l-谷氨酸、苯乙烯酸-马来酸酐共聚物、聚(l-丙交酯-共-乙交酯)共聚物、二乙烯基醚-马来酐共聚物、n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(hmpa)、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、聚氨酯、聚(2-乙基丙烯酸)、n-异丙基丙烯酰胺聚合物或聚磷嗪。聚胺的实例包括：聚乙烯亚胺、聚赖氨酸(pll)、精胺、亚精胺、聚胺、假肽-多胺、模拟肽多胺、树状聚体多胺、精氨酸、脒、鱼精蛋白、阳离子脂质、阳离子卟啉、聚胺的季盐、或α螺旋肽。配体也可以包括靶向基团，例如，与指定的细胞类型，例如肾细胞结合的细胞或组织靶向剂，例如，凝集素，糖蛋白，脂质或蛋白，例如，抗体。靶向基团可以是促甲状腺激素、促黑素、凝集素、糖蛋白、表面活性蛋白a、黏蛋白碳水化合物、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖、多价岩藻糖、糖基化聚氨基酸、多价半乳糖、转铁蛋白、双膦酸盐、聚谷氨酸、聚天冬氨酸、脂质、胆固醇、类固醇、胆酸、叶酸、维生素b12、维生素a、生物素、或rgd肽或rgd肽模拟物。配体的其他实例包括染料、嵌入剂(例如吖啶)、交联剂(例如补骨脂素、丝裂霉素c)、卟啉(tppc4、德克萨斯卟啉(texaphyrin)、噻啉(sapphyrin))、多环芳烃(例如，吩嗪、二氢吩嗪)、人工核酸内切酶(例如edta)、亲脂性分子，例如，胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾酮、1，3-双-o(十六烷基)甘油、香叶基氧己基、鲸蜡基甘油、冰片、薄荷醇、1，3-丙二醇、十七烷基、棕榈酸、肉豆蔻酸、o3-(油酰)石胆酸、o3-(油酰)胆烯酸、二甲氧基三苯甲基、或吩噁嗪)，以及肽共轭物(例如，触角足肽、tat肽)、烷基化剂、磷酸酯、氨基、巯基、peg(例如，peg-40k)、mpeg、[mpeg]2、聚氨基、烷基、取代的烷基、放射标记的标记、酶、半抗原(例如生物素)、转运/吸收促进剂(例如，阿司匹林、维生素e、叶酸)、合成性核糖核酸酶(例如，咪唑、双咪唑、组胺、咪唑聚类、吖啶-咪唑共轭物、四氮杂大环类的eu3+络合物)、二硝基苯基、hrp或ap。配体可以是蛋白，例如，糖蛋白，或肽，例如，对辅助配体具有特异亲和力的分子，或抗体，例如，与指定细胞类型，例如肝细胞结合的抗体。配体也可以包括激素和激素受体。它们也可以包括非肽种类，例如脂质、凝集素、糖类、维生素、辅因子、多价乳糖、多价半乳糖、n-乙酰基-半乳糖胺、n-乙酰基-葡糖胺多价甘露糖或多价岩藻糖。配体可以是例如脂多糖、p38map激酶的激活物，或nf-κb的激活物。配体可以是可以例如通过扰乱细胞的细胞骨架(例如，通过扰乱细胞微管、微丝和/或中间丝)增加irna剂摄入细胞中的物质，例如，药物。药物可以例如是泰素(taxon)、长春新碱、长春碱、松胞菌素、诺考达唑、促微丝聚合剂(japlakinolide)、红海海绵素a、鬼笔环肽、海洋苔藓素(swinholide)a、茚满诺星(indanocine)或药物(myoservin)。在一些实施例中，与如在此所述的irna附接的配体充当药代动力学调节物(pk调节物)。pk调节物包括亲油物质、胆酸、类固醇、磷脂质似物、肽、蛋白结合剂、peg、维生素等。示例性pk调节物包括但不局限于胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬(ibuprofen)、维生素e、生物素等。包括多个硫代磷酸酯键的寡核苷酸也已知与血清蛋白结合，因此主链中包括多个硫代磷酸酯键的短寡核苷酸，例如，约5个碱基、10个碱基、15个碱基或20个碱基的寡核苷酸，也适用于本发明作为配体(例如作为pk调节配体)。此外，结合血清组分(例如血清蛋白)的适配体也适合用作在此所述的实施例中的pk调节配体。本发明的配体共轭的寡核苷酸可以通过使用具有吊坠反应功能性(例如源自连接分子附接到该寡核苷酸上(下述))的寡核苷酸合成。该反应寡核苷酸可与可商购的配体、合成的具有多种保护基团中的任一种的配体、或具有一个附接其上的连接部分的配体直接反应。在本发明的共轭物中使用的寡核苷酸可以通过固相合成的熟知技术方便地和常规地制造。用于这类合成的设备由若干销售商包括例如appliedbiosystems(美国应用生物系统公司)(福斯特市，加利福尼亚州)销售。可以额外地或可替代地采用用于此类合成的本领域内已知的任何其他手段。也已知使用相似的技术来制备其他寡核苷酸，例如硫代磷酸和烷基化的衍生物。在本发明的具有序列特异性连接核苷的配体共轭寡核苷酸和配体分子中，可以在适合的dna合成仪上利用标准核苷酸或核苷前体、或核苷酸或核苷共轭物前体(已具有连接部分)、配体核苷酸或核苷共轭物前体(已具有配体分子)、或具有结构单元的非核苷配体，组装这些寡核苷酸或寡核苷。当使用核苷酸共轭物前体(已具有连接部分)时，序列特异性连接核苷的合成被典型地完成，并且然后该配体分子与连接部分反应以形成配体共轭寡核苷酸。在一些实施例中，除了可商购的和在寡核苷酸合成中常规使用的标准亚磷酰胺和非标准亚磷酰胺，本发明的寡核苷酸或连接核苷是通过自动化合成仪使用源自配体核苷共轭物的亚磷酰胺合成的。a.脂质共轭物在一个实施例中，配体或共轭物是脂质或基于脂质的分子。这种脂质或基于脂质的分子优选地结合血清蛋白，例如，人血清白蛋白(has)。结合hsa的配体允许共轭物分布至靶组织，例如，身体的非肾靶组织。例如，靶组织可以是肝脏，包括肝脏的实质细胞。可以结合hsa的其他分子也可以用作配体。例如，可以使用萘普生或阿司匹林。脂质或基于脂质的配体可以(a)增加共轭物对降解的抵抗力，(b)增加靶向或转运至靶细胞或细胞膜中，和/或(c)可以用来调节与血清蛋白(例如，has)的结合。基于脂质的配体可以用来抑制(例如，控制)共轭物与靶组织的结合。例如，与hsa更强烈结合的脂质或基于脂质的配体将更不可能被靶向肾并且因此更不可能从身体清除。与has更不强烈结合的脂质或基于脂质的配体可以用来使共轭物靶向肾。在一个优选实施例中，基于脂质的配体结合hsa。优选地，它以足够的亲和力结合hsa，这样使得共轭物将优选地分布至非肾组织。然而，优选的是这种亲和力并不是这样强，这样使得hsa-配体结合不能逆转。在另一个优选实施例中，基于脂质的配体微弱或根本不结合hsa，这样使得共轭物将优选地分布至肾。替代基于脂质的配体或除它之外也可以使用靶向肾细胞的其他部分。在另一个方面，配体是由靶细胞(例如，正在增殖的细胞)摄取的部分，例如，维生素。这些对于治疗特征在于不想要的细胞(例如，恶性或非恶性型，例如，癌细胞)增殖的失调特别有用。示例性维生素包括维生素a、e和k。其他示例性维生素包括是b维生素，例如，叶酸、b12、核黄素、生物素、吡哆醛或由靶细胞，例如肝细胞摄取的其他维生素或养分。还包括hsa和低密度脂蛋白(ldl)。b.细胞渗透剂在另一个方面，配体是细胞渗透剂，优选地是螺旋形细胞渗透剂。优选地，该剂是两亲的。一种示例性剂是肽，例如tat或触角足蛋白。如果该剂是肽，则它可以经修饰的，包括肽酰基模拟物、反演体、非肽键或假肽键和d-氨基酸的使用。该螺旋剂优选地是一种α螺旋剂，该α螺旋剂优选地具有一个亲脂性的和一个疏脂性的相。该配体可以是一种肽或模拟肽。肽模拟物(在此也称作寡肽模拟物)是能够折叠成与天然肽相似的限定三维结构的分子。肽和肽模拟物与irna药物的附接可以影响irna的药物代谢动力学分布，例如通过增强细胞识别与吸收。肽或肽模拟物部分可以是约5-50氨基酸长，例如，约5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个氨基酸长。肽或肽模拟物可以例如是细胞渗透肽、阳离子肽、两亲肽或疏水肽(例如，主要由tyr、trp或phe组成)。肽部分可以是树状肽、约束肽或交联肽。在另一个替代方案中，肽部分可以包括疏水性膜转运序列(mts)。一种示例性包含疏水性mts的肽是具有氨基酸序列aavallpavllallap(seqidno：13)的rfgf。包含疏水性mts的rfgf类似物(例如，氨基酸序列aallpvllaap(seqidno：10))也可以是靶向部分。该肽部分可以是一种“递送”肽，该递送肽可以运载大的极性分子包括肽、寡核苷酸、和蛋白跨过细胞膜。例如，已经发现来自hivtat蛋白(grkkrrqrrrppq(seqidno：11))和果蝇触角足蛋白(rqikiwfqnrrmkwkk(seqidno：12))的序列能够作为递送肽发挥功能。肽或肽模拟物可以由随机dna序列编码，例如从噬菌体展示文库或一珠一化合物(oboc)组合文库中鉴定的肽(lam(拉姆)等人，nature(自然)，354：82-84，1991)。经由一种结合单体单元系至一种dsrna剂的肽或肽模拟物用于细胞靶向目的的实例是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(rgd)肽或rgd模拟物。肽部分可以在长度上范围从约5个氨基酸至约40个氨基酸。肽部分可以具有结构修饰，例如以便增加稳定性或指导构象特性。可以利用下文描述的任何结构修饰。用于在本发明的组合物和方法中使用的rgd肽可以是线性或环状的，并且可以是修饰的，例如，糖基化或甲基化以促进靶向一种或多种特定组织。含rgd的肽和肽模拟物(peptidiomimemtics)可以包括d-氨基酸连同合成性rgd模拟物。除rgd之外，人可以使用靶向整联蛋白配体的其他部分。该配体的优选的共轭物靶向pecam-1或vegf。“细胞渗透肽”能够渗透一个细胞，例如微生物细胞(例如细菌或真菌细胞)，或哺乳动物细胞(例如人细胞)。微生物细胞渗透肽可以是例如，α-螺旋线性肽(例如ll-37或药物(ceropinp1))、含二硫键的肽(例如α-防卫肽、β-防卫肽或牛白细胞抗菌肽)、或仅含一种或两种主要氨基酸的肽(例如pr-39或吲哚里西啶(indolicidin))。细胞渗透肽也可以包括核定位信号(nls)。例如，细胞渗透肽可以是二重两亲肽，例如mpg，其源自hiv-1gp41的融合物肽结构域和sv40大t抗原的nls(simeoni(西梅奥尼)等人，nucl.acidsres(核酸研究).31：2717-2724，2003)。c.碳水化合物共轭物在本发明的组合物与方法的一些实施例中，irna寡核苷酸进一步包括一种碳水化合物。碳水化合物轭合的irna对于核酸的体内递送连同适合于体内治疗用途的组合物而言是有利的，如在此所述。如在此使用，“碳水化合物”指以下这样一种化合物，它是一种本身由具有至少6个碳原子的一个或多个单糖单位构成的碳水化合物(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子；抑或它是一种具有以下这样的一个碳水化合物部分作为其一部分的化合物，该碳水化合物由具有至少六个碳原子的一个或多个单糖单位构成(其可以是线性的、支链的或环状的)，其中氧、氮或硫原子结合至每一碳原子。代表性的碳水化合物包括糖(单糖、二糖、三糖以及包含从约4、5、6、7、8或9个单糖单位的低聚糖)，以及多糖，例如淀粉、糖原、纤维素以及多糖胶。特定单糖包括c5以及以上的(例如，c5、c6、c7或c8)糖；二糖以及三糖，包括具有两个或三个单糖单位的糖(例如，c5、c6、c7或c8)。在一个实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物轭合物是一种单糖。在一个实施例中，该单糖是一种n-乙酰半乳糖胺，例如在另一个实施例中，用于在本发明的组合物以及方法中使用的碳水化合物轭合物选自下组，该组由以下各项组成：用于在此所述的实施例中的另一种代表性糖共轭物包括但不局限于，(式xxiii)当x或y之一是寡核苷酸时，另一者是氢。在一些实施例中，该碳水化合物轭合物进一步包括以上描述的一个或多个额外的配体，例如但不局限于一种pk调制子和/或一种细胞渗透肽。d.连接物在一些实施例中，可以用可以是可切割的或不可切割的不同连接物将在此描述的轭合物或配体附接至irna寡核苷酸。术语“连接物”或“连接基”是指一种有机部分，它连接一个化合物的两个部分，例如，共价地附接一个化合物的两个部分。连接物典型地包括一种直接的键或一种原子，例如氧或硫，一种单位，例如nr8、c(o)、c(o)nh、so、so2、so2nh或者一种原子链，例如但不局限于经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、芳基烷基、芳基烯基、芳基炔基、杂芳基烷基、杂芳基烯基、杂芳基炔基、杂环烷基、杂环烯基、杂环炔基、芳基、杂芳基、杂环基、环烷基、环烯基、烷基芳基烷基、烷基芳基烯基、烷基芳基炔基、烯基芳基烷基、烯基芳基烯基、烯基芳基炔基、炔基芳基烷基、炔基芳基烯基、炔基芳基炔基、烷基杂芳基烷基、烷基杂芳基烯基、烷基杂芳基炔基、烯基杂芳基烷基、烯基杂芳基烯基、烯基杂芳基炔基、炔基杂芳基烷基、炔基杂芳基烯基、炔基杂芳基炔基、烷基杂环烷基、烷基杂环烯基、烷基杂环炔基、烯基杂环烷基、烯基杂环烯基、烯基杂环炔基、炔基杂环烷基、炔基杂环烯基、炔基杂环炔基、烷基芳基、烯基芳基、炔基芳基、烷基杂芳基、烯基杂芳基、炔基杂芳基，其中一个或多个亚甲基可以被以下中断或封端：o、s、s(o)、so2、n(r8)、c(o)、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基、经取代或未经取代的杂环基；其中r8是氢、酰基、脂肪族的或经取代的脂肪族的。在一个实施例中，该连接物是在约1-24个原子、2-24、3-24、4-24、5-24、6-24、6-18、7-18、8-18个原子，7-17、8-17、6-16、7-17或8-16个原子之间。可切割连接基是一种基团，它在细胞外部充分稳定，但是进入靶细胞时则被切割以释放由连接物固定在一起的两个部分。在一个优选的实施例中，可切割连接基在靶细胞中或在一个第一参照条件(其可以例如被选择为模拟或代表细胞内条件)下的切割比在受试者的血液中或在一个第二参考条件下(其可以例如被选择为模拟或代表在该血液或血清中发现的条件)快至少约10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或更多，或至少约100倍。可切割连接基对切割剂(例如ph、氧化还原电位或降解分子的存在)敏感。通常，切割剂在细胞内部比血清或血液中更占优势或以更高水平或活性存在。此类降解剂的实例包括：氧化还原剂，它们被选择用于具体底物或者无底物特异性，包括例如氧化或还原酶或者在细胞中出现的还原剂，例如硫醇(它可以通过还原作用降解一种可氧化还原切割的连接基)；酯酶；内涵体或可以创造酸性环境的剂，例如导致ph为五或更低的那些；可以通过充当一种广义酸而水解或降解一种酸可切割连接基的酶，肽酶(它可以是底物特异性的)，以及磷酸酶。可切割键基团，例如二硫键，可以是对ph敏感。人血清的ph是7.4，而平均的细胞内ph略微更低，范围从约7.1-7.3。内涵体具有一个更酸的ph，范围在5.5-6.0，并且溶酶体具有一个甚至更酸的ph，在5.0左右。一些连接物将具有可切割连接基，这些基团在一个优选的ph处被切割，由此将阳离子脂质从配体释放在细胞内，或释放进入所希望的细胞区室。连接物可以包括由具体酶可切割的可切割连接基。并入连接物的可切割连接基的类型可以取决于有待被靶向的细胞。例如，肝靶向的配体可以通过一种包括酯基团的连接物而被连接至一种阳离子脂质。肝细胞富含酯酶，并且因此与不富含酯酶的细胞相比，该连接物将在肝细胞中被更有效地切割。富含酯酶的其他细胞类型包括肺、肾皮质和睾丸的细胞。在靶向富含酯酶的细胞类型，例如肝脏细胞和滑膜细胞时，可以使用包含肽键的连接物。总体上，一种候选可切割连接基的适合性可以通过测试降解剂(或条件)切割候选的连接基的能力来进行评估。还希望的是也测试候选可切割连接基在血液中或当与其他非靶组织接触时抵抗切割的能力。因此，可以确定在一个第一条件与一个第二条件之间进行切割的相对敏感性，其中该第一条件被选择为指示在一个靶细胞中的切割并且该第二条件被选择为指示在其他组织或生物流体(例如，血液或血清)中的切割。可以在无细胞系统中、在细胞中、在细胞培养物中、在器官或组织培养中或在完整动物中进行评估。有用的是在无细胞或培养条件下进行初始评估并且通过在整个动物中的进一步评估来进行证实。在优选的实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的切割比在血液或血清(或在被选择为模拟细胞外条件的体外条件下)中的切割快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。i.氧化还原可切割连接基在一个实施例中，可切割连接基是一种氧化还原可切割连接基，其在还原或氧化时被切割。还原可切割连接基的实例是二硫连接基(-s-s-)。为了确定一个候选可切割连接基是否是一种适合的“还原可切割连接基”，或者例如是否适合于与一种具体的irna部分以及具体的靶向剂一起使用，可以参考在此描述的方法。例如，可以通过与二硫苏糖醇(dtt)或使用本领域已知的试剂的其他还原剂进行孵育来对一个候选物进行评估，这模拟了会在细胞(例如靶细胞)内观察到的切割速率。该候选物也可以在选择成模拟血液或血清条件的条件下评估。在一个实施例中，候选化合物在血液中被切割最多约10％。在其他实施例中，有用的候选化合物在细胞中(或在被选择为模拟细胞内条件的体外条件下)的降解比在血液(或在选择以模拟细胞外条件的体外条件下)中的降解快至少约2、4、10、20、30、40、50、60、70、80、90或约100倍。可以使用标准酶动力学测定法在选择成模拟胞内介质的条件下并且与选择成模拟胞外介质的条件相比确定候选化合物的切割速率。ii.基于磷酸酯的可切割连接基在另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于磷酸酯的可切割连接基。基于磷酸酯的可切割连接基通过降解或水解该磷酸酯基团的剂而被切割。一种在细胞中切割磷酸酯基团的剂的实例是酶，例如细胞中的磷酸酶。基于磷酸酯的连接基的实例是-o-p(o)(ork)-o-、-o-p(s)(ork)-o-、-o-p(s)(srk)-o-、-s-p(o)(ork)-o-、-o-p(o)(ork)-s-、-s-p(o)(ork)-s-、-o-p(s)(ork)-s-、-s-p(s)(ork)-o-、-o-p(o)(rk)-o-、-o-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-o-、-s-p(s)(rk)-o-、-s-p(o)(rk)-s-、-o-p(s)(rk)-s-。优选的实施例是-o-p(o)(oh)-o-、-o-p(s)(oh)-o-、-o-p(s)(sh)-o-、-s-p(o)(oh)-o-、-o-p(o)(oh)-s-、-s-p(o)(oh)-s-、-o-p(s)(oh)-s-、-s-p(s)(oh)-o-、-o-p(o)(h)-o-、-o-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-o-、-s-p(s)(h)-o-、-s-p(o)(h)-s-、-o-p(s)(h)-s-。优选的实施例是-o-p(o)(oh)-o-。可以使用与上文描述的那些相似的方法评估这些候选物。iii.酸可切割连接基在另一个实施例中，可切割连接物包括一种酸可切割连接基。酸可切割连接基是在酸性条件下被切割的一种连接基。在优选的实施例中，酸可切割连接基在一个具有约6.5或更低(例如，约6.0、5.75、5.5、5.25、5.0或更低)的ph的酸性环境中被切割，或者被多种剂(例如可以充当一种广义酸的酶)切割。在细胞中，特定低ph细胞器，例如内涵体和溶酶体可以为酸可切割连接基提供切割环境。酸可切割连接基的实例包括但不局限于腙、酯和氨基酸酯。酸可切割基团可以具有通式-c＝nn-、c(o)o或-oc(o)。优选的实施例是与酯的氧附接的碳(烷氧基)是芳基、取代的烷基或叔烷基，例如二甲基戊基或叔-丁基时的情况。可以使用与上文描述的那些相似的方法评估这些候选物。iv.基于酯的连接基在另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于酯的可切割连接基。基于酯的可切割连接基被酶(例如细胞中的酯酶与酰胺酶)切割。基于酯的可切割连接基的实例包括但不局限于亚烷基、亚链烯基和亚炔基的酯。酯可切割连接基具有通式-c(o)o-或-oc(o)-。可以使用与上文描述的那些相似的方法评估这些候选物。v.基于肽的切割基团在仍另一个实施例中，可切割连接物包括一种基于肽的可切割连接基。基于肽的可切割连接基被酶(例如细胞中的肽酶与蛋白酶)切割。基于肽的可切割连接基是在氨基酸之间形成肽键，以产生寡肽(例如，二肽、三肽，等)以及多肽。基于肽的可切割基团不包括酰胺基(-c(o)nh-)。酰胺基可以在任何亚烷基、亚链烯基或亚炔基之间形成。肽键是在氨基酸之间形成，以产生肽和蛋白的特殊类型的酰胺键。基于肽的切割基团总体上局限于在在氨基酸之间形成产生肽以及蛋白的肽键(即，酰胺键)，并且不包括整个酰胺官能团。基于肽的可切割连接基具有通式-nhchrac(o)nhchrbc(o)-，其中ra与rb是这两个邻接氨基酸的r基团。可以使用与上文描述的那些相似的方法评估这些候选物。在一个实施例中，本发明的irna通过一种连接物被轭合至一种碳水化合物。具有本发明的组合物与方法的连接物的irna碳水化合物轭合物的非限制性实例包括但不局限于，(式xxx)当x或y之一是寡核苷酸时，另一者是氢。在本发明的组合物与方法的某些实施例中，配体是通过二价或三价分支连接物而附接的一个或多个galnac(n-乙酰半乳糖胺)衍生物。在一个实施例中，本发明的dsrna被轭合至一种二价或三价分支连接物，其选自在式(xxxi)-(xxxiv)的任一个中示出的结构的组：其中：各次出现的q2a、q2b、q3a、q3b、q4a、q4b、q5a、q5b以及q5c独立地代表0-20，并且其中该重复单位可以是相同或不同的；各次出现的p2a、p2b、p3a、p3b、p4a、p4b、p5a、p5b、p5c、t2a、t2b、t3a、t3b、t4a、t4b、t4a、t5b、t5c各自独立地是：不存在、co、nh、o、s、oc(o)、nhc(o)、ch2、ch2nh或ch2o；各次出现的q2a、q2b、q3a、q3b、q4a、q4b、q5a、q5b、q5c独立地是：不存在、亚烷基、经取代的亚烷基其中一个或多个亚甲基可以被以下各项中的一个或多个所中断或封端：o、s、s(o)、so2、n(rn)、c(r’)＝c(r”)、或c(o)；各次出现的r2a、r2b、r3a、r3b、r4a、r4b、r5a、r5b、r5c各自独立地是：不存在、nh、o、s、ch2、c(o)o、c(o)nh、nhch(ra)c(o)、-c(o)-ch(ra)-nh-、co、ch＝n-o、或杂环基；l2a、l2b、l3a、l3b、l4a、l4b、l5a、l5b和l5c代表配体，即各次出现各自独立地是单糖(如galnac)、二糖、三糖、四糖、低聚糖、或多糖；并且ra是h或氨基酸侧链。三价轭合的galnac衍生物对于与rnai剂一起使用于抑制靶基因的表达是特别有用的，例如具有式(xxxv)的那些：式xxxv其中l5a、l5b与l5c代表单糖，例如galnac衍生物。适合的二价与三价分支连接物基团轭合的galnac衍生物的实例包括但不局限于在以上引用为式ii_vii、xi、x以及xiii的结构。传授rna轭合物的制备的代表性美国专利包括但不局限于美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717、5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241、5,391,723；5,416,203、5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941；6,294,664；6,320,017；6,576,752；6,783,931；6,900,297；7,037,646；8,106,022，将它们每个的全部内容通过引用结合在此。给定化合物中的全部位置不必要经统一修饰，并且实际上可以在单个化合物中或甚至在irna内部的单个核苷处掺入多于一个前述修饰。本发明也包括作为嵌合化合物的irna化合物。在本发明的上下文中，“嵌合体的”irna化合物或“嵌合体”是以下这样的irna化合物，优选是dsrna，它们包括两个或更多个化学上不同的区域，每者由至少一个单体单位构成，即，在dsrna化合物的情况下的一种核苷酸。这些irna典型地包含至少一个区域，其中rna经修饰，从而赋予irna增加的核酸酶降解抗性、增加的细胞摄取和/或增加的靶核酸结合亲和力。irna的额外区域可以充当能够切割rna：dna或rna：rna杂交分子的酶的底物。例如，rna酶h是切割rna：dna双螺旋的rna链的细胞核酸内切酶。因此，rna酶h的激活导致rna靶的切割，由此大大增强irna抑制基因表达的效率。因此，与杂交至相同靶区域的硫代磷酸酯脱氧dsrna相比，可以在使用嵌合dsrna时，经常用更短的irna获得可比较的结果。可以通过凝胶电泳(并且如果需要，与本领域已知的相关核酸杂交技术相关)常规地检测rna靶的切割。在某些实例中，irna的rna可以通过非配体基团来进行修饰。多个非配体分子已经被轭合至irna以增强该irna的活性、细胞分布或细胞摄取，并且用于进行此类轭合的程序在科学文献中是可得的。这类非配体部分包括脂质部分，如胆固醇(kubo(久保)，t.等人，biochem.biophys.res.comm.(生物化学与生物物理学研究通讯)，2007，365(1)：54-61；letsinger(乐欣格)等人，proc.natl.acad.sci.usa(美国科学院院刊)，1989，86：6553)、胆酸(manoharan(马诺汗)等人，bioorg.med.chem.lett.(生物有机化学与医药化学通讯)1994，4：1053)、硫醚，例如，己基-s-三苯甲基硫醇(manoharan(马诺汗)等人，ann.n.y.acad.sci.(纽约科学院年报)，1992，660：306；manoharan(马诺汗)等人，bioorg.med.chem.let.(生物有机化学与医药化学通讯)，1993，3：2765)，巯基胆固醇(oberhauser(奥博汗瑟)等人，nucl.acidsres.(核酸研究)，1992，20：533)、脂族链，例如，十二醇残余物或十一基残余物(saison-behmoaras(赛森-博和马拉)等人，emboj.(embo期刊)，1991，10：111；kabanov(卡波诺)等人，febslett.(febs通讯)，1990，259：327；svinarchuk(斯伍那区克)等人，biochimie(生物化学)，1993，75：49)、磷脂，例如，二鲸蜡基-外消旋-甘油或三乙基铵1，2-二-o-鲸蜡基-外消旋-甘油-3-膦酸酯(manoharan(马诺汗)等人，tetrahedronlett.(四面体通讯)，1995，36：3651；shea(舍阿)等人，nucl.acidsres.(核酸研究)，1990，18：3777)、多胺或聚乙二醇链(manoharan(马诺汗)等人，nucleosides&nucleotides(核苷&核苷酸)，1995，14：969)、或金刚烷乙酸(manoharan(马诺汗)等人，tetrahedronlett.(四面体通讯)，1995，36：3651)、棕榈基部分(mishra(米莎)等人，biochim.biophys.acta(生物化学与生物物理学学报)，1995，1264：229)，或十八烷基胺或己基氨基-羰酰氧基胆固醇部分(crooke(克鲁克)等人，j.pharmacol.exp.ther.(药理学与实验治疗学杂志)，1996，277：923)。教授制备这类rna共轭物的代表性美国专利已经在上文列出。典型的轭合方案涉及在序列的一个或多个位置具有氨基连接物的rna的合成。氨基然后与分子反应，使用适当的偶联或活化试剂共轭所述所述分子。共轭反应可以用仍与固相支持物结合抑或在切割rna后处于溶液相的rna进行。通过hplc纯化rna共轭物典型地提供纯的共轭物。iv.本发明的irna的递送本发明的irna向细胞例如受试者，例如人类受试者(例如对其有需要的受试者，例如患有脂质代谢作用失调的受试者)体内的细胞中的递送可按多种不同的方式达成。例如，递送可通过用本发明的irna体外抑或体内接触细胞实施。还可以通过向受试者给予包括irna(例如dsrna)的组合物，直接进行体内递送。可替代地，可以通过给予编码和指导irna表达的一种或多种载体间接地进行体内递送。这些替代方案在以下进一步讨论。通常，递送核酸分子(体外或体内)的任何方法可以适应于随本发明的irna使用(参见例如，akhtar(阿赫塔尔)s.和julian(朱利安)rl.(1992)trendscell.biol.(细胞生物学发展趋势)2(5)：139-144和wo94/02595，所述文献通过引用以其全文结合在此)。对于体内递送，认为为了递送irna分子的因素包括例如所递送分子的生物学稳定性，防止非特异性作用，和所递送分子在靶组织中的积累。可以通过局部给予，例如通过直接注射或植入至组织中或局部给予该制品，使sirna的非特异性作用最小化。局部给予至治疗部位使剂的局部浓度最大化，限制剂向全身组织的暴露，所述全身组织否则可能受该剂损害或可能降解该剂，并且允许给予更低总剂量的irna分子。若干研究已经示出在局部给予irna时成功敲减基因产物。例如，在食蟹猴中通过玻璃体内注射眼球内递送vegfdsrna(tolentino(托伦蒂诺)，mj.等人(2004)retina(视网膜)24：132-138)和在小鼠中视网膜下注射(reich(赖希)，sj.等人(2003)mol.vis.(分子视觉)9：210-216)眼球内递送vegfdsrna均示出在年龄相关性黄斑变性的实验模型中防止血管新生。此外，在小鼠中直接肿瘤内注射dsrna缩减肿瘤体积(pille(皮尔)，j.等人(2005)mol.ther.(分子治疗)11：267-274)并且可以延长荷瘤小鼠的存活(kim(金姆)，wj.等人(2006)mol.ther.(分子治疗)14：343-350；li(李)，s.等人(2007)mol.ther.(分子治疗)15：515-523)。也已经示出通过直接注射将rna干扰成功局部递至cns(dorn(多恩)，g.等人(2004)nucleicacids(核酸)32：e49；tan(谭)，ph.等人(2005)genether.(基因治疗)12：59-66；makimura(牧村)，h.等人(2002)bmcneurosci.(bmc神经科学)3：18；shishkina(舒斯基娜)，gt.等人(2004)neuroscience(神经科学)129：521-528；thakker(塔克尔)，er.等人(2004)proc.natl.acad.sci.u.s.a.(美国科学院院刊)101：17270-17275；akaneya(阿卡尼亚)，y.等人(2005)j.neurophysiol.(神经生理学杂志)93：594-602并且通过鼻内给予成功递送至肺(howard(霍华德)，ka.等人(2006)mol.ther.(分子治疗)14：476-484；zhang(张)，x.等人(2004)j.biol.chem.(生物化学杂志)279：10677-10684；bitko(比特科)，v.等人(2005)nat.med.(自然医学)11：50-55)。对于全身给予irna用于治疗疾病，可以将rna修饰或可替代地使用药物递送系统递送；两种方法均起到防止dsrna被体内核酸内切酶和外切酶快速降解的作用。rna或药用载体的修饰也可以允许irna组合物靶向至靶组织并避免不想要的脱靶效应。irna分子可以通过化学共轭至亲脂性基团，例如胆固醇进行修饰，以增强细胞摄取和防止降解。例如，将与亲脂性胆固醇部分共轭的直接针对apob的irna全身注射至小鼠并且导致肝脏和空肠二者中apobmrna的敲减(soutschek(苏茨切克)，j.等人(2004)nature(自然)432：173-178)。irna与适配体的共轭已经在前列腺癌的小鼠模型中显示抑制肿瘤生长并介导肿瘤消退(mcnamara，jo.等人(2006)nat.biotechnol.24：1005-1015)。在替代实施例中，可以使用药物递送系统，例如纳米颗粒、树状物、聚合物、脂质体或阳离子递送系统递送irna。带正电荷的阳离子递送系统促进(带负电荷的)irna分子的结合并且也在带负电荷的细胞膜增强相互作用以允许irna由细胞有效摄取。阳离子脂质、树状物或聚合物可以与irna结合抑或被诱导以形成包装sirna的囊泡或胶束(见例如，kim(金姆)sh.等人(2008)journalofcontrolledrelease(控释杂志)129(2)：107-116)。囊泡或胶束的形成进一步防止全身给予时irna的降解。用于制造和给予阳离子-irna复合物的方法完全在本领域普通技术人员的能力范围内(参见例如，sorensen(索伦森)，dr.等人(2003)j.mol.biol(分子生物学杂志)327：761-766；verma(维尔马)，un.等人(2003)clin.cancerres.(临床癌症研究)9：1291-1300；arnold(阿诺德)，as等人(2007)j.hypertens.(高血压杂志)25：197-205，所述文献通过引用以其全文结合在此)。对于irna的全身递送有用的药物递送系统的一些非限制实例包括dotap(sorensen(索伦森)，dr.，等人(2003)，同上；verma(维尔马)，un.等人，(2003)，同上)、脂质体(oligofectamine)“固体核酸脂质颗粒”(zimmermann(齐默尔曼)，ts.等人，(2006)nature(自然)441：111-114)、心磷脂(chien(近)，py.等人，(2005)cancergenether.(癌症基因治疗)12：321-328；pal(帕尔)，a.等人，(2005)intj.oncol.(国际肿瘤学杂志)26：1087-1091)、聚乙烯亚胺(bonnet(邦尼特)me.等人，(2008)pharm.res.(药物研究)8月16电子出版先于印刷版；aigner(艾格纳)，a.(2006)j.biomed.biotechnol.(生物医学生物工程杂志)71659)、arg-gly-asp(rgd)肽(liu(刘)，s.(2006)mol.pharm.(分子药理学)3：472-487)、以及聚酰胺型胺类(tomalia(托马利亚)，da.等人，(2007)biochem.soc.trans.(生物化学社会事务)35：61-67；yoo(柳)，h.等人，(1999)pharm.res.(药物研究)16：1799-1804).在一些实施例中，irna与环糊精形成用于全身给予的复合物。用于给予的方法与irna和环糊精的药物组合物可以在美国专利号7,427,605中找到，所述专利通过引用以其全文结合在此。a.本发明的编码irna的载体靶向angptl3基因的irna可以从插入dna或rna载体中的转录单位表达(参见，例如，couture(科图雷)，a等人，tig.(1996)，12：5-10；skillern(斯基尔伦)，a.等人，国际pct公开号wo00/22113，conrad(康拉德)，国际pct公开号wo00/22114，和conrad(康拉德)，美国专利号6,054,299)。取决于使用的特定构建体和靶组织或细胞类型，表达可以是瞬时的(在小时至周数量级上)或持久的(数周至数月或更长时间)。可以将这些转基因作为线性构建体、环状质粒或可以是整合或非整合载体的病毒载体引入。该转基因还可以被构建以允许其作为染色体外的质粒进行遗传(gassmann(噶斯曼)等人，(1995)proc.natl.acad.sci.usa(美国科学院院刊)92：1292)。irna的单个链或多个链可以从表达载体上的启动子转录。在两个单独的链待表达以产生例如dsrna的情况下，可以将两个单独表达载体共引入(例如，通过转染或感染)靶细胞中。可替代地，dsrna的每个单独链可以由均位于相同表达质粒上的启动子转录。在一个实施例中，dsrna表达为连接物多核苷酸序列连接的反向重复序列多核苷酸，这样使得该srna具有茎-环结构。irna表达载体通常是dna质粒或病毒载体。与真核细胞相容的表达载体、优选地与脊椎动物细胞相容的那些，可以用来产生表达如在此所述的irna的重组构建体。真核细胞表达载体是本领域熟知的并且从多个商业来源可获得。典型地，提供此类载体，它们包含用于插入希望的核酸区段的便利限制性位点。表达irna的载体的递送可以是全身的，例如通过静脉内或肌内给予，通过给予至从患者移植出来、随后重新引入患者的靶细胞或通过允许向希望的靶细胞引入的任何其他手段。可以将irna表达质粒作为与阳离子脂质载体(例如，一种脂质体(oligofectamine))或基于非阳离子脂质的载体(例如，transit-tkotm)的复合物转染至靶细胞中。本发明也预期了在一周或更长时间范围内用于irna介导的靶向靶rna不同区域的敲减的多次脂质转染。可以使用不同已知方法监测载体向宿主细胞中的成功引入。例如，瞬时转染可以用报告子，例如荧光标记，例如绿色荧光蛋白(gfp)发出信号。可以使用标记确保离体细胞的稳定转染，其中所述标记向转染的细胞提供针对特定环境因素(例如，抗生素和药物)的抗性，例如潮霉素b抗性。可以随在此所述的方法和组合物一起使用的病毒载体系统包括但不局限于(a)腺病毒载体；(b)逆转录病毒载体，包括但不局限于慢病毒载体、莫洛尼鼠白血病病毒等；(c)腺联病毒载体；(d)单纯疱疹病毒载体；(e)sv40载体；(f)多瘤病毒载体；(g)乳头瘤病毒载体；(h)小rna病毒载体；(i)痘病毒载体如正痘病毒，例如，痘苗病毒载体或禽痘病毒，例如金丝雀痘病毒或鸡痘病毒；和(j)辅助病毒依赖性或无肠腺病毒。复制缺陷型病毒也可以有利的。不同的载体将并入或将不并入细胞的基因组中。如果希望，构建体可以包括病毒序列用与转染。可替代地，构建体可以并入能够发生附加体型复制的载体(例如epv和ebv载体)中。用于重组表达irna的构建体通常将需要调节元件，例如，启动子、增强子等，以确保rna在靶细胞中表达。下文进一步描述针对载体和构建体考虑的其他方面。对于递送irna有用的载体将包括足以在希望的靶细胞或组织中表达irna的调节元件(启动子、增强子等)。可以选择调节元件以提供组成型抑或调节/诱导型表达。可以精确调节irna的表达，例如，通过使用对某些生理调节物(例如，循环型葡萄糖水平或激素)敏感的诱导型调节序列(docherty(多彻蒂)等人，1994，fasebj.(faseb杂志)8：20-24)。适于控制dsrna在细胞中或在哺乳动物中表达的此类诱导型表达系统例如包括通过蜕皮素调节、通过雌激素、孕酮、四环素、二聚化的化学诱导物和异丙基-β-d1-硫代半乳糖苷(iptg)。本领域普通技术人员将能够基于irna转基因的预期用途选择适当的调节/启动子序列。可以使用包含编码irna的核酸序列的病毒载体。例如，可以使用逆转录病毒载体(见miller(米勒)等人，(1993)meth.enzymol.(酶学方法)1993：581-599)。这些逆转录病毒载体包含对于病毒基因组正确包装并整合入宿主细胞dna必需的部件。将编码ingirna的核酸序列克隆至促进该核酸递送入患者的一种或多种载体中。关于逆转录病毒载体的更多细节可以在例如boesen(波森)等人，biotherapy(生物治疗)6：291-302(1994)找到，所述文献描述使用逆转录病毒载体来递送mdrl基因至造血干细胞，以便使得干细胞对化疗更耐受。说明基因治疗中逆转录病毒载体用途的其他参考文献是：clowes(克洛斯)等人，(1994)j.clin.invest.(临床研究期刊)93：644-651；kiem(金)等人，(1994)blood(血液)83：1467-1473；salmons(萨尔蒙斯)和gunzberg(贡兹堡)，(1993)humangenetherapy(人类基因治疗)4：129-141；和grossman(格罗斯曼)和wilson(威尔逊)，(1993)curr.opin.ingeneticsanddevel.(遗传学与发育新观点)3：110-114。预期使用的慢病毒载体例如包括基于hiv的载体，这些载体在美国专利号6,143,520；5,665,557；和5,981,276中描述，所述专利通过引用结合在此。也预期将腺病毒用于本发明的irna的递送。腺病毒是尤其有吸引力的运载体，例如，用于递送基因至呼吸道上皮。腺病毒天然地感染呼吸道上皮，在那里它们引起轻微疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶是肝脏、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染不分裂细胞的优点。kozarsky(科扎斯基)和wilson(威尔逊)，(1993)currentopinioningeneticsanddevelopment(遗传学与发育新观点)3：499-503)提出基于腺病毒的基因治疗的综述。bout(布特)等人，(1994)humangenetherapy(人类基因治疗)5：3-10展示了腺病毒载体转移基因至恒河猴猴呼吸道上皮的用途。基因治疗中使用腺病毒的其他实例可以在rosenfeld(罗森菲尔德)等人，(1991)science(科学)252：431-434；rosenfeld(罗森菲尔德)等人，(1992)cell(细胞)68：143-155；mastrangeli(马斯特兰杰利)等人，(1993)j.clin.invest.(临床研究期刊)91：225-234；pct公开wo94/12649；和wang(王)等人，(1995)genetherapy(基因治疗)2：775-783中找到。用于表达本发明中表征的irna的适合av载体、用于构建重组av载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在xia(夏)h等人，(2002)，nat.biotech.(自然生物技术)20：1006-1010中描述。腺联病毒(aav)载体还可以被用于递送本发明的irna(walsh(沃尔什)等人，(1993)proc.soc.exp.biol.med.(实验生物学与医学会会报)204：289-300；美国专利号5,436,146)。在一个实施例中，irna可以从具有例如u6或h1rna启动子抑或细胞巨化病毒(cmv)启动子的重组aav载体作为两个单独的互补性单链rna分子表达。用于表达本发明中表征的dsrna的适合av载体、用于构建重组av载体的方法和用于递送该载体至靶细胞中的方法在samulski(萨穆尔斯基)r等人(1987)，j.virol.(病毒学杂志)61：3096-3101；fisher(费歇尔)kj等人(1996)，j.virol(病毒学杂志)，70：520-532；samulski(萨穆尔斯基)r等人(1989)，j.virol.(病毒学杂志)63：3822-3826；美国专利号5,252,479；美国专利号5,139,941；国际专利申请号wo94/13788；和国际专利申请号wo93/24641中描述，所述文献的完整披露内容通过引用结合在此。另一种适合于递送本发明的irna的病毒载体是痘病毒，例如痘苗病毒病毒，例如减毒痘苗病毒，例如修饰的安卡拉病毒(mva)或nyvac、禽痘病毒，例如鸡痘病毒或金丝雀痘病毒。可以通过将载体用源自其他病毒的包膜蛋白或其他表面抗原进行假病毒化，或如果适宜通过取代不同的病毒衣壳蛋白，修改病毒载体的趋性。例如，慢病毒载体可以是用来自水泡性口炎病毒(vsv)、狂犬病病毒、埃博拉病毒、mokola(莫科拉)等的表面蛋白进行假病毒化。可以通过将载体工程化以表达不同衣壳蛋白血清型，使得aav载体靶向不同的细胞；参见，例如，rabinowitz(罗宾诺威兹)je等人，(2002)，jvirol(病毒学杂志)76：791-801，所述文献的完整披露内容通过引用结合在此。一种载体的药物制品可以包括在一种可接受的稀释剂中的载体，或者可以包括一种缓释基质，该基因递送运载体被嵌入其中。可替代地，当该完全的基因递送载体可以从重组细胞(例如逆转录病毒载体)完整地产生的情况下，该药物制品可以包括产生该基因递送系统的一个或多个细胞。v.本发明的药用组合物本发明还包括药物组合物和配制品，它们包括本发明的irna。在一个实施例中，在此提供包含如此处所述的irna和药学上可接受的载体的药物组合物。包含该irna的药物组合物对于治疗与angptl3基因表达或活性相关联的疾病或失调(例如脂质代谢作用失调，例如高甘油三酯血症)而言是有用的。基于递送模式配制这类药物组合物。一个实例是经配制用于通过肠胃外递送，例如，通过静脉内(iv)或用于皮下递送来全身给予的组合物。另一个实例是经配制用于直接递送入肝脏的组合物，例如，通过输注入肝脏，例如通过连续泵输注。本发明的药物组合物可以按足以抑制angptl3基因表达的剂量给予。通常，本发明的irna的适合剂量处于每日每千克接受者体重约0.001毫至约200.0毫克范围内，通常处于每日每千克体重约1至50mg范围内。例如，dsrna可以按每单剂量约0.01mg/kg、约0.05mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约1.5mg/kg、约2mg/kg、约3mg/kg、约10mg/kg、约20mg/kg、约30mg/kg、约40mg/kg或约50mg/kg给予。例如，可以按以下剂量给予dsrna：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。在另一个实施例中，按以下剂量给予dsrna：约0.1至约50mg/kg、约0.25至约50mg/kg、约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kb、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.1至约45mg/kg、约0.25至约45mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kb、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.1至约40mg/kg、约0.25至约40mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kb、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.1至约30mg/kg、约0.25至约30mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kb、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.25至约20mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kb、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。例如，可以按以下剂量给予dsrna：约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。在另一个实施例中，按以下剂量给予dsrna：约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kb、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kb、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kb、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kb、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kb、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。例如，可以给予受试者治疗量的irna：例如约0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。可以将该药物组合物一日给予一次，或者可以将该irna在一天内以适当的间隔给予两次、三次或更多次亚剂量，或者甚至可以通过控释配制品使用连续输注或递送而给予。在这种情况下，每个子剂量中所含的irna必须相应地更少，以便实现每日总剂量。也可以将剂量单位复配用于在若干天内递送，例如，使用在若干天时间范围内提供持久irna释放的常规持续释放配制品。持续释放配制品是本领域熟知的并且对于在具体部位递送多种剂特别有用，例如可以随本发明的剂一起使用。在这个实施例中，剂量单位包含相应的多个每日剂量。单一剂量对angptl3水平的影响可以长久持续，这样使得后续剂量以不多于3、4或5天的间隔或以不多于1、2、3，或4周的间隔给予。技术人员将理解，某些因素可以影响有效治疗一个受试者所需的剂量和时间安排，这些因素包括但不局限于疾病或病症的严重性、之前的治疗、该受试者的总体健康和/或年龄、以及其他存在的疾病。另外，用治疗有效量的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或系列治疗。如本文中他处描述，使用常规方法或基于使用适当动物模型的体内测试，可以估计本发明涵盖的单个irna的有效剂量和体内半寿期。在小鼠遗传学方面的进展已经产生了多个用于研究人类不同疾病的小鼠模型，例如将受益于angptl3表达减少的脂质代谢作用失调。此类模型可以用于irna的体内测试，连同用于确定治疗有效剂量。适合的小鼠模型是本领域已知的并包括，例如包含肥胖(ob)基因中的一个突变的肥胖(ob/ob)小鼠(wiegman(威格曼)等人，(2003)diabetes(糖尿病)，52：1081-1089)；包含ldl受体的纯合敲除的小鼠(ldlr-/-小鼠；ishibashi(泽木和之)等人，(1993)jclininvest(临床研究期刊)92(2)：883-893)；饮食诱导的动脉粥样硬化小鼠模型(ishida(石田)等人，(1991)j.lipid.res.(脂质研究期刊)，32：559-568)；以及杂合脂蛋白脂肪酶敲除小鼠模型(weistock(威斯特克)等人，(1995)j.clin.invest.(临床研究期刊)96(6)：2555-2568)。取决于希望局部还是全身治疗以及取决于有待治疗的区域，可以将本发明的药物组合物按多种方式给予。给予可以是局部的(例如，通过透皮贴剂)；肺的，例如通过粉末或气溶剂的吸入或吹入，包括通过喷雾器；气管内的；鼻内的；表皮的以及经皮的、经口的或肠胃外的。肠胃外给予包括静脉内的、动脉内的、皮下的、腹膜内的或肌内的注射或输注；皮下的，例如经由植入性装置；或颅内的，例如通过实质内的、鞘内的或心室内的给予。irna可以按这样的方式递送以靶向具体组织，如肝脏(例如，肝脏的肝细胞)。用于局部给予的药物组合物以及配制品可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶剂、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体以及粉末。常规的药物载体、水、粉末或油基、增稠剂等可以是必要的或希望的。包衣的避孕套、手套等也可以是有用的。适合的局部用配制品包括其中本发明中表征的irna与局部用递送剂，例如脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂和表面活性剂混合的那些。适合的脂质和脂质体包括中性(例如，二油酰磷脂酰dope乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱dmpc、二硬脂酰磷脂酰胆碱)，阴性(例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油dmpg)和阳离子脂质和脂质体(例如，二油酰四甲基氨基丙基dotap和二油酰磷脂酰乙醇胺dotma)。本发明表征的irna可以包囊化在脂质体中或可以形成与脂质体特别是阳离子脂质体的复合物。可替代地，irna可以与脂质、特别是与阳离子脂质复合。适合的脂肪酸与酯包括但不局限于花生四烯酸、油酸、花生酸、月桂酸、羊脂酸、羊蜡酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、甘油单油酸酯、甘油二月桂酸酯、1-单癸酸甘油酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉毒碱、酰基胆碱、或c1-10烷基酯(例如，异丙基肉豆蔻酸酯ipm)、甘油一酯、甘油二酯或其药学上可接受的盐。局部用配制品在美国专利号6,747,014中详细描述，所述专利通过引用结合在此。a.包括膜质分子集合体的irna配制品可以配制用于在本发明的组合物和方法中使用的irna，用于在膜质分子集合体(例如脂质体或胶束)中的递送。如在此使用，术语“脂质体”意为一种由以至少一个双分子层，例如一个双分子层或多个双分子层排列的两亲性分子脂质构成的囊泡。脂质体包括单层的和多层的囊泡，其具有一个形成自亲脂材料的膜以及一个水性内部。该水性部分包括该irna组合物。亲脂的材料从一个水性外部分离了该水性内部，该水性外部典型地不包括该irna组合物，尽管在一些实例中它可能包括。脂质体对于转移和递送活性成分至作用部位是有用的。因为脂质体膜在结构上类似于生物膜，所以当脂质体被应用至一个组织时，该脂质体双分子层与这些细胞膜的双分子层融合。随着脂质体的合并和细胞进程，这些包括该irna的内部水性内容物被递送入该细胞，在这里该irna可特异性地结合至靶rna并可介导rnai。在一些情况中，该脂质体也被特异地靶向，例如指导该irna到具体的细胞型。包含一种rnai剂的脂质体可通过多种方法制备。在一个实例中，一种脂质体的脂质组分被溶解于洗涤剂中，这样使得用该脂质组分形成胶束。例如，该脂质组分可以是一种两亲阳离子的脂质或脂质共轭物。该洗涤剂可具有一个高临界胶束浓度并可以是非离子的。示例性的洗涤剂包括胆酸盐、chaps、辛基葡糖苷、脱氧胆酸盐、以及月桂酰肌氨酸。然后将该rnai剂添加至包括该脂质组分的胶束中。脂质上的阳离子基团与该rnai剂相互作用并围绕该rnai剂凝聚以形成脂质体。在凝聚之后，去除该洗涤剂，例如通过透析，以获得rnai剂的脂质体制剂。如果必要的话，在凝聚反应期间可添加有助于凝聚的载体化合物，例如通过受控的添加。例如，该载体化合物可以是核酸之外的一种聚合物(例如精胺或亚精胺)。也可调节ph以促进凝聚。用于生产稳定的多核苷酸递送运载体(其合并了一个多核苷酸/阳离子脂质复合物作为该递送运载体的结构组分)的方法，进一步在例如wo96/37194中描述，将其全部内容通过引用结合在此。脂质体形成还可包括在felgner(费尔格纳)，p.l.等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa(美国科学院院刊)8：7413-7417；美国专利号4,897,355；美国专利号5,171,678；bangham(班厄姆)等人，(1965)m.mol.biol.(分子生物学方法)23：238；olson(奥尔森)等人，(1979)biochim.biophys.acta(生物化学与生物物理学学报)557：9；szoka(斯左卡)等人，(1978)proc.natl.acad.sci.(美国科学院院刊)75：4194；mayhew(梅休)等人，(1984)biochim.biophys.acta(生物化学与生物物理学学报)775：169；kim(金姆)等人，(1983)biochim.biophys.acta(生物化学与生物物理学学报)728：339；以及fukunaga(福永)等人，(1984)endocrinol.(分泌学)115：757中所述的示例性方法的一个或多个方面。用于制备适当大小的用于用作递送运载体的脂质凝集体的常用技术包括超声波破碎和冻融加挤出(见，例如mayer(迈尔)，(1986)biochim.biophys.acta(生物化学与生物物理学学报)858：161)。当所希望的是一致地小的(50至200nm)以及相对均匀的凝集体时可使用微流化(mayhew(梅休)，(1984)biochim.biophys.acta(生物化学与生物物理学学报)775：169)。这些方法容易地适用于将rnai剂包装为脂质体。脂质体分成两大类。阳离子脂质体是带正电荷的脂质体，其与带负电荷的核酸分子相互作用而形成一种稳定的复合物。该带正电荷的核酸/脂质体复合物结合至带负电荷的细胞表面并且内化在内涵体中。由于内涵体内部的酸性ph，脂质体破裂，释放它们的内容物至细胞胞质中(wang(王)等人，(1987)biochem.biophys.res.commun.(生物化学与生物物理学研究通讯)，147,980-985)。ph-敏感或带负电荷的脂质体包埋核酸而不与之复合。由于该核酸与该脂质是带类似的电荷，所以发生排斥而不是复合形成。虽然如此，一些核酸被捕获在这些脂质体的水性内部中。ph敏感的脂质体已经用于将编码胸苷激酶基因的核酸递送至培养中的细胞单层。在靶细胞内检测到外源基因的表达(zhou(周)等人，(1992)journalofcontrolledrelease(控释杂志)，19,269-274)。脂质体组合物的一个主要类型包括磷脂，除了天然衍生的磷脂酰胆碱。中性脂质体组合物，例如可以从二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc)或二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)形成。阴离子脂质体组合物通常从二肉豆蔻酰磷脂酰甘油形成，而阴离子融合脂质体主要从二油酰磷脂酰乙醇胺(dope)形成。另一个类型的脂质体组合物从磷脂酰胆碱(pc)(例如像大豆pc和卵pc)形成。另一个类型从磷脂和/或磷脂酰胆碱和/或胆固醇的混合物形成。其他在体外和体内将脂质体引入细胞的方法的实例包括美国专利号5,283,185；美国专利号5,171,678；wo94/00569；wo93/24640；wo91/16024；felgner(费尔格纳)，(1994)j.biol.chem.(生物化学杂志)269：2550；nabel(纳贝尔)，(1993)proc.natl.acad.sci.(美国科学院院报)90：11307；nabel(纳贝尔)，(1992)humangenether.(人类基因疗法)3：649；gershon(格申)，(1993)biochem.(生物化学)32：7143；以及strauss(斯特劳斯)，(1992)embo期刊，11：417。也已经检验非离子型脂质体系统以确定它们在递送药物至皮肤中的效用，特别是包括非离子表面活性剂和胆固醇的系统。包括novasometmi(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及novasometmii(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将环孢霉素a递送入小鼠皮肤的真皮。结果表明，此类非离子型脂质体系统在促进环孢霉素a沉积进入皮肤的不同层之内方面是有效的(hu(胡)等人，(1994)s.t.p.pharma.sci.(s.t.p.药物科学)，4(6)：466)。脂质体还包括“立体化学稳定的”脂质体，这个术语如在此使用，指包括一种或多种专门化脂质的脂质体，当并入脂质体中时这些脂质导致相对于缺少此类专门化脂质的脂质体而言的增加的循环寿命。立体化学稳定的脂质体的实例是以下那些：在其中该脂质体的形成囊泡的脂质部分中的一部分(a)包括一种或多种糖脂，例如单唾液酸神经节苷酯gm1，或者(b)是用一种或多种亲水聚合物衍生，例如聚乙二醇(peg)部分。虽然不希望受任何具体理论束缚，但是本领域认为，至少对于包含神经节苷酯、鞘磷脂或peg-衍生脂质的立体化学稳定的脂质体而言，这些立体化学稳定的脂质体的增加的循环半寿期是由于进入网状内皮系统(res)细胞的减少的摄取(allen(阿勒)等人，(1987)febsletters(febs通讯)，223：42；wu(吴)等人，(1993)cancerresearch(癌症研究)，53：3765)。包括一种或多种糖脂的不同脂质体是本领域已知的。papahadjopoulos(帕帕哈都久珀罗斯)等人(ann.n.y.acad.sci.(纽约科学院年报)，1987，507，64)报道了单唾液酸神经节苷酯gm1、硫酸半乳糖脑苷脂以及磷脂酰肌醇改进脂质体的血液半衰期的能力。这些发现由gabizon(噶碧佐)等人(proc.natl.acad.sci.u.s.a.(美国科学院院刊)，1988，85，：6949)阐明。美国专利号4,837,028以及wo88/04924(都归于allen(阿勒)等人)披露了包括以下项的脂质体：(1)鞘磷脂以及(2)神经节苷脂gm1或半乳糖脑苷脂硫酸酯。美国专利号5,543,152(webb(韦伯)等人)披露了包括鞘磷脂的脂质体。包括1，2-sn-二肉豆蔻磷脂酰胆碱的脂质体在wo97/13499(lim(利姆)等人)中披露。在一个实施例中，使用了阳离子脂质体。阳离子脂质体拥有能够融合至细胞膜的优势。非阳离子脂质体尽管不能一样有效地与质膜融合，但是可以被体内巨噬细胞摄取并可被用于递送rnai剂至巨噬细胞。脂质体的另外的优势包括：获得自天然磷脂质的脂质体是生物相容性的以及生物可降解的；脂质体可以合并广泛范围的水以及脂质可溶性药物；脂质体可以保护包囊化的rnai剂在其内部区室内免于受到代谢与降解(rosoff(罗索夫)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，卷1，245页)。在制备脂质体配制品时的重要考虑事项是脂质体的脂质表面电荷、囊泡尺寸和含水体积。带正电荷的合成阳离子脂质n-[1-(2，3-二油烯基氧基)丙基]-n，n，n-三甲基氯化铵(dotma)可被用于形成小的脂质体，该脂质体与核酸自发地互相作用以形成脂质-核酸复合物，该复合物能够与组织培养细胞的细胞膜的带负电荷的脂质融合，导致rnai剂的递送(见例如felgner(费尔格纳)，p.l.等人，(1987)proc.natl.acad.sci.usa(美国国家科学院院刊)8：7413-7417以及美国专利号4,897,355对于dotma及其与dna一起使用的说明)。dotma类似物1，2-双(油烯基氧基)-3-(三甲胺)丙烷(dotap)可以与磷脂组合使用以形成dna复合囊泡。lipofectintm(bethesdaresearchlaboratories(毕士大研究实验室)，gaithersburg(盖士堡)，md.)是一种用于将高阴离子核酸递送入活的组织培养细胞中的有效剂，其包括带正电荷的dotma脂质体，该脂质体与带负电荷的多核苷酸自发地互相作用以形成复合物。当使用足够的带正电荷的脂质体时，所得复合物上的净电荷也是正的。以此方法制备的带正电荷的复合物自发地附在带负电荷的细胞表面，与质膜融合，并有效地递送功能性核酸进入例如组织培养细胞。另一种可商购的阳离子脂质1，2-双(油烯基氧基)-3，3-(三甲胺)丙烷(“dotap”)(boehringermannheim(宝灵曼)，indianapolis(印第安纳波利斯)，indiana(印第安纳州))与dotma的不同在于该油烯基部分被酯连接，而不是醚键。其他报道的阳离子脂质化合物包括已与多个部分共轭的那些，这些部分包括例如羧精胺(已与两种类型的脂质中的一种共轭的)并包括化合物例如5-羧精胺酰甘氨酸二辛油酰基酰胺(carboxyspermylglycinedioctaoleoylamide)(“dogs”)(transfectamtm，promega(普洛麦格)，madison(麦迪逊)，wisconsin(威斯康星州))以及二棕榈酰磷脂酰乙醇胺5-羧精胺酰-酰胺(“dppes”)(参见例如美国专利号5,171,678)。另外一种阳离子脂质共轭物包括已被配制成脂质体的具有胆固醇的脂质的衍生化(“dc-chol”)与dope的组合(参见gao(高)，x.和huang(黄)，l.，(1991)biochim.biophys.res.commun.(生物化学与生物物理学研究通讯)179：280)。通过将聚赖氨酸共轭至dope制造的脂多聚赖氨酸已被报道在血清存在下对转染有效(zhou(周)，x.等人，(1991)biochim.biophys.acta(生物化学与生物物理学学报)1065：8).对于某些细胞系，这些包含共轭的阳离子脂质的脂质体据说比包含dotma组合物显示了更低毒性并提供更有效转染。其他可商购的阳离子脂质产品包括dmrie和dmrie-hp(vical(维考)，lajolla(拉荷亚)，加利福尼亚)以及脂质体(lipofectamine)(dospa)(lifetechnology，inc.(生命技术公司)，盖瑟斯堡，马里兰州)。其他适合于递送寡核苷酸的阳离子脂质描述于wo98/39359和wo96/37194中。脂质体配制品特别适合局部给予，脂质体呈现超出其他配制品的若干优势。此类优势包括：减少的与所给予药物的高全身吸收相关的副作用、在希望的靶处所给予药物的增加的积累、以及将rnai剂给予进入皮肤的能力。在一些实现方式中，脂质体被用于递送rnai剂至表皮细胞并且也被用于加强将rnai剂渗透入皮组织，例如进入皮肤。例如，该脂质体可以局部应用。配制为脂质体的药物向皮肤的局部递送已被记录(见例如weiner(韦纳)等人，(1992)journalofdrugtargeting(药物靶向杂志)，卷2，405-410以及duplessis(杜普利斯)等人，(1992)antiviralresearch(抗病毒研究)，18：259-265；mannino(曼尼诺)，r.j.andfould-fogerite(古尔德弗格里特)，s.，(1998)biotechniques(生物技术)6：682-690；itani(伊塔尼)，t.等人，(1987)gene(基因)56：267-276；nicolau(尼古拉)，c.等人(1987)meth.enzymol.(酶学方法)149：157-176；straubinger(斯特劳宾格)，r.m.和papahadjopoulos(帕帕哈都久珀罗斯)，d.(1983)meth.enzymol.(酶学方法)101：512-527；wang(王)，c.y.和huang(黄)，l.，(1987)proc.natl.acad.sci.usa(美国科学院院刊)84：7851-7855)。也已经检验非离子型脂质体系统以确定它们在递送药物至皮肤中的效用，特别是包括非离子表面活性剂和胆固醇的系统。包括novasomei(二月桂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)以及novasomeii(二硬脂酸甘油酯/胆固醇/聚氧乙烯-10-硬脂酰醚)的非离子型脂质体配制品用于将药物递送入小鼠皮肤的真皮。具有rnai剂的此类配制品对于治疗皮肤学失调是有用的。包括irna的脂质体可被制造得高度可变形。此类可变形性课使该脂质体渗透穿过小于该脂质体的加权平均半径的孔。例如，传递体是可变形脂质体的一个类型。可以通过向一种标准的脂质体组合物中添加表面边缘激活剂(通常是表面活性剂)制造传递体。为了将rnai剂递送至皮肤中的角质化细胞，包括rnai剂的传递体可被例如皮下地通过感染递送。为了跨过完整的哺乳动物皮肤，脂质囊泡必须在适合的经皮梯度的影响下穿过一系列的细孔，每一孔具有小于50nm的直径。此外，由于脂质特性，这些传递体可以是自优化性的(适应例如皮肤中孔的形状)、自我修复性的、并且可以频繁地到达它们的靶而不片段化，并且通常是自我负载性的。其他适合于本发明的配制品描述于2008年1月2日提交的美国临时申请序列号61/018,616；2008年1月2日提交的61/018,611；2008年3月26日提交的61/039,748；2008年4月22日提交的61/047,087以及2008年5月8日提交的61/051,528中。2007年10月3日提交的pct申请号pct/us2007/080331也描述了适合于本发明的配制品。传递体是仍一个类型的脂质体，并且是高度可变形的脂质聚集物，它们是药物递送运载体的诱人候选物。传递体可以描述为脂滴，其是高度可变形从而它们能够容易地穿过比该脂滴更小的孔。传递体能适应在其中使用它们的环境，例如它们是自优化性的(能适应皮肤中孔的形状)、自我修复性的、频繁地到达它们的靶而不片段化，并且通常是自我负载性的。为了产生传递体，可能向标准脂质体组合物添加表面边缘激活物，通常是表面活性剂。传递体已经用来递送血清白蛋白至皮肤。已经示出传递体介导的血清白蛋白递送与皮下注射包含血清白蛋白的溶液同样有效。发现表面活性剂广泛应用于配制品，例如乳剂(包括微乳剂)和脂质体中。将许多不同类型的(天然的和合成的)表面活性剂的特性分类和排序的最常见方式是使用亲水/亲油平衡值(hlb)。亲水基团(也称作“头”)的性质提供用于对在配制品中使用的不同表面活性剂进行分类的最有用的手段(rieger(列赫尔)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，1988，285页)。如果表面活性分子没有离子化，则将它分类为非离子表面活性剂。发现非离子表面活性剂广泛应用于药物和化妆产品中并且是在广泛ph值范围内可用的。通常，它们的hlb值范围从2至约18，取决于它们的结构。非离子表面活性剂包括非离子酯，例如乙二醇酯、丙二醇酯、甘油基酯、聚甘油基酯、脱水山梨糖醇酯、蔗糖酯和乙氧基化酯。该分类中也包括非离子烷醇酰胺和醚，例如脂肪醇乙氧基化物、丙氧基化醇、和乙氧基化的/丙氧基化的嵌段聚合物。聚氧乙烯表面活性剂是非离子表面活性剂类别的最流行成员。如果表面活性分子在水中溶解或分散时携带负电荷，则将这种表面活性剂分类为阴离子性。阴离子表面活性剂包括羧化物，例如皂，酰基乳酸酯、氨基酸的酰基酰胺、硫酸酯，例如烷基硫酸酯和乙氧基化烷基硫酸酯，磺酸酯，例如烷基苯磺酸酯、酰基羟乙基磺酸酯、酰基牛磺酸酯和磺基琥珀酸酯、和磷酸酯。阴离子表面活性剂类别的最重要成员是烷基硫酸酯和皂。如果表面活性分子在水中溶解或分散时携带正电荷，则将这种表面活性剂分类为阳离子性。阳离子表面活性剂包括季铵盐和乙氧化胺。季铵盐是这个类别的最常用成员。如果表面活性分子具有携带正电荷抑或负电荷的能力，则将这种表面活性剂分类为两性的。两性表面活性剂包括丙烯酸衍生物、取代的烷基、n-烷基甜菜碱和磷酯。已经综述了表面活性剂在药物、配制品和在乳剂中的用途(rieger(列赫尔)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，n.y.，1988，第285页)。用于在本发明的方法中使用的irna也可作为胶束配制品提供。“胶束”此处被定义为分子集合体的一个具体类型，其中两亲分子是以球形结构安排，这样使得该分子的疏水部分向内，留下亲水部分与周围的水相接触。如果周围介质是疏水性的，就存在逆向安排。适合于用于递送贯穿经皮的膜的混合胶束配制品可通过将该sirna组合物的水溶液、碱金属c8至c22烷基硫酸盐以及胶束形成化合物混合来制备。示例性胶束形成化合物包括卵磷脂、透明质酸、透明质酸药学上可接受的盐、乙醇酸、乳酸、春黄菊提出物、黄瓜提出物、油酸、亚油酸、亚麻酸、油酸单甘油酯、一油酸、单月桂酸酯、琉璃苣油、月见草油、薄荷醇、三羟基氧基胆酰甘氨酸及其药学上可接受的盐、甘油、聚甘氨酸、赖氨酸、聚赖氨酸、三油精、聚氧化乙烯醚及其类似物、聚多卡醇烷基醚及其类似物、鹅脱氧胆酸盐、脱氧胆酸盐、及其混合物。胶束形成化合物可以在添加该碱金属烷基硫酸盐的同时或之后添加。混合胶束将实质上伴随着这些成分的任何类的混合但有力的混合形成以提供更小尺寸的胶束。在一种方法中，制备了第一种胶束组合物，其包含该sirna组合物以及至少该碱金属烷基硫酸盐。然后该第一胶束组合物与至少三种胶束形成化合物混合以形成一种混合胶束组合物。在另一种方法中，该胶束组合物是通过将该sirna组合物、该碱金属烷基硫酸盐和至少一种胶束形成化合物混合，随后添加剩余胶束形成化合物，用有力的混合来制备。可以将苯酚和/或间位甲酚添加到混合胶束组合物中以稳定该配制品并保护其免受细菌生长。可替代地，可添加苯酚和/或间位甲酚与胶束形成成分。还可在该混合胶束组合物形成之后添加一种等渗剂，例如甘油。为了递送作为一种喷雾的胶束配制品，可以将该配制品放置于气溶胶喷罐中，并用一种推进剂填充该喷罐。该推进剂(其处于压力下)在该喷罐中是处于液体形式的。调整这些成分的比率，这样使得该水相和推进剂相成为一体即存在单相。如果存在两相，有必要在分散一部分内容物之前摇动该喷罐，例如通过量阀。药剂的分散量是从量阀中以细雾进行推进的。推进剂可包括含氢气氯氟烃、含氢气氟碳化合物、二甲醚和二乙醚。在某些实施例中，可以使用hfa134a(1，1，1，2-四氟乙烷)。必要成分的特定浓度可以通过相对简单明了的实验确定。为了通过口腔吸收，通常希望增加例如至少两倍或三倍的用于通过注射或通过胃肠道给予的剂量。b.核酸脂质颗粒本发明的irna，例如dsrna可被完全包囊在脂质配制品中，例如从而形成一种splp、psplp、snalp或其他核酸-脂质颗粒。如在此使用，术语“snalp”指一种稳定的核酸-脂质颗粒，包括splp。如在此使用，术语“splp”指一种核酸-脂质颗粒，其包括包囊在脂质囊泡中的质粒dna。snalp与splp典型地包含一种阳离子脂质、一种非阳离子脂质、以及一种防止颗粒聚集的脂质(例如，一种peg-脂质轭合物)。snalp与splp对于全身应用是极其有用的，因为它们展示出在静脉内(i.v.)注射之后延长的循环寿命并且在远端部位积累(例如身体上与给予部位分开的部位)。splp包括“psplp”，psplp包括一种包囊化的缩合剂-核酸复合物，如在pct公开号wo00/03683中所提出的。本发明的颗粒典型地具有约50nm至约150nm，更典型地是约60nm至约130nm，更典型地是约70nm至约110nm，最典型地是约70nm至约90nm的平均直径，并且基本上是无毒的。此外，在本发明的核酸-脂质颗粒中存在时，核酸在水溶液中抵抗核酸酶降解。核酸-脂质颗粒以及它们的制备方法披露于例如美国专利号5,976,567；5,981,501；6,534,484；6,586,410；6,815,432；美国申请号2010/0324120以及pct公开号wo96/40964中。在一个实施例中，脂质与药物的比率(质量/质量比率)(例如，脂质与dsrna的比率)将处于从约1∶1至约50∶1，从约1∶1至约25∶1，从约3∶1至约15∶1，从约4∶1至约10∶1，从约5∶1至约9∶1，或约6∶1至约9∶1的范围内。以上这些引用范围的中间范围也预期成为本发明的一部分。阳离子脂质可以是例如，n，n-二油烯基-n，n-二甲基氯化铵(dodac)、n，n-二硬脂酰-n，n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(i-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵(dotap)、n-(i-(2，3-二油烯基氧基)丙基)-n，n，n-三甲基氯化铵(dotma)、n，n-二甲基-2，3-二油烯基氧基)丙胺(dodma)、1，2-二亚油基氧基(dilinoleyloxy)-n，n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、1，2-二亚麻基氧基(dilinolenyloxy)-n，n-二甲基氨基丙烷(dlendma)、1，2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-c-dap)、1，2-二亚油基氧基-3-(二甲基氨基)乙酰氧基丙烷(dlin-dac)、1，2-二亚油基氧基-3-吗啉代丙烷(dlin-ma)、1，2-二亚油基酰基-3-二甲基氨基丙烷(dlindap)、1，2-二亚油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(dlin-s-dma)、1-亚油基酰基-2-亚油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(dlin-2-dmap)、1，2-二亚油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(dlin-tma.c1)、1，2-二亚油基酰基-3-三甲基氨基丙烷氯化盐(dlin-tap.c1)、1，2-二亚油基氧基-3-(n-甲基哌嗪)丙烷(dlin-mpz)、或3-(n，n-二亚油基氨基)-1，2-丙二醇(dlinap)、3-(n，n-二油烯基氨基)-1，2-丙二醇(doap)、1，2-二亚油基氧代-3-(2-n，n-二甲基氨基)乙氧基丙烷(dlin-eg-dma)、1，2-二亚麻基氧基-n，n-二甲基氨基丙烷(dlindma)、2，2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(dlin-k-dma)或其类似物、(3ar，5s，6as)-n，n-二甲基-2，2-二((9z，12z)-十八-9，12-二烯)四氢-3ah-环戊[d][1，3]二氧杂环戊烯-5-胺(aln100)、(6z，9z，28z，31z)-三十七-6，9，28，31-四-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯(mc3)、1，1′-(2-(4-(2-((2-(双(2-羟基月桂基)氨基)乙基)(2-羟基月桂基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基脲二基)二十二烷-2-醇(techg1)，或其混合物。阳离子脂质可以占该颗粒中存在的总脂质的从约20mol％至约50mol％或约40mol％。在另一个实施例中，化合物2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环可以用来制备脂质-sirna纳米颗粒。2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环的合成在2008年10月23日提交的美国临时专利申请号61/107,998中描述，所述专利通过引用结合在此。在一个实施例中，脂质颗粒包括40％2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环∶10％dspc∶40％胆固醇∶10％peg-c-domg(摩尔百分数)，同时粒度为63.0±20nm并且sirna/脂质比为0.027。可电离的/非阳离子脂质可以是一种阴离子脂质或一种中性脂质，包括但不局限于：二硬脂酰磷酸卵磷酯(dspc)、二油酰基磷酸卵磷酯(dopc)、二棕榈酰磷酸卵磷酯(dppc)、二油酰基磷脂酰甘油(dopg)、二棕榈酰磷脂酰甘油(dppg)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺(dope)、棕榈酰油酰基磷酸卵磷酯(popc)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(pope)、二油酰基-磷脂酰乙醇胺4-(n-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧酸酯(dope-mal)、二棕榈酰磷脂酰基乙醇胺(dppe)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(dmpe)、二硬脂酰-磷脂酰-乙醇胺(dspe)、16-o-一甲基pe、16-o-二甲基pe、18-1-反式pe、1-硬脂酰-2-油酰基-磷脂酰乙醇胺(sope)、胆固醇，或其混合物。非阳离子脂质(如果包括胆固醇的话)可以占该颗粒中存在的总脂质的从约5mol％至约90mol％，约10mol％，或约58mol％。抑制颗粒聚集的轭合脂质可以是例如一种聚乙二醇(peg)-脂质，包括但不局限于peg-二酰基甘油-(dag)、peg-二烷氧基丙基(daa)、peg-磷脂、peg-神经酰胺(cer)，或其混合物。peg-daa共轭物可以例如是peg-二月桂基氧丙基(ci2)、peg-二肉豆蔻基氧丙基(ci4)、peg-二棕榈基氧丙基(ci6)或peg-二硬脂基氧丙基(c]8)。防止颗粒聚集的共轭脂质可以占该颗粒中存在的总脂质的从0mol％至约20mol％或约2mol％。在一些实施例中，核酸-脂质颗粒进一步包括胆固醇，该例如占颗粒中存在的总脂质的约10mol％到约60mol％或约48mol％。在一个实施例中，脂质nd98.4hcl(mw1487)(参见2008年3月26日提交的美国专利申请号12/056,230，将该申请通过引用结合在此)、胆固醇(sigma-aldrich公司)和peg-脑苷脂c16(avanti极性脂质)可以用来制备脂质-dsrna纳米颗粒(即，lnp01颗粒)。可以如下制备每种组分在乙醇中的母液：nd98，133mg/ml；胆固醇，25mg/ml，peg-脑苷脂c16，100mg/ml。nd98、胆固醇和peg-脑苷脂c16母液可以然后以例如42∶48∶10摩尔比合并。合并的脂质溶液可以与(例如，ph5乙酸钠中的)含水dsrna混合，这样使得乙醇终浓度是约35-45％并且乙酸钠终浓度是约100-300mm。一旦混合，脂质-dsrna纳米颗粒典型地自发形成。取决于所希望的粒度分布，可以使用例如热桶挤出机，例如lipex挤出机(northernlipids，inc(北部脂质有限公司))，经聚碳酸酯膜(例如，100nm截值)挤出所产生的纳米颗粒混合物。在一些情况下，可省略挤出步骤。可以通过例如透析或切线流过滤实现乙醇移除和同时交换缓冲液。缓冲液可以与例如约ph7，例如，约ph6.9、约ph7.0、约ph7.1、约ph7.2、约ph7.3或约ph7.4的磷酸盐缓冲盐水(pbs)交换。lnp01配制品例如在国际申请公开号wo2008/042973中描述，所述文献通过引用结合在此。额外的示例性的脂质-dsrna配制品描述于下表中。dspc：二硬脂酰磷脂酰甘油dppc：二肉豆蔻磷脂酰胆碱peg-dmg：peg-二肉豆蔻酰甘油(c14-peg，或peg-c14)(平均分子量为2000的peg)peg-dsg：peg-二苯乙烯基甘油(c18-peg，或peg-c18)(平均分子量为2000的peg)peg-cdma：peg-氨甲酰基-1，2-二肉豆蔻基氧丙胺(平均分子量为2000的peg)包括snalp(1，2-二亚麻基氧基-n，n-二甲基氨基丙烷(dlindma))的配制品描述于2009年4与15日提交的国际公开号wo2009/127060中，通过引用将其结合在此。包括xtc的配制品描述于例如以下各项中：2009年1月29日提交的美国临时序列号61/148,366；2009年3月2日提交的美国临时序列号61/156,851；2009年6月10日提交的美国临时序列号；2009年7月24日提交的美国临时序列号61/228,373；2009年9月3日提交的美国临时序列号61/239,686，以及2010年1月29日提交的国际申请号pct/us2010/022614，将其通过引用结合在此。包括mc3的配制品描述于例如2010年6月10日提交的美国公开号2010/0324120中，该申请的全部内容通过引用结合在此。包括alny-100的配制品描述于例如以下中：2009年11月10日提交的国际专利申请号pct/us09/63933，将其通过引用结合在此。包括c12-200的配制品描述于例如以下各项中：2009年5月5日提交的美国临时序列号61/175,770以及2010年5月5日提交的国际申请号pct/us10/33777，将其通过引用结合在此。可电离/阳离子脂质的合成在本发明的核酸-脂质颗粒中使用的任何化合物，例如，阳离子脂质等可以通过已知的有机合成技术(包括在实例中更详细描述的方法)制备。除非另外指明，否则全部取代基如下文定义。“烷基”是指包含从1至24个碳原子的一种支链或者支链的、非环状的或环状的、饱和的脂肪族烃。代表性饱和直链烷基包括甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、等；而饱和支链烷基包括异丙基、仲丁基、异丁基、叔丁基、异戊基、等。代表性饱和环状烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、等；而不饱和环状烷基包括环丙烯基和环己烯基、等。“烯基”是指如上所定义的一种在相邻的碳原子之间包含至少一个双键的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性直链和支链烯基包括乙烯基、丙烯基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2，3-二甲基-2-丁烯基、等。“炔基”是指如上所定义的在相邻的碳之间额外地包含至少一个三键的任何烷基或烯基。代表性直链和支链炔基包括乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-甲基-1-丁炔基、等。“酰基”是指如以下所定义的，其中附接点处的碳被一个氧基取代的任何烷基、烯基或炔基。例如，-c(＝o)烷基、-c(＝o)烯基和-c(＝o)炔基是酰基。“杂环”是指一个5-至7-元单环的或7-至10-元二环的杂环的环，其是饱和的、非饱和的、抑或芳香的，并且其包含1或2个独立地选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中该氮和硫杂原子可被任选地氧化，并且该氮杂原子可被任选地季胺化，包括二环的环，其中以上杂环的任一与一个苯环融合。杂环可以经任何杂原子或碳原子附接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基、吡咯烷酮基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基(piperizynyl)、乙内酰脲基(hydantoinyl)、戊内酸胺基(valerolactamyl)、环氧乙烷基、氧杂环丁烷基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、四氢吡啶基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、四氢嘧啶基、四氢噻吩基、四氢噻喃基、等。术语“任选地取代的烷基”、“任选地取代的烯基”、“任选地取代的炔基”、“任选地取代的酰基”、以及“任选地取代的杂环”是指当被取代时，至少一个氢原子被一个取代基替换。在氧代取代基(“＝o”)的情况下，两个氢原子被置换。在此方面，取代基包括氧基、卤素、杂环、-cn、-orx、-nrxry、-nrxc(＝o)ry、-nrxso2ry、-c(＝o)rx、-c(＝o)orx、-c(＝o)nrxry、-sonrx和-sonnrxry，其中n是0、1或2，rx和ry是相同或不同的并且独立地是氢、烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基的每一个可以进一步由以下取代基的一种或多种取代：氧代、卤素、-oh、-cn、烷基、-orx、杂环、-nrxry、-nrxc(＝o)ry、-nrxso2ry、-c(＝o)rx、-c(＝o)orx、-c(＝o)nrxry、-sonrx和-sonnrxry。“卤素”是指氟、氯、溴、以及碘。在一些实施例中，本发明的方法可能需要使用保护基。保护基方法学是本领域普通技术人员熟知的(见例如，protectivegroupsinorganicsynthesis(有机合成中的保护基团)，green(格林)，t.w.等人，wiley-interscience(威利交叉科学)，纽约城，1999)。简言之，本发明上下文中的保护基是减少或消除官能团的不想要的反应性的任何基团。在某些反应期间可向一个官能团中添加保护基以掩模它的反应性并且然后去除以揭示最初的官能团。在一些实施例中，使用了一个“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除一个醇官能团的不想要的反应性的任何基团。可以使用本领域熟知的技术添加和去除保护基。式a的合成在一些实施例中，使用具有式a的阳离子脂质配制本发明的核酸-脂质颗粒：其中r1和r2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且r3和r4独立地是低级烷基或r3和r4可以是一起形成任选取代的杂环。在一些实施例中，阳离子脂质是xtc(2，2-二亚油基-4-二甲基氨基乙基-[1，3]-二氧戊环)。通常，可以通过以下反应方案1或2制造以上具有式a的脂质，其中除非另外指明，否则全部取代基如上文定义。方案1根据方案1制备脂质a，其中r1和r2独立地是烷基、烯基或炔基，每种可以是任选取代的，并且r3和r4独立地是低级烷基或r3和r4可以是一起形成任选取代的杂环。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备酮1和溴化物2。1和2的反应产生缩酮3。用胺4处理缩酮3产生具有式a的脂质。具有式a的脂质可以用具有式5的有机盐转化成相应的铵盐，其中x是选自卤素、氢氧化物、磷酸根、硫酸根、等的阴离子反离子。方案2可替代地，可以根据方案2制备酮1起始材料。可以购买或根据本领域普通技术人员已知的方法制备grignard(格氏)试剂6和氰化物7。6和7的反应产生酮1。酮1转化成相应具有式a的脂质如方案1所述。mc3的合成如下制备dlin-m-c3-dma(即，(6z，9z，28z，31z)-三十七碳-6，9，28，31-四烯-19-基4-(二甲基氨基)丁酸酯)。将(6z，9z，28z，31z)-三十七-6，9，28，31-四烯-19-醇(0.53g)，4-n，n-二甲基氨基丁酸盐酸盐(0.51g)、4-n，n-二甲氨基吡啶(0.61g)和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺)盐酸盐(0.53g)在二氯甲烷(5ml)中的溶液在室温搅拌过夜。将该溶液用稀盐酸洗涤，随后用稀水性碳酸氢钠洗涤。将该有机部分经无水硫酸镁干燥，过滤并在旋转蒸发仪上去除溶剂。使用1-5％甲醇/二氯甲烷洗脱梯度，使残余物通过硅胶柱(20g)。合并包含纯化产物的级分并且移除溶剂，产生无色油(0.54g)。alny-100的合成使用以下方案3进行缩酮519[alny-100]的合成：515的合成在0℃在氮气氛下向双颈rbf(1l)中lialh4(3.74g，0.09852mol)在200ml无水thf中的搅拌悬液缓慢添加514(10g，0.04926mol)在70mlthf中的溶液。在完成添加后，将反应混合物加温至室温并且随后加热至回流持续4h。通过tlc监测反应的进程。在完成反应(通过tlc)后，将混合物冷却至0℃并且通过小心添加饱和na2so4溶液淬灭。将反应混合物在室温搅拌4小时并滤出。将残余物用thf充分洗涤。将滤液和洗涤液混合并用400ml二噁烷和26ml浓hcl稀释并且在室温搅拌20分钟。在真空下剥离挥发物以提供作为白色固体的515盐酸盐。产率：7.12g1h-nmr(dmso，400mhz)：δ＝9.34(宽的，2h)，5.68(s，2h)，3.74(m，1h)，2.66-2.60(m，2h)，2.50-2.45(m，5h).516的合成向250ml双颈rbf中化合物515在100ml干dcm中的搅拌溶液添加net3(37.2ml，0.2669mol)并在氮气氛下冷却至0℃。在缓慢添加50ml干dcm中的n-(苄氧羰酰氧基)-琥珀酰亚胺(20g，0.08007mol)后，允许反应混合物加温到室温。在反应结束(通过tlc检测2-3小时)后，将混合物用1nhcl溶液(1x100ml)和饱和nahco3溶液(1x50ml)依次洗涤。然后在无水na2so4上干燥有机层并且蒸发溶剂以给出粗制材料，所述粗制材料通过硅胶柱层析纯化以获得作为粘性物质的516。产率：11g(89％).1h-nmr(cdcl3，400mhz)：δ＝7.36-7.27(m，5h)，5.69(s，2h)，5.12(s，2h)，4.96(br.，1h)2.74(s，3h)，2.60(m，2h)，2.30-2.25(m，2h).lc-ms[m+h]-232.3(96.94％)。517a和517b的合成将环戊烯516(5g，0.02164mol)溶解于单颈500mlrbf中的220ml丙酮和水(10∶1)的溶液中，并且在室温向其添加n-甲基吗啉-n-氧化物(7.6g，0.06492mol)，随后添加叔-丁醇中的4.2ml7.6％oso4溶液(0.275g，0.00108mol)。在反应结束(约3小时)后，将混合物通过添加固体na2so3淬灭并且将所产生的混合物在室温搅拌1.5小时。将反应混合物用dcm(300ml)稀释并且用水(2x100ml)洗涤，随后用饱和nahco3(1x50ml)溶液、水(1x30ml)并最终用盐水(1x50ml)洗涤。用无水na2so4干燥有机相并且在真空中移除溶剂。粗制材料的硅胶柱层析纯化提供非对映异构体的混合物，所述非对映异构体由制备级hplc分离。产率：-6g粗品517a-峰-1(白色固体)，5.13g(96％)。1h-nmr(dmso，400mhz)：δ＝7.39-7.31(m，5h)，5.04(s，2h)，4.78-4.73(m，1h)，4.48-4.47(d，2h)，3.94-3.93(m，2h)，2.71(s，3h)，1.72-1.67(m，4h).lc-ms-[m+h]-266.3，[m+nh4+]-283.5存在，hplc-97.86％。通过x射线证实立体化学。518的合成使用与被描述用于合成化合物505的方法类似的程序，获得作为无色油的化合物518(1.2g，41％)。1h-nmr(cdcl3，400mhz)：δ＝7.35-7.33(m，4h)，7.30-7.27(m，1h)，5.37-5.27(m，8h)，5.12(s，2h)，4.75(m，1h)，4.58-4.57(m，2h)，2.78-2.74(m，7h)，2.06-2.00(m，8h)，1.96-1.91(m，2h)，1.62(m，4h)，1.48(m，2h)，1.37-1.25(brm，36h)，0.87(m，6h).hplc-98.65％。用于合成化合物519的一般程序将化合物518(1eq)在己烷(15ml)中的溶液以逐滴方式添加至lah在thf(1m，2当量)中的冰冷溶液。在完成添加后，将混合物在40℃加热0.5小时，然后在冰浴上再次冷却。将混合物用饱和水性na2so4小心地水解，然后经塞里滤料过滤并缩减成油。柱层析提供作为无色油获得的纯519(1.3g，68％)。13cnmrδ＝130.2，130.1(x2)，127.9(x3)，112.3，79.3，64.4，44.7，38.3，35.4，31.5，29.9(x2)，29.7，29.6(x2)，29.5(x3)，29.3(x2)，27.2(x3)，25.6，24.5，23.3，226，14.1；电喷雾ms(+ve)：c44h80no2(m+h)+的计算分子量为654.6，发现分子量为654.6。可以按相似方式表征通过标准方法抑或无挤出方法制备的配制品。例如，配制品典型地通过视检表征。它们应当是不含聚集物或沉积物的发白半透明溶液。脂质-纳米颗粒的粒度和粒度分布可以由光散射法，使用例如malvern(莫尔文)zetasizernanozs(malvern(莫尔文)，美国)测量。颗粒应当是大小约20-300nm，例如40-100nm。颗粒大小分布应该是单峰。配制品中的总dsrna浓度连同捕获的级分是使用染料排除测定来评估。配制的dsrna的样品可以与rna结合染料，例如ribogreen(分子探针)在配制品破坏性表面活性剂(例如，0.5％triton-x100)存在或不存在下孵育。配制品中的总dsrna可以相对于标准曲线，通过来自包含表面活性剂的样品的信号来确定。捕获的级分是通过从该总dsrna内含物中减去“游离”dsrna内含物(如通过在表面活性剂不存在下的信号所测量的)来确定。封装dsrna的百分比典型地＞85％。对于snalp配制品，粒度是至少30nm、至少40nm、至少50nm、至少60nm、至少70nm、至少80nm、至少90nm、至少100nm、至少110nm和至少120nm。适合范围典型地是约至少50nm至约至少110nm、约至少60nm至约至少100nm或约至少80nm至约至少90nm。用于口服给予的组合物和配制品包括粉剂或颗粒剂、微粒剂，纳米颗粒剂、水或非水介质中的悬浮液或溶液剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、香囊剂、片剂或微型片剂。增稠剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或粘合剂可以是想要的。在一些实施例中，口服配制品是其中本发明中表征的dsrna结合一种或多种增渗表面活性剂和螯合剂一起给予的那些。适合的表面活性剂包括脂肪酸和/或酯或其盐，胆酸和/或其盐。适合的胆酸/盐包括鹅脱氧胆酸(cdca)和熊脱氧胆酸(udca)、胆酸、脱氢胆酸、脱氧胆酸、葡糖胆酸(glucholicacid)、甘氨胆酸、甘氨脱氧胆酸、牛磺胆酸、牛磺脱氧胆酸、牛磺-24，25-二氢夫西地酸钠和二氢夫西地酸钠。适合的脂肪酸和酯包括但不局限于花生四烯酸、十一烷酸、油酸、二十烷酸、月桂酸、辛酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油精、二月桂精、甘油基1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、或单酰甘油、二酰甘油或其药学上可接受的盐(例如，钠盐)。在一些实施例中，例如，使用增渗剂组合，与胆酸/盐组合的脂肪酸/盐。一个示例性组合是月桂酸、癸酸和udca的钠盐。其他增渗剂包括聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-20-鲸蜡基醚。本发明中表征的dsrna可以经口以包括喷雾干燥颗粒在内的颗粒形式递送或复合以形成微颗粒或纳米颗粒。dsrna复合剂包括聚氨基酸；聚亚胺；聚丙烯酸酯；聚丙烯酸烷基酯、聚氧乙烷(polyoxethane)、聚氰基丙烯酸烷基酯；阳离子化明胶、白蛋白、淀粉、丙烯酸酯、聚乙二醇(peg)和淀粉；聚氰基丙烯酸烷基酯；deae衍生化聚亚胺、短梗霉多糖纤维素和淀粉。适合的复合剂包括壳聚糖、n-三甲基壳聚糖、聚-l-赖氨酸、多组氨酸、聚鸟氨酸、聚精胺、鱼精蛋白、聚乙烯基吡啶、聚硫代二乙基氨基甲基乙烯p(tdae)、聚氨基苯乙烯(例如，对-氨基)、聚(氰基丙烯酸甲酯)、聚(氰基丙烯酸乙酯)、聚(氰基丙烯酸丁酯)、聚(氰基丙烯酸异丁酯)、聚(氰基丙烯酸异己酯)、deae-甲基丙烯酸酯、deae-丙烯酸己酯、deae-丙烯酰胺、deae-白蛋白和deae-葡聚糖、聚丙烯酸甲酯、聚丙烯酸己酯、聚(d，l-乳酸))、聚(dl-乳酸-共-乙醇酸(plga)、藻酸盐和聚乙二醇(peg)。dsrna的口服配制品和它们制备在美国专利6,887,906、美国未公开的专利号no.20030027780和美国专利号6,747,014中详述，所述文献的每一篇通过引用结合在此。用于肠胃外、实质内(进入脑)、鞘内、心室内或肝内给予的组合物和配制品可以包括无菌水溶液剂，其也可以包含缓冲液、稀释剂和其他适合的添加物，例如，但不局限于，增渗剂、载体化合物和其他药学上可接受的载体或赋形剂。本发明的药物组合物包括但不局限于溶液剂、乳剂和包含脂质体的配制品。这些组合物可以从包括但不局限于预制液体、自乳化固体和自乳化半固体的多种组分产生。特别优选是在治疗肝失调，例如肝癌时靶向肝脏的配制品。本发明的药物配制品，其可以便利地以单位剂量形式提供，可以根据制药业中熟知的常规技术制备。此类技术包括使活性成分与一种或多种药用载体或赋形剂结合的步骤。通常，通过以下方式制备配制品：使活性成分与液体载体或精细分散的固体载体或这两者均匀且密切地结合，并且如需要，然后使该产物成形。本发明的组合物可以配制成许多可能剂型的任一种，例如，但不局限于片剂、胶囊剂、凝胶胶囊剂、液体糖浆剂、软凝胶剂、栓剂、和灌肠剂。本发明的组合物还可以被配制为在水性或非水性介质或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。c.额外的配制品i.乳剂可以将本发明的组合物制备和配制为乳剂。乳剂典型地是一种液体以液滴形式(通常直径超过0.1μμm)分散在另一种中的非均匀系统(参见例如，ansel＇spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(安塞尔的药品剂型和药物递送系统)，allen(艾伦)，lv.，popovich(波波维奇)ng.和ansel(安塞尔)hc.，2004，lippincottwilliams&wilkinss(威廉姆斯和威尔金斯)(第8版)，纽约，纽约州；idson(爱德森)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，199页；rosoff(罗索夫)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，245页；block(布洛克)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷2，335页；higuchi(希古契)等人，在remington’spharmaceuticalsciences(雷明顿氏药物科学)中，mackpublishingco.(麦克出版公司)，easton(伊斯顿)，pa.，1985，301页)。乳剂经常是包括相密切混合和彼此分散的两种不溶混液的双相系统。通常，乳剂可以为油包水(w/o)抑或水包油(o/w)种类。当水相精细分至本体油相中并作为微小液体分散至本体油相中时，所产生的组合物称作油包水(w/o)乳剂。可替代地，当油相精细分至本体水相中并作为微小液体分散至本体水相中时，所产生的组合物称作水包油(o/w)乳剂。除了分散相和活性药物外，乳剂还可以包含额外组分，活性药物可以作为在水相、油相中的溶液，抑或其自身作为独立相。如果需要，也可以存在药物赋形剂，例如乳化剂、稳定剂、染料和抗氧化剂。药物乳剂还可以为包括多于两种相的多重乳剂，例如像油包水包油(o/w/o)和水包油包水(w/o/w)乳剂的情况。这类复合配制品经常提供简单双元乳剂所不具备的某些优点。其中o/w乳剂的单个油液滴封闭小水滴的多重乳剂构成w/o/w乳剂。同样地，在油质连续相中稳定的水小球中封闭的油液滴的系统提供o/w/o乳剂。乳剂以低或无热动力稳定性为特征。经常，乳剂的分散相或不连续相充分分散于外部相或连续相中并且通过乳化剂或配制品粘度以这种形式维持。在乳剂状软膏基料或膏剂的情况下，乳剂的每个相都可以为半固体或固体。其他稳定乳剂的手段需要使用乳化剂，这些乳化剂可以合并进入到乳剂的任何相中。乳化剂可以大致分成4类：合成性表面活性剂、天然存在的乳化剂、吸收基质和精细分散的固体(见例如，ansel＇spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(安塞尔的药品剂型和药物递送系统)，allen(艾伦)，lv.，popovich(波波维奇)ng.和ansel(安塞尔)hc.，2004，lippincottwilliams&wilkins(威廉姆斯和威尔金斯)(第8版)，纽约，纽约州；idson(爱德森)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，第1卷，第199页)。合成表面活性剂，也称作表面活性试剂，已经发现广泛应用于乳剂的配制并且已经在文献中综述(见例如，ansel＇spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(安塞尔的药品剂型和药物递送系统)，allen(艾伦)，lv.，popovich(波波维奇)ng.和ansel(安塞尔)hc.，2004，lippincottwilliams&wilkinss(威廉姆斯和威尔金斯)(第8版)，纽约，纽约州；rieger(列赫尔)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，285页；idson(爱德森)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，1988，第1卷，第199页)。表面活性剂典型地是两性的并且包括亲水部分和疏水部分。表面活性剂的亲水对疏水性质的比率已经称作亲水/亲油平衡值(hlb)并且是在制备配制品时表面活性剂分类和选择的有价值工具。表面活性剂可以基于亲水基团的性质：非离子、阴离子、阳离子和两亲分成不同类别(参见例如，ansel＇spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystem(安塞尔的药品剂型和药物递送系统)，allen(艾伦)，lv.，popovich(波波维奇)ng.和ansel(安塞尔)hc.，2004，lippincottwilliams&wilkins(威廉姆斯和威尔金斯)(第8版)，纽约，纽约州；rieger(列赫尔)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，第1卷，第285页)。用于乳剂配制品中的天然存在的乳化剂包括羊毛脂、蜂蜡，磷酯、卵磷脂和阿位伯树胶。吸收基质拥有亲水特性，这样使得它们可以吸水以形成w/o乳剂，而仍保留它们的半固态一致性，例如无水羊毛脂和亲水矿脂。也已经使用精细分散的固体作为良好乳化剂，尤其与表面活性剂组合时和在粘稠制品中使用。这些包括极性无机固体，例如重金属氢氧化物、非溶胀粘土，例如膨润土、凹凸棒土、锂蒙脱石，高岭土、蒙脱土、胶态硅酸铝和胶态镁硅酸铝，颜料和非极性固体，例如碳或甘油基三硬脂酸酯。多种非乳化材料也包括于乳剂配制品中并且对乳剂的特性有贡献。这些包括脂肪、油、蜡、脂肪酸、脂肪醇、脂肪酯、湿润剂、亲水胶体、防腐剂和抗氧化剂(block(布洛克)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，335页；idson(爱德森)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，卷1，199页)。亲水胶体或水胶体包括天然存在的树胶和合成聚合物，例如多糖(例如，阿位伯树胶、琼脂、海藻酸、角叉菜胶、瓜耳胶、卡拉亚胶和黄蓍胶)、纤维素衍生物(例如，羧甲基纤维素和羧丙基纤维素)和合成聚合物(例如，卡波姆、纤维素醚和羧乙烯基聚合物)。这些胶体在水中分散或溶胀以形成胶体溶液，所述胶体溶液通过围绕分散相液滴形成坚固界面薄膜并通过外部相的粘度稳定乳剂。由于乳剂通常包含多种可以容易地支持微生物生长的成分，例如碳水化合物、蛋白、固醇和磷脂，所以这些配制品通常包含防腐剂。乳剂配制品中包括的常用的防腐剂包括尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、季铵盐、苯扎氯铵、对-羟基苯甲酸的酯、和硼酸。也常添加抗氧化剂至乳剂配制品以防止配制品的劣化。所用的抗氧化剂可以是自由基清除剂，例如生育酚，没食子酸烷基酯、丁化羟基茴香醚、丁化羟基甲苯，或还原剂，例如抗坏血酸和焦亚硫酸钠，和抗氧化剂增效剂，例如柠檬酸、酒石酸、和卵磷脂。经由皮肤途径、口途径和肠胃途径途径应用乳剂配制品和制造它们的方法已经在文献中综述(参见例如，ansel＇spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(安塞尔的药品剂型和药物递送系统)，allen(艾伦)，lv.，popovich(波波维奇)ng.和ansel(安塞尔)hc.，2004，lippincottwilliams&wilkins(威廉姆斯和威尔金斯)(第8版)，纽约，纽约州；idson(爱德森)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，第1卷，第199页)。口服递送的乳剂配制品已经非常广泛地使用，原因在于易于配制连同从吸收和生物利用率的观点看有效(参见例如，ansel＇spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(安塞尔的药品剂型和药物递送系统)，allen(艾伦)，lv.，popovich(波波维奇)ng.和ansel(安塞尔)hc.，2004，lippincottwilliams&wilkins(威廉姆斯和威尔金斯)(第8版)，纽约，纽约州；rosoff(罗索夫)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，第1卷，第245页；idson(爱德森)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，第1卷，第199页)。矿物油基质泻药、油溶性维生素和高脂营养制剂属于常见作为o/w乳剂口服给予的材料。ii.微乳剂在本发明的一个实施例中，将irna和核酸的组合物配制为微乳剂。可以将微乳剂定义为水、油和两亲分子的系统，所述系统是单一光学各向同性和热动力学稳定的单一液态溶液(参见例如，ansel＇spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(安塞尔的药品剂型和药物递送系统)，allen(艾伦)，lv.，popovich(波波维奇)ng.和ansel(安塞尔)hc.，2004，lippincottwilliams&wilkins(威廉姆斯和威尔金斯)(第8版)，纽约，纽约州；rosoff(罗索夫)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，第1卷，第245页)。典型地，微乳剂是通过以下方式制备的系统：首先在表面活性剂水溶液中分散油并且然后添加足够量的第四组分(通常是中等链长度的醇)以形成透明系统。因此，微乳剂也已经被描述成由表面活性分子的界面膜稳定化的两种不能混合的液体的热力学稳定的各向同性的澄清分散体(leung(朗)与shah(纱)，在：controlledreleaseofdrugs：polymersandaggregatesystems(药物的受控释放：聚合物和聚集体系统)，rosoff，m.(罗索夫，m.)，ed.，1989，vchpublishers(vch出版公司)，纽约，第185-215页)。微乳剂常经由组合三至2五种组分来制备，所述组分包括油、水、表面活性剂、辅助表面活性剂和电解质。微乳剂是为油包水(w/o)还是水包油(o/w)类型取决于所使用的油和表面活性剂的特性以及表面活性剂分子的极性头部和羟基尾的结构和几何包装(schott(斯科特)，在remington’spharmaceuticalsciences(雷明顿氏药物科学)中，mackpublishingco.(麦克出版公司)，easton(伊斯顿)，pa.，1985，p.271)。已经广泛研究了利用相图的现象学方法并且对本领域普通技术人员，该方法已经产生怎样配制微乳剂的广泛知识(参见例如，ansel＇spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(安塞尔的药品剂型和药物递送系统)，allen(艾伦)，lv.，popovich(波波维奇)ng.和ansel(安塞尔)hc.，2004，lippincottwilliams&wilkins(威廉姆斯和威尔金斯)(第8版)，纽约，ny；rosoff(罗索夫)，在pharmaceuticaldosageforms(药物剂型)中，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，第1卷，第245页；block(布拉克)，引自pharmaceuticaldosageform(药物剂型)，lieberman(利伯曼)，rieger(列赫尔)与banker(斑克)(编辑)，1988，marceldekker，inc.(马塞尔·德克公司)，纽约，纽约州，第1卷，第335页)。与常规乳剂相比，微乳剂提供以下优点：在自发形成的热动力学稳定液滴的配制品中溶解水不溶性药物。在制备微乳剂时使用的表面活性剂包括但不局限于单独或与辅助表面活性剂组合的离子型表面活性剂、非离子表面活性剂、brij96、聚氧乙烯油基醚、聚甘油脂肪酸酯、四甘油单月桂酸酯(ml310)、四甘油单油酸酯(mo310)、六甘油单油酸酯(po310)、六甘油五油酸酯(po500)、十甘油单癸酸酯(mca750)、十甘油单油酸酯(mo750)、十甘油倍半油酸酯(so750)、十甘油十油酸酯(dao750)。通过渗入表面活性剂膜并因此因表面活性分子之间产生的孔隙空间而产生无序膜，辅助表面活性剂(通常是短链醇，例如乙醇、1-丙醇和1-丁醇)起到增加界面流动性的作用。然而，微乳剂可以不用助表面活性剂进行制备，并且无醇的自乳化微乳剂系统是本领域已知的。典型地，水相可以是(但不局限于)水、药物的水溶液、甘油、peg300、peg400、聚甘油、丙二醇、和乙二醇的衍生物。油相可以包括但不局限于多种材料，例如captex300、captex355、capmulmcm、脂肪酸酯，中等链(c8-c12)的单、二和三甘油三酯，聚氧乙基化的甘油脂肪酸酯、脂肪醇，聚乙二醇化的甘油酯(polyglycolizedglyceride)，饱和的聚乙二醇化的c8-c10甘油酯、植物油和硅油。从药物增溶和增强药物吸收的观点看，微乳剂是特别有意义的。已经提出基于脂质的微乳剂(o/w和w/o)以增强药物(包括肽)的口服生物利用率(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；constantinides(康斯坦丁尼德斯)等人，pharmaceuticalresearch(药物研究)，1994，11，1385-1390；ritschel(里切尔)，meth.find.exp.clin.pharmacol.(实验与临床药理学的方法与发现)，1993，13，205)。微乳剂提供以下优点：改进药物溶解、保护药物免遭酶水解、可能因表面活性剂引起的膜流动性和通透性改变而增强药物吸收、易于制备、比固体剂型易于口服给予、临床效力改善和毒性降低(参见例如，美国专利号6,191,105；7,063,860；7,070,802；7,157,099；constantinides(康斯坦丁尼德斯)等人，pharmaceuticalresearch(药物研究)，1994，11，1385；ho(霍)等人，j.pharm.sci.(药物科学杂志)，1996，85，138-143)。通常，当微乳剂的组分在环境温度下混合在一起时，它们可以自发形成微乳剂。在配制热不稳定药物、肽或irna时，这可以是特别有利的。微乳剂也已经有效在化妆品和药物应用中透皮递送活性组分。预期本发明的微乳剂组合物和配制品将促进irna和核酸从胃肠道的全身吸收增加，连同改善irna和核酸的局部细胞摄取。本发明的微乳剂也可以包含额外的组分和添加剂，例如脱水山梨糖醇单硬脂酸酯(grill3)、labrasol、和改善配制品特性并增强本发明irna和核酸吸收的增渗剂。本发明的微乳剂中使用的增渗剂可以分成归于五大类中之一：表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合的非表面活性剂(lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1991，p.92)。上文已经讨论这些类别的每一种。iii.微粒本发明的rnai剂可并入一种颗粒，例如一种微粒中。微粒可通过喷雾干燥产生，但还可能通过其他方法，包括冻干法、蒸发、流化床干燥、真空干燥、或这些技术的组合产生。iv.增渗剂在一个实施例中，本发明采用不同增渗剂来实现向动物皮肤有效递送核酸，特别是irna。大多数药物在溶液中以离子化和非离子化形式存在。然而，通常仅脂溶性或亲脂性药物容易地地跨过细胞膜。已经发现，如果用增渗剂处理要跨过的膜，甚至连非亲脂药物都可以跨过细胞膜。除辅助非亲脂性药物跨细胞膜扩散之外，增渗剂还增强亲脂性药物的通透性。可以将增渗剂划分为属于5大类之一，即，表面活性剂、脂肪酸、胆盐、螯合剂和非螯合性非表面活性剂(参见例如，malmsten(马尔姆斯滕)，m.surfactantsandpolymersindrugdelivery(药物递送中的表面活性剂和聚合物)，informahealthcare(英富曼医疗保健)，纽约，纽约州，2002；lee(李)等人，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1991，第92页)。下文更详细地描述上文提到的增渗剂的每个类别。表面活性剂(或“表面活性试剂”)为化学实体，当其溶解在水溶液中时，它能降低该溶液的表面张力或者水溶液和另一种液体之间的界面张力，结果是irna通过粘膜的吸收得到增强。除了胆盐和脂肪酸之外，这些增渗剂还包括例如月桂醇硫酸钠、聚氧乙烯基-9-月桂基醚和聚氧乙烯基-20-鲸蜡基醚(见例如，malmsten(马尔姆斯滕)，m.surfactantsandpolymersindrugdelivery(药物递送中的表面活性剂和聚合物)，informahealthcare(英富曼医疗保健)，纽约，纽约州，2002；lee(李)等人，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1991，p.92)；以及全氟化学乳剂如fc-43(takahashi(高松)等人，j.pharm.pharmacol.(药物药理学杂志)，1988，40，252)。充当增渗剂的不同脂肪酸及其衍生物例如包括油酸、月桂酸、癸酸(正癸酸)、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、亚麻酸、二癸酸酯、三癸酸酯、单油精(1-单油酰-外消旋-甘油)、二月桂精、辛酸、花生四烯酸、甘油1-单癸酸酯、1-十二烷基氮杂环庚-2-酮、酰基肉碱、酰基胆碱、其c1-20烷基酯(例如、甲基酯、异丙基酯和叔丁基酯)及其单和二甘油酯(即、油酸酯、月桂酸酯、癸酸酯、肉豆蔻酸酯、棕榈酸酯、硬脂酸酯、亚油酸酯等)(参见例如，touitou(图伊杜)，e.等人，enhancementindrugdelivery(药物递送中的增强)，crc出版社，danvers(丹弗斯)，ma，2006；lee(李)等人，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1991，第92页；muranishi(村西)，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1990，7，1-33；elhariri(哈里里)等人，j.pharm.pharmacol.(药物药理学)，1992，44，651-654)。胆汁的生理学作用包括促进脂质和脂溶性维生素的分散和吸收(参见例如，malmsten(马尔姆斯滕)，m.surfactantsandpolymersindrugdelivery(药物递送中的表面活性剂和聚合物)，informahealthcare(英富曼医疗保健)，纽约，ny，2002；brunton(布鲁顿)，第38章，引自：goodman&gilman(古德曼&吉尔曼)的thepharmacologicalbasisoftherapeutics(治疗学的药理学基础)，第9版，hardman(哈德曼)等人编辑，mcgraw-hill(麦格劳希尔集团)，纽约，1991，第934-935页)。不同天然胆盐和它们的合成性衍生物充当增渗剂。因此术语“胆盐”包括胆汁中天然存在的任何组分连同它们的任何合成衍生物。适合的胆盐包括，例如，胆酸(或其可药用的钠盐，胆酸钠)、脱氢胆酸(脱氢胆酸钠)、脱氧胆酸(脱氧胆酸钠)、葡糖胆酸(葡糖胆酸钠)、甘氨胆酸(甘氨胆酸钠)、甘氨脱氧胆酸(甘氨脱氧胆酸钠)、牛磺胆酸(牛磺胆酸钠)、牛磺脱氧胆酸(牛磺脱氧胆酸钠)、鹅脱氧胆酸(鹅脱氧胆酸钠)、熊脱氧胆酸(udca)、牛磺-24，25-二氢夫西地酸钠(stdhf)、二氢夫西地酸钠和聚氧乙烯-9-月桂基醚(poe)(参见例如，malmsten(马尔姆斯滕)，m.surfactantsandpolymersindrugdelivery(药物递送中的表面活性剂和聚合物)，informahealthcare(英富曼医疗保健)，纽约，ny，2002；lee(李)等人，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1991，第92页；swinyard(斯文亚德)，第39章，引自：remington＇spharmaceuticalsciences(雷明顿氏药物科学)，第18版，gennaro(热纳罗)编辑，mackpublishingco.(麦克出版公司)，easton(伊斯顿)，pa.，1990，第782-783页；muranishi(村西)，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1990，7，1-33；yamamoto(山本)等人，j.pharm.exp.ther.(实验与临床药物杂志)，1992，263，25；yamashita(山本)等人，j.pharm.sci.(药物科学杂志)，1990，79，579-583)。如联系本发明使用的螯合剂可以定义为通过金属离子与其形成复合物将金属离子从溶液中除去的化合物，结果是通过粘膜的irna的吸收得到加强。关于它们在本发明中作为增渗剂的应用，因为多数特征化的dna核酸酶需要二价金属离子用于催化并且因此可以被螯合剂抑制，螯合剂还具有充当dnase抑制剂的附加优势(jarrett(加热特)，j.chromatogr.(色谱学杂志)，1993，618，315-339)。适合的螯合剂包括但不局限于乙二胺四乙酸二钠(edta)、柠檬酸、水杨酸盐(酯)(如水杨酸钠、5-甲氧水杨酸酯和高香草酸酯)、胶原质的n-酰基衍生物、月桂醇聚醚-9和β-二酮的n-氨基酰基衍生物(烯胺)(见例如，katdare(凯特戴瑞)，a.等人，excipientdevelopmentforpharmaceutical，biotechnology，anddrugdelivery(用于制药、生物技术和药物递送的赋形剂的发展)，crc出版社，danvers(丹弗斯)，马萨诸塞州，2006；lee(李)等人.，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1991，第92页；muranishi(村西)，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1990，7，1-33；buur(布尔)等人，j.controlrel.(控释杂志)，1990，14，43-51)。如在此使用，非螯合性非表面活性剂渗透增强化合物可以定义为作为螯合剂或作为表面活性剂展示不明显活性但是反而增强irna经消化道粘膜吸收的化合物(参见例如，muranishi(村西)，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1990，7，1-33)。这种类别的增渗剂包括例如不饱和环状脲、1-烷基-和1-烯基氮杂环-烷酮衍生物(lee(李)等人，criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems(治疗性药物载体系统锐评)，1991，第92页)；和非甾体抗炎药如双氯芬酸钠、吲哚美辛和保泰松(yamashit(山下)等人，j.pharm.pharmacol.(药物药理学)，1987，39，621-626)。也可以添加在细胞水平增强摄取irna的剂至本发明的药物组合物和其他组合物。例如，阳离子脂质，例如lipofectin(junichi(淳一)等人，美国专利号5,705,188)、阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子，例如聚赖氨酸(lollo(洛洛)等人，pct申请wo97/16529)也已知增强细胞摄取dsrna。可商购转染试剂的实例包括例如lipofectaminetm(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、lipofectamine2000tm(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、293fectintm(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、cellfectintm(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、dmrie-ctm(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、freestyletmmax(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、lipofectaminetm2000cd(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、lipofectaminetm(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、rnaimax(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、oligofectaminetm(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、optifecttm(invitrogen(英杰公司)；卡尔斯巴德，加利福尼亚州)、x-tremegeneq2转染试剂(roche(罗氏公司)；grenzacherstrasse(格兰扎克尔街)，瑞士)、dotap脂质体转染试剂(grenzacherstrasse(格兰扎克尔街)，瑞士)、dosper脂质体转染试剂(grenzacherstrasse(格兰扎克尔街)，瑞士)或fugene(grenzacherstrasse(格兰扎克尔街)，瑞士)、试剂(promega(普洛麦格公司)；麦迪逊，威斯康星州)、transfasttm转染试剂(promega(普洛麦格公司)；麦迪逊，威斯康星州)、tfxtm-20试剂(promega(普洛麦格公司)；麦迪逊，威斯康星州)、tfxtm-50试剂(promega(普洛麦格公司)；麦迪逊，威斯康星州)、dreamfecttm(ozbiosciences(oz生物科学公司)；马赛市，法国)、ecotransfect(ozbiosciences(oz生物科学公司)；马赛市，法国)、transpassad1转染试剂(newenglandbiolabs(新英格兰生物实验室)；伊普斯威奇，马萨诸塞州，美国)、lyovectm/lipogentm(invivogen(英杰公司)；圣迭戈，加利福尼亚州，美国)、perfectin转染试剂(genlantis(金恩兰提斯)；圣迭戈，加利福尼亚州，美国)、neuroporter转染试剂(genlantis(金恩兰提斯)；圣迭戈，加利福尼亚州，美国)、geneporter转染试剂(genlantis(金恩兰提斯)；圣迭戈，加利福尼亚州，美国)、geneporter2转染试剂(genlantis(金恩兰提斯)；圣迭戈，加利福尼亚州，美国)、cytofectin转染试剂(genlantis(金恩兰提斯)；圣迭戈，加利福尼亚州，美国)、baculoporter转染试剂(genlantis(金恩兰提斯)；圣迭戈，加利福尼亚州，美国)、troganportertm转染试剂(genlantis(金恩兰提斯)；圣迭戈，加利福尼亚州，美国)、ribofect(bioline(比奥立)；陶顿，马萨诸塞州，美国)、plasfect(bioline(比奥立)；陶顿，马萨诸塞州，美国)、unifector(b-bridge国际；山景城，加利福尼亚州，美国)、surefector(b-bridge国际；山景城，加利福尼亚州，美国)或hifecttm(b-bridge国际；山景城，加利福尼亚州，美国)，连同其他。其他剂可以用来增强所给予的核酸渗透，包括二醇，例如乙二醇和丙二醇、吡咯，例如2-吡咯、氮酮和萜类，例如苧烯和薄荷酮。v.载体本发明的某些组合物也并入配制品中的载体化合物。如在此使用，“载体化合物”或“载体”可以指核酸或其类似物，它是惰性的(即本身不拥有生物活性)，但却在体内过程中被识别为核酸，能例如通过降解生物活性的核酸或促进其从循环中的除去而降低具有生物活性的核酸的生物利用度。核酸和载体化合物的共给予(典型地后一种物质过量)可以导致肝脏、肾脏或其他外循环储库中回收的核酸量大幅度缩减，假定归因于该载体化合物和该核酸之间对共同受体的竞争。例如，与聚肌苷酸、硫酸葡聚糖、聚胞苷酸或4-乙酰氨基-4′异硫氰酸茋-2，2′-二磺酸共给予时，肝组织中部分硫代磷酸酯化的dsrna的回收可以减少(miyao(宫尾)等人，dsrnares.dev.(dsrna研究与研发)，1995，5，115-121；takakura(高仓)等人，dsrna&nucl.aciddrugdev.(dsrna&核酸药物研发)，1996，6，177-183。vi.赋形剂与载体化合物相比，“药物载体”或“赋形剂”是用于向动物递送一种或多种核酸的药学上可接受的溶剂、悬浮剂或任何其他药学上惰性的运载体。赋形剂可以是液体或固体，当与核酸和特定药物组合物的其他组分组合时，参考所想的计划给予方式，对赋形剂进行选择以提供希望的容积、稠度、等。典型的药用载体包括但不局限于、粘合剂(例如，预糊化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素、等)；填料(例如，乳糖和其他糖、微晶纤维素、果胶、明胶、硫酸钙、乙基纤维素、聚丙烯酸酯或磷酸氢钙、等)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石、二氧化硅、胶态二氧化硅、硬脂酸、金属硬脂酸盐、氢化植物油、玉米淀粉、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、等)；崩解剂(例如，淀粉、淀粉羟乙酸钠、等)；和润湿剂(例如，月桂基硫酸钠、等)。不有害地与核酸反应的适合于非肠胃外给予的药学上可接受的有机或无机赋形剂也可以用来配制本发明的组合物。适合的药学上可接受的载体包括但不局限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。用于局部给予核酸的配制品可以包括在普通溶剂，例如醇中的无菌或非无菌的水溶液、非水溶液，或在液体或固体油基质中的核酸溶液。这些溶液还可以包含缓冲液、稀释液和其他适合的添加剂。可以使用不有害地与核酸反应的适合于非肠胃外给予的药学上可接受的有机或无机赋形剂。适合的药学上可接受的的赋形剂包括但不局限于水、盐溶液、醇、聚乙二醇、明胶、乳糖、直链淀粉、硬脂酸镁、滑石、硅酸、粘性石蜡、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。vii.其他组分本发明的组合物额外地可以包含其他在药物组合物中常规发现的辅助组分，按其技术已建立的使用水平。因此，例如这些组合物可以包含额外的、可相容的药学上有活性的材料，例如止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂或抗炎剂，或者可以包含对本发明的组合物的不同剂型的物理配制有用的额外材料，例如染料、芳香剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、增稠剂和稳定剂。然而，当添加时，此类材料不应当过度干扰本发明组合物的组分的生物活性。可以将这些配制品进行灭菌并且如果希望的话与助剂，例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲液、着色物质、芳香物质和/或芬芳物质等进行混合，这些助剂不与该配制品中的一种或多种核酸发生有害的相互作用。水性悬浮液可以包含增加该悬浮液的粘度的物质，这样的物质包括例如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖。该悬浮液还可以包含稳定剂。在一些实施例中，本发明中表征的药物组合物包括(a)一种或多种irna化合物和(b)一种或多种通过一种非rnai机制发挥功能的并在治疗脂质代谢作用失调中是有用的剂。此类剂的实例包括但不局限于抗炎剂、抗脂肪变性剂、抗病毒剂和/或抗纤维变性剂。此外，其他常用于保护肝脏的物质，例如水飞蓟素还可以与在此所述的irna结合使用。对于治疗肝脏疾病有用的其他剂包括替比夫定、恩替卡韦以及蛋白酶抑制剂，例如特拉匹韦和其他例如在tung(通)等人，美国申请公开号2005/0148548、2004/0167116、和2003/0144217；以及在hale(黑尔)等人，美国申请公开号2004/0127488中所披露的。可以通过标准药学程序在细胞培养物或实验动物中确定此类化合物的毒性和治疗功效，例如，确定ld50(致死群体50％的剂量)和ed50(在50％群体中治疗有效的剂量)。毒性效果和治疗效果之间的剂量比是治疗指数并且它可以表示为ld50/ed50比。优选显示高治疗指数的化合物。从细胞培养物测定法和动物研究中获得的数据可以在配制人类中使用的剂量范围时使用。在本发明中在此表征的组合物剂量总体上处于毒性低或无毒性情况下包括ed50的循环浓度的范围内。该剂量可以取决于所采用的剂型以及利用的给予途径而在该范围内变化。对于任何在本发明表征的方法中使用的化合物，治疗上有效的剂量可以从细胞培养测定来进行初始估计。可以在动物模型中配制一个剂量以实现化合物的或(当适当时)靶序列的多肽产物的循环血浆浓度范围(例如，实现所述多肽浓度降低)，其中所述血浆浓度包括如在细胞培养物中所确定的ic50(即，实验化合物的实现症状的半数最大抑制的浓度)。这类信息可以用来更精确地确定人类中的有用剂量。可以测量血浆中的水平，例如，通过高效液相色谱法。除了它们的给予之外，如在此所讨论的，还可以将在本发明中表征的irna与在治疗由angptl3表达介导的病理学过程方面有效的其他已知剂组合给予。在任何情况下，基于使用本领域已知或在此所述的标准功效量值所观察到的结果，给予医师可以调整irna给予的量和时间安排。vi.本发明的方法本发明还提供使用本发明的irna和/或包含本发明的irna的组合物来减少和/或抑制细胞中的angptl3表达的方法。这些方法包括：将该细胞与本发明的dsrna进行接触并且维持该细胞一段时间，该时间足以获得angptl3基因的mrna转录物的降解，由此抑制细胞中的angptl3基因的表达。基因表达的减少可以通过本领域内已知的任何方法来进行评估。例如，angptl3的表达的减少可以通过如下进行确定：使用对本领域内的普通技术人员而言常规方法(例如rna印迹法、qrt-pcr)来确定angptl3的mrna表达水平，使用对本领域内的普通技术人员而言常规的方法(例如蛋白印迹法、免疫技术)来确定angptl3的蛋白水平。angptl3的表达的减少还可以通过测量angptl3生物活性的降低，例如血脂、甘油三酸酯、胆固醇和/或游离脂肪酸的水平的降低间接评估。在本发明的方法中，细胞可以在体外或体内被接触，即，细胞可以在一个受试者体内。适合于使用本发明的方法的治疗的细胞可以是任何表达angptl3基因的细胞。适合于在本发明的方法中使用的细胞可以是哺乳动物细胞，例如，灵长类细胞(例如人类细胞或非人类灵长类细胞，例如，猴细胞或黑猩猩细胞)、非灵长类细胞(例如奶牛细胞、猪细胞、骆驼细胞、美洲驼细胞、马细胞、山羊细胞、兔细胞、绵羊细胞、仓鼠、豚鼠细胞、猫细胞、狗细胞、大鼠细胞、小鼠细胞、狮子细胞、老虎细胞、熊细胞、或水牛细胞)、鸟细胞(例如，鸭细胞或鹅细胞)、或鲸细胞。在一个实施例中，细胞是人类细胞，例如，人类肝细胞。angptl3表达在细胞中被抑制至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或约100％。本发明的体内方法可以包括将包含irna的组合物给予受试者，其中irna包括与有待治疗的哺乳动物的angptl3基因的rna转录物的至少一部分互补的一个核苷酸序列。当有待治疗的有机体是哺乳动物(例如人类)时，该组合物可以通过本领域内已知的任何手段进行给予，这些手段包括但不局限于经口、腹膜内、或肠胃外途径(包括颅内(例如，心室内、实质内、鞘内)、静脉内、肌内、皮下、经皮、气道(气溶剂)、经鼻、直肠以及局部(包括口腔与舌下)给予)。在某些实施例中，通过静脉内输注或注射来给予这些组合物。在某些实施例中，通过皮下注射来给予这些组合物。在一些实施例中，该给予是经由积存注射。积存注射可以在一个延长的时段以连贯方式释放irna。因此，积存注射可以减少获得所希望的效果，例如所希望的angptl3的抑制、或疗效或预防效果而需要的给药频率。积存注射还可以提供更连贯的血清浓度。积存注射包括皮下注射或肌内注射。在优选的实施例中，积存注射是皮下注射。在一些实施例中，给予是经由一个泵。泵可以是外部泵或手术植入的泵。在某些实施例中，泵是一个皮下植入的渗透泵。在其他实施例中，泵是一个输注泵。输注泵可以用于静脉内、皮下、动脉或硬膜外输注。在优选的实施例中，输注泵是一个皮下输注泵。在其他实施例中，泵是一个手术植入泵，其递送irna至肝。可以基于是希望局部治疗还是全身治疗并且基于有待治疗的区域来选择给予模式。可以选择给予的途径与部位以增强靶向。在一个方面，本发明还提供用于抑制哺乳动物中angptl3基因表达的方法。这些方法包括将包括靶向该哺乳动物的细胞中的angptl3基因的dsrna的组合物给予该哺乳动物并且维持该哺乳动物一段时间，该时间足以获得angptl3基因的mrna转录物的降解，由此抑制angptl3基因在细胞中的表达。基因表达的减少可以通过本领域内任何已知的方法或通过在此描述的方法(例如qrt-pcr)来进行评估。蛋白生产的减少可以通过本领域内任何已知的方法或通过在此描述的方法(例如elisa)来进行评估。在一个实施例中，穿刺肝脏活组织检查样品作为组织材料用于监测angptl3基因和/或蛋白表达的减少。本发明进一步提供治疗对其有需要的受试者的方法。本发明的这些治疗方法包括：将本发明的irna给予受试者，例如以一个治疗有效量的靶向angptl3基因的irna或包括靶向angptl3基因的irna的药物组合物给予，将受益于angptl3表达的减少和/或抑制的受试者。可以将本发明的irna作为“游离irna”进行给予。游离irna是在药物组合物不存在下进行给予的。裸irna可以处在适合的缓冲溶液中。缓冲溶液可以包括乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或其任何组合。在一个实施例中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)。可以将包含irna的缓冲溶液的ph与体积摩尔渗透压浓度进行调节，这样使得它适合给予受试者。可替代地，可以将本发明的irna作为药物组合物，例如dsrna脂质体配制品进行给予。将受益于angptl3基因表达的减少和/或抑制的受试者可以是患有脂质代谢作用失调，例如遗传性脂质代谢作用失调或获得性脂质代谢作用失调的那些。在一个实施例中，患有脂质代谢作用失调的受试者患有高血脂症。在另一个实施例中，患有脂质代谢作用失调的受试者患有高甘油三酯血症。对将受益于angptl3基因表达的减少和/或抑制的受试者的治疗包括治疗性处理(例如患有出疹性黄瘤的受试者)以及预防性处理(例如不患有出疹性黄瘤的受试者或可能有风险发展出疹性黄瘤的受试者)。本发明进一步提供用于使用irna或其药物组合物的方法，例如用于治疗将受益于angptl3表达的减少和/或抑制的受试者，该受试者例如是患有脂质代谢作用失调的受试者，这些方法与其他药物和/或其他治疗方法组合使用，例如与已知的药物和/或已知的治疗方法(例如像目前采用于治疗这些失调的那些)组合使用。例如，在某些实施例中，将靶向angptl3的irna与例如治疗如本文中他处描述的脂质代谢作用失调中有用的剂组合给予。例如，适合治疗将受益于angptl3表达减少的受试者的，例如患有一种脂质代谢作用失调的受试者的额外剂可以包括降低一种或多种血脂的剂。此类剂的非限制性实例可包括胆固醇合成抑制剂，例如hmg-coa还原酶抑制剂，例如他汀类。他汀类可包括阿托伐他汀(立普妥)、氟伐他汀(来适可)、洛伐他汀(美降脂)、洛伐他汀缓释剂(altoprev)、匹伐他汀(力清之(livalo))、普伐他汀(普拉固)、罗苏伐他汀(冠脂妥(crestor))、以及辛伐他汀(素果)。在治疗脂质代谢作用失调中有用的其他剂可包括胆汁螯合剂(bilesequesteringagents)，例如消胆胺及其他树脂；vldl分泌抑制剂、例如烟酸；亲脂的抗氧剂，例如普罗布考；酰基-coa胆固醇酰基转移酶抑制剂；法尼醇x受体拮抗剂；甾醇调节结合蛋白切割活化蛋白(scap)活化剂；微粒体甘油三酯转移蛋白(mtp)抑制剂；apoe相关肽；以及针对angptl3的治疗抗体。额外的治疗剂还以可包括提高高密度脂蛋白(hdl)，例如胆固醇酯转移蛋白(cetp)的剂。此外，该额外的治疗剂还可以包括膳食补充剂，例如鱼油。可以将该irna以及另外的治疗剂在相同时间和/或在相同组合中进行给予，例如非肠胃地，或者可以将该另外的治疗剂作为一种单独组合物的部分或在单独的时间和/或通过本领域内已知的或在此描述的另一种方法进行给予。在一个实施例中，该方法包括将在此表征的组合物进行给予，这样使得靶angptl3基因的表达被降低例如持续约1、2、3、4、5、6、7、8、12、16、18、24小时，28、32、或约36小时。在一个实施例中，靶angptl3基因的表达被降低持续一个延长的持续期，例如至少约两天、三天、四天或更长，例如约一周、两周、三周或四周或更长。优选地，对于在此表征的方法和组合物有用的irna特异性靶向靶angptl3基因的(初级或加工的)rna。使用irna抑制这些基因表达的组合物和方法可以如此处所述那样制备和实施。根据本发明的方法给予dsrna可以导致患有脂质代谢作用失调的患者的此类疾病或病症的严重性、体征、症状、和/或标记减少。在上下文中“减少”意为此类水平的统计学上的显著减少。减少可以是例如至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、或约100％。可以评估治疗或预防疾病的功效，例如通过测量病情进展、疾病缓解、症状严重性、疼痛减少，生活质量，维持治疗效果所要求的药物剂量、适于为了预防而正在治疗或靶向的给定疾病的疾病标记或任何其他可测量参数的水平。完全处于本领域普通技术人员的能力范围是通过测量这类参数的任一个或参数的任何组合监测治疗或预防的功效。例如，脂质代谢作用失调的治疗的功效可以例如通过周期性监测一种或多种血脂水平来进行评估。稍后数据与初始数据的比较为医师提供该治疗是否有效的指示。完全处于本领域普通技术人员的能力范围是通过测量这类参数的任一个或参数的任何组合监测治疗或预防的功效。联系给予靶向angptl3的irna或其药物组合物，“有效针对”脂质代谢作用失调表明以临床上适当的方式进行给予会对至少统计学上显著部分的患者产生有益效果，例如改善的症状、治愈、疾病减少、生命延长、生活质量改善、或被熟悉治疗脂质代谢作用失调及相关原因的医生大体上认可为是积极的其他影响。当在疾病状态的一个或多个参数方面存在统计学上显著的改善的时候，或者通过使得不能恶化或发展否则它们可以被预期的症状，治疗或预防效果是明显的。作为一个实例，在疾病的可测量参数方面的至少10％，并且优选是至少20％、30％、40％、50％或更多的有利改变，可以指示有效治疗。也可以使用如本领域已知的给定疾病的实验动物模型，判定给定irna药物或这种药物配制品的功效。当使用实验动物模型时，在观察到标记或症状的统计显著减少时，证实治疗的功效。可替代地，功效可以基于临床上接受的疾病严重性分级量表(只是一个实例，肝功能评分(child-pughscore)，有时称作肝功能分级评分(child-turcotte-pughscore))，通过如诊断领域内的普通技术人员所确定的疾病严重性的减少来进行测量。产生例如使用适当的量表而测量的疾病严重性的减轻的任何积极改变代表使用如在此描述的irna或irna配制品的足够治疗。可以给予受试者治疗量的dsrna：例如约0.01mg/kg至约5mg/kg、约0.01mg/kg至约10mg/kg、约0.05mg/kg至约5mg/kg、约0.05mg/kg至约10mg/kg、约0.1mg/kg至约5mg/kg、约0.1mg/kg至约10mg/kg、约0.2mg/kg至约5mg/kg、约0.2mg/kg至约10mg/kg、约0.3mg/kg至约5mg/kg、约0.3mg/kg至约10mg/kg、约0.4mg/kg至约5mg/kg、约0.4mg/kg至约10mg/kg、约0.5mg/kg至约5mg/kg、约0.5mg/kg至约10mg/kg、约1mg/kg至约5mg/kg、约1mg/kg至约10mg/kg、约1.5mg/kg至约5mg/kg、约1.5mg/kg至约10mg/kg、约2mg/kg至约about2.5mg/kg、约2mg/kg至约10mg/kg、约3mg/kg至约5mg/kg、约3mg/kg至约10mg/kg、约3.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约5mg/kg、约4.5mg/kg至约5mg/kg、约4mg/kg至约10mg/kg、约4.5mg/kg至约10mg/kg、约5mg/kg至约10mg/kg、约5.5mg/kg至约10mg/kg、约6mg/kg至约10mg/kg、约6.5mg/kg至约10mg/kg、约7mg/kg至约10mg/kg、约7.5mg/kg至约10mg/kg、约8mg/kg至约10mg/kg、约8.5mg/kg至约10mg/kg、约9mg/kg至约10mg/kg、或约9.5mg/kg至约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。例如，可以按以下剂量给予dsrna：约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或约10mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。在其他实施例中，例如，当本发明的组合物包括如在此描述的dsrna以及n-乙酰半乳糖胺时，可以给予受试者治疗量的dsrna，例如一个以下的剂量：约0.1至约50mg/kg、约0.25至约50mg/kg、约0.5至约50mg/kg、约0.75至约50mg/kg、约1至约50mg/mg、约1.5至约50mg/kb、约2至约50mg/kg、约2.5至约50mg/kg、约3至约50mg/kg、约3.5至约50mg/kg、约4至约50mg/kg、约4.5至约50mg/kg、约5至约50mg/kg、约7.5至约50mg/kg、约10至约50mg/kg、约15至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约20至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约25至约50mg/kg、约30至约50mg/kg、约35至约50mg/kg、约40至约50mg/kg、约45至约50mg/kg、约0.1至约45mg/kg、约0.25至约45mg/kg、约0.5至约45mg/kg、约0.75至约45mg/kg、约1至约45mg/mg、约1.5至约45mg/kb、约2至约45mg/kg、约2.5至约45mg/kg、约3至约45mg/kg、约3.5至约45mg/kg、约4至约45mg/kg、约4.5至约45mg/kg、约5至约45mg/kg、约7.5至约45mg/kg、约10至约45mg/kg、约15至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约20至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约25至约45mg/kg、约30至约45mg/kg、约35至约45mg/kg、约40至约45mg/kg、约0.1至约40mg/kg、约0.25至约40mg/kg、约0.5至约40mg/kg、约0.75至约40mg/kg、约1至约40mg/mg、约1.5至约40mg/kb、约2至约40mg/kg、约2.5至约40mg/kg、约3至约40mg/kg、约3.5至约40mg/kg、约4至约40mg/kg、约4.5至约40mg/kg、约5至约40mg/kg、约7.5至约40mg/kg、约10至约40mg/kg、约15至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约20至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约25至约40mg/kg、约30至约40mg/kg、约35至约40mg/kg、约0.1至约30mg/kg、约0.25至约30mg/kg、约0.5至约30mg/kg、约0.75至约30mg/kg、约1至约30mg/mg、约1.5至约30mg/kb、约2至约30mg/kg、约2.5至约30mg/kg、约3至约30mg/kg、约3.5至约30mg/kg、约4至约30mg/kg、约4.5至约30mg/kg、约5至约30mg/kg、约7.5至约30mg/kg、约10至约30mg/kg、约15至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约20至约30mg/kg、约25至约30mg/kg、约0.1至约20mg/kg、约0.25至约20mg/kg、约0.5至约20mg/kg、约0.75至约20mg/kg、约1至约20mg/mg、约1.5至约20mg/kb、约2至约20mg/kg、约2.5至约20mg/kg、约3至约20mg/kg、约3.5至约20mg/kg、约4至约20mg/kg、约4.5至约20mg/kg、约5至约20mg/kg、约7.5至约20mg/kg、约10至约20mg/kg、或约15至约20mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。例如，可以给予受试者治疗量的dsrna：例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或约50mg/kg。这些引用值的中间值与范围也旨在成为本发明的一部分。可以通过静脉输注经一个时段来给予irna，例如经5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、或约25分钟的时段。给予可以例如在一个常规基础上(例如双周地(即，每两周))重复持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长。在初始治疗方案后，可以基于更低频率给予治疗。例如，在每两周给予持续三个月后，给予可以每月重复一次，持续六个月或一年或更长时间。irna的给予可以减少例如患者的细胞、组织、血液、尿或其他区室的angptl3水平至少约5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、39％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、或至少约99％或更多。在给予全剂量的irna之前，可以给予患者更小的剂量，例如5％输注反应，并且监测不良影响，例如过敏反应。在另一个实例中，针对不想要的免疫刺激作用(例如增加的细胞因子(例如，tnf-α或inf-α)水平)对该患者进行监测。可替代地，可以皮下给予即通过皮下注射给予irna。可使用一种或多种注射液以将所希望的每日剂量的irna递送至受试者。该注射液可以过一个时段重复，例如过2、3、4、5、6、7、8、9、10或15天。给予可以例如在一个常规基础上(例如双周地(即，每两周))重复持续一个月、两个月、三个月、四个月或更长。在初始治疗方案后，可以基于更低频率给予治疗。在一些实施例中，单剂量的irna随后是是按月给药。在一些实施例中，给药可以包括在连续日的多重剂量的一个装载期。除非另外限定，否则本在此所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管与在此所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料可以用于实践或测试本发明中表征的irna和方法，然而以下描述适合的方法和材料。在此所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文并入。在矛盾的情况下，本说明书(包括定义)将居主导。此外，所述材料、方法和实例仅是说明性的并且不旨在是限制性的。实例实例1.irna合成试剂来源当在此没有专门给出试剂来源时，此类试剂可以从分子生物学试剂的任何供应商获得，其质量/纯度标准符合分子生物学应用。转录物进行sirna设计以鉴别对ncbi基因库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)中注释的人类angptl3转录物与经由从肝rna制备的cdna测序产生的食蟹猴(cynomolgusmonkey，macacafascicularis；此后称为“cyno”)angptl3转录物进行靶向的sirna。cynoangptl3mrna的测序是在室内进行的，并且mrna序列显示于seqidno：9中。设计使用了来自ncbi集：人类-nm_014495.2(seqidno：1)；小鼠-nm_013913.3(seqidno：2)的以下转录物。所有的与所列的人类和cyno转录物共享100％一致性的sirna双螺旋被设计。以下所述的sirna双螺旋的亚群也与ncbi基因库中找到的小鼠(小家鼠)angptl3转录物共享了100％一致性。sirna设计、特异性以及功效预测从每一序列预测所有可能的19mers的预测特异性。然后对缺少长于7个核苷酸的重复的候选19mers进行选择。然后在针对人类转录组(定义为人类ncbirefseq组中的nm与xm记录的组)的全面搜索中使用这977个候选人类/cynosirna以及也匹配小鼠(“人类/cyno/小鼠候选者sirna”)的38的亚群，使用python脚本‘bruteforce(蛮力).py’中实现的一个详尽的“蛮力”算法。脚本接着剖析转录物-寡(核苷酸)比对以产生基于该sirna和任何潜在的“脱靶”转录物之间的错配的位置和数量的打分。加权脱靶分数以强调sirna的“种子”区域中的不同，在该分子的5＇末端的位置2-9)。通过对个体错配分数求和对来自该蛮力搜索的每个寡(核苷酸)-转录物对给出错配分数；在位置2-9处的错配被记为2.8，在切割位点10-11处的错配被记为1.2，并且在区域12-19处的错配被记为1.0。通过比较源自每个寡(核苷酸)的3个独特的种子衍生的六聚物的七聚物和八聚物的频率，进行额外的脱靶预测。使用来自位置2-7(相对于5’起始)的六聚物产生2个七聚物和一个八聚物。通过添加一个3’a至该六聚物产生“七聚物1”；通过添加一个5’a至该六聚物产生“七聚物2”；通过添加一个a至该六聚物的5’和3’末端两端产生八聚物。预计算了人3’utrome(定义为来自ncbi的refseq数据库的转录组的子序列，在编码区域的末端，清楚地定义了‘cds’)中的八聚物和七聚物的频率。使用来自八聚物频率的范围的中间值将该八聚体频率归一化至该七聚物频率。然后通过计算((3x归一化的八聚物计数)+(2x七聚物2计数)+(1x七聚物1计数))的和来计算‘mirseedscore’。两种sirna链被指定为根据计算分数的特异性分类：得分高于3为高特异性的、等于3为特异性的，并且在2.2与2.8之间为中等特异性的。通过该反义链的特异性进行分类。然后双螺旋选自人/cyno集，其中反义寡(核苷酸)缺乏mirna种子匹配、具有3或更好的分数、少于65％总gc含量、在第一位置处没有gc、在种子区域中的4个或更多个的u或a、以及第十九位置处的gc。还选择了来自人/cyno/小鼠集的双螺旋，其中反义寡(核苷酸)具有2或更好的分数、少于65％总gc含量、并且在第一位置处没有gc。sirna序列选择共计合成47个正义和47个反义衍生的来自人/cyno集的sirna寡(核苷酸)并形成双螺旋。共计合成15个正义和15个反义衍生的来自人/cyno/小鼠集的sirna并形成双螺旋。angptl3序列的合成在mermade192合成仪上以1亦或0.2μmol的规模合成angptl3序列。用2’o-甲基修饰合成单链，用于基于体外筛选的转染。为了用于自由摄取筛选测定，用2’f和2’-o-甲基化学修饰制造3’galnac共轭物。在这些设计中，galnac部分位于正义链的3’末端。该反义序列是23核苷酸的长度并且在3’末端还包含具有硫代磷酸酯键合的2’f和2’o甲基化学修饰。在21mer单链和双螺旋的一个集上，如以下详述的应用‘endolight’化学。●正义链中的全部嘧啶(胞嘧啶和尿苷)均用2＇-o-甲基核苷酸(2＇o-甲基c和2＇-o-甲基u)修饰。●在反义链中，与核糖a核苷相邻(指向5＇位置)的嘧啶被替换为它们的相应2-o-甲基核苷。●可以在正义序列和反义序列的3＇末端均可引入一个双碱基dtsdt延长物。对于galnac共轭的21mer正义和互补的23mer反义序列，合成2’f和2’o甲基修饰的单链。该合成对于正义链是在galnac修饰的cpg支持物上，并且对于反义链是在通用支持物修饰的cpg上，以1μmol规模进行的。应用称为toffee的序列基序，其中正义链在9、10和11位置处包含一个三核苷酸2’f-修饰基序，并且在反义链中，在11、12和13位置包括一个2’o甲基修饰基序。合成、切割和脱保护使用磷酰亚胺化学，使用固相支持物寡核苷酸合成法合成angptl3序列。对于21merendolight序列，使用脱氧胸苷cpg作为固相支持物，而对于galnac共轭物，使用galnac固相支持物用于正义链，并且使用通用cpg用于反义链。在96孔板中以1抑或0.2μm的规模进行以上序列的合成。酰亚胺溶液按0.1m浓度制备并且使用乙基硫代四唑(乙腈中的0.6m)作为活化剂。在96孔板中进行合成序列的切割与去保护，在第一步骤使用甲胺并且在第二步骤使用氟化物试剂。对于包含galnac和2’f核苷的序列，修改脱保护条件。使用丙酮∶乙醇(80∶20)混合物对切割和脱保护之后的序列进行沉淀并且将团块重悬浮在0.2m乙酸钠缓冲液中。将来自每一序列的样品通过lc-ms进行分析以证实一致性、uv用于定量并且选择的样品集，通过iex色谱来确定纯度。纯化，脱盐与退火沉淀angptl3序列并使用葡聚糖凝胶柱在akta纯化系统上(aktapurifiersystem)进行纯化。angptl3在环境温度下运行。样品注射与收集在96孔板(具有1.8ml深孔)中进行。在洗脱液中收集到对应于全长度序列的一个单一峰。将脱盐的angptl3序列针对浓度(通过在a260处的uv测量)以及纯度(通过离子交换hplc)进行分析。然后将这些互补单链以1：1化学计量比率进行组合以形成sirna双螺旋。实例2.体外筛选细胞培养和转染将hep3b细胞(atcc，manassas(马纳萨斯)，弗吉尼亚州)在37℃在5％co2的气氛中在rpmi(atcc)(补充有10％fbs，链霉素以及谷氨酰胺)中生长接近融合，然后通过胰酶消化从该板释放。转染通过以下进行：将14.8μl的opti-mem加每孔0.2μl的lipofectaminernaimax(invitrogen(英杰公司)，卡尔斯巴德ca.cat#13778-150)与每孔5μl的sirna双螺旋添加至96孔板并且在室温孵育15分钟。然后将包含约2x104hep3b细胞的无抗生素的80μl的完全培养基添加至该sirna混合物。在rna纯化之前，将细胞孵育24抑或120小时。除非另行说明，单剂量实验以10nm和0.1nm双螺旋终浓度进行，并且剂量反应实验以10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001、0.0005、0.0001、0.00005以及0.00001nm双螺旋终浓度进行。自由摄取转染在96孔板的每个孔中，将5μl的在pbs中的每种galnac共轭的sirna与重悬于95μl的体外grocp介质(invitrotechnologies-celsis(体外技术公司)，巴尔的摩，马里兰州)中的4x104新解冻的深冷保存的食蟹猴肝细胞合并。在37℃下在5％co2的气氛下将该混合物孵育约24hr。按500nm、100nm以及10nm的终浓度测试sirna用于功效自由摄取测定。对于剂量反应筛选，终sirna浓度是500nm、100nm、20nm、4nm、0.8nm、0.16nm、0.032nm以及0.0064nm。使用dynabeadsmrna分离试剂盒(invitrogen公司，部件#：610-12)的总rna分离收获细胞并且在150μl溶解/结合缓冲液中进行溶解，然后使用eppendorf(埃普多夫)恒温混匀仪在850rpm混合5分钟(混合速度在整个过程中相同)。将十微升磁珠与80μl溶解/结合缓冲液混合物添加至圆底板中并且混合1分钟。使用磁性表座捕获磁珠并且将该上清液除去而不扰动这些珠子。除去上清液后，将溶解的细胞添加至剩余珠子并且混合5分钟。除去上清液后，将磁珠用150μl清洗缓冲液a(washbuffera)洗涤2次并且混合1分钟。珠子再次被捕获并且除去上清液。然后将珠子用150μl的清洗缓冲液b(washbufferb)进行洗涤并且除去上清液。然后将珠子用150μl洗脱缓冲液(elutionbuffer)进行洗涤，捕获并且除去上清液。允许珠子干燥2分钟。干燥后，添加50μl的洗脱缓冲液并且在70℃混合5分钟。用磁体捕获珠子持续5分钟。去除40μl的上清液并且添加至另一96孔板中。使用abi高容量cdna逆转录试剂盒(appliedbiosystems(应用生物系统公司))，fostercity(福斯特城)，加利福尼亚州，cat#4368813)的cdna合成将母混合物(每一反应：2μl10×缓冲液、0.8μl25xdntp、2μl随机引物、1μl逆转录酶、1μlrnase抑制剂以及3.2μlh2o)添加至10μl总rna中。使用bio-radc-1000或s-1000热循环仪(hercules公司，ca)通过以下步骤产生cdna：25℃10min、37℃120min、85℃5sec、4℃保持。实时pcr将2μl的cdna添加至母混合物中，该母混合物在一个384孔50板(roche(罗氏公司)cat#04887301001)中每一孔包含0.5μlgapdhtaqman探针(appliedbiosystems(应用生物系统公司)cat#4326317e)、0.5μlangptltaqman探针(appliedbiosystems(应用生物系统公司)cat#hs00205581_m1)以及5μllightcycler480探针母混合物(roche(罗氏公司)cat#04887301001)。使用δδct(rq)测定法在abi7900ht实时pcr系统(appliedbiosystems(应用生物系统公司))中进行实时pcr。每种双螺旋以两次独立的转染测试，并且每次转染一式两份测定，除非在总结表中另外指出。为了计算相对倍数变化，使用δδct方法分析实时数据并且针对以下测定法归一化，所述测定法以采用10nmad-1955转染的细胞或模拟转染细胞进行。使用4参数拟合模型(使用xlfit)计算ic50，并且针对用ad-1955转染的细胞在相同的剂量范围归一化或针对其自身最低剂量归一化。用作阴性对照的ad-1955序列靶向荧光素酶并具有以下序列：正义：cuuacgcugaguacuucgadtsdt(seqidno：14)；反义：ucgaaguacucagcguaagdtsdt(seqidno：15)。生存力筛选在第3和6日在用10、1、0.5、0.1、0.05nmsirna转染后的hela细胞和hep3b细胞中测量细胞生存力。将细胞在96孔板中以每个孔中10,000个细胞的密度进行铺板。每一sirna以一式三份进行分析并且将数据平均化。靶向plk1与ad-19200的sirna被包括作为生存力损失的阳性对照，而ad-1955和模拟的转染细胞作为阴性对照。plk1和ad-19200导致生存力的剂量依赖性丧失。为测量生存力，将20ulcelltiter蓝(promega)在3日或6日后添加至96孔平板的每个孔，并且在37℃孵育2小时。然后在分光光度计(moleculardevices)中在560ex/590em读取平板。生存力表述为来自三次重复转染的光单位的平均值+/-标准偏差。通过首先将这三个重复转染进行平均化并且然后将模拟的转染细胞归一化，评估相对生存力。数据表示为％有生存力的细胞。表1：核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。将理解，在寡核苷酸中存在时这些单体是由5＇-3＇-磷酸二酯键相互连接。缩写核苷酸a腺苷c胞苷g鸟苷t胸苷u尿苷n任何核苷酸(g、a、c、t或u)a2＇-o-甲基腺苷c2＇-o-甲基胞苷g2＇-o-甲基鸟苷u2＇-o-甲基尿苷dt2＇-脱氧胸苷s硫代磷酸酯键表4.使用angptl3dsrna序列的单剂量筛选的结果这些实验是使用表3中所列出的修饰的寡核苷酸双螺旋进行的。ad-15838.2的序列与ad-15838.1的序列相同。sirna双螺旋的递送是使用lnp进行的。表5.针对angptl3dsrna序列的剂量反应筛选结果这些实验是使用表3中所列出的修饰的寡核苷酸双螺旋进行的。ad-15838.2的序列与ad-15838.1的序列相同。表12.针对angptl3galnac共轭的dsrna序列的剂量反应筛选结果在pch细胞中，通过自由摄取对来自单剂量筛选(指表11中的数据)的活性sirna的亚群在剂量反应实验中进行测试。在hep3b细胞中，还通过转染对这些活性sirna的亚群的剂量反应进行测试。表13.使用表10中所列出的序列的单剂量筛选的结果表14.使用来自表13的序列的亚群的剂量反应筛选的结果在hep3b细胞中，通过转染对来自表10的活性angptl3sirna的一个亚群在剂量反应筛选中进行测试。表15.针对双螺旋对的id对非共轭的和galnac共轭的形式都进行了合成和测试。这些双螺旋具有相同的序列和修饰模式。体内实验实例3.测试物品使用本发明的dsrna序列进行体内实验。在这些实验中使用的dsrna序列是galnac共轭的ad-52981(“ang”，正义序列：afcafuafuufugfafufcafgufcufuufuufl96(seqidno：657)；反义序列：aafaafagfacfugfaucafaafuafugfusufsg(seqidno：842))。用作阴性对照的dsrna序列是荧光素酶共轭的ad-48399b1(“luc”，正义序列：cfacfuufacfgcfugfagfuafcufucfgafl96(seqidno：1728)，反义序列：ucfgafagfuafcufcafgcfgufaafgufgsafsu(seqidno：1729))。也用作阴性对照的是包含交替的2’-甲基和2’氟修饰的galnal共轭的ad-1955。实验程序在c57bl/6(野生型)和ob/ob小鼠中测试这些dsrna序列。野生型小鼠接受每天五次剂量的在pbs的dsrna，luc，按20mg/kg，或ang，按5或20mg/kg；并且ob/ob小鼠接受每天五次剂量的按20mg/kg的用luc配制的或按20mg/kg的用ang配制的npl。根据图1中所示的程序通过皮下注射给予所有测试物品。确切地，这些测试物品的每天五次的剂量是在五个连续日(第0天、第1天、第2天、第3天、第4天)给予的，并且在给予之前5天、3天或1天连同给予后第0、1、2、3、4、7、9、11、15、18、21、25、30、37、45和50天收集血样。使用收集的血样使用elisa测定来测量angptl3蛋白的表达。还使用olympus分析仪测量了血清甘油三酸酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldlc)、高密度脂蛋白胆固醇(hdlc)以及总胆固醇(tc)的水平。结果在图2，小图a中所示的是在野生型小鼠中所测量的鼠类angptl3(mangptl3)蛋白在给予对照或按5或20mg/kg的ang之后的水平。还在图2，小图b中所示的是在ob/ob小鼠中所测量的mangptl3蛋白在给予对照或按20mg/kg的ang之后的水平。数据表明对于野生型和ob/ob小鼠两者，在与对照相比较时，给予ang导致mangptl3蛋白水平的降低。在图3，小图a中所示的是在野生型小鼠中所测量的ldl-c在给予对照或按20mg/kg的ang之后的水平。在图3，小图b中所示的是在ob/ob小鼠中所测量的ldl-c在给予对照或按20mg/kg的ang之后的水平。数据表明在与对照相比较时，给予ang导致ldl-c水平的降低，特别是在ob/ob小鼠中。在图4，小图a中所示的是在野生型小鼠中所测量的甘油三酸酯在给予对照或按20mg/kg的ang之后的水平。在图4，小图b中所示的是在ob/ob小鼠中所测量的甘油三酸酯在给予对照或按20mg/kg的ang之后的水平。该数据表明在与对照相比较时，给予ang导致甘油三酸酯水平的降低，特别是在ob/ob小鼠中。在图5，小图a和b中所示的分别是在野生型和ob/ob小鼠中所测量的总胆固醇(tc)在给予对照或按20mg/kg的ang之后的水平。该数据表明给予ang导致在ob/ob小鼠中tc水平的中等程度的降低，但在野生型小鼠中没有降低。类似地，如图6中的图表中所示的，给予ang导致在ob/ob小鼠中hdl-c水平的中等程度的降低，但在野生型小鼠中没有降低。实例4.测试物品测试本发明的dsrna序列的单一注射液对angptl3蛋白水平的影响。在这些实验中使用的dsrna序列是galnac共轭的ad-52981(“ang”，正义序列：afcafuafuufugfafufcafgufcufuufuufl96(seqidno：657)；反义序列：aafaafagfacfugfaucafaafuafugfusufsg(seqidno：842))。将pbs用作阴性对照。实验程序在人pcs转基因小鼠中测试dsrna序列，该小鼠的特征为全长人pcsk9基因的肝脏特异性表达。使用单一的皮下注射将ad-52981或pbs给予人pcs转基因小鼠。将该小鼠分为四个组，每个组由两只雄性和两只雌性组成。每个组接受一种pbs注射液或5mg/kg、20mg/kg或60mg/kg剂量的ad-52981。在给药前1天和0天以及在给药后72小时收集血样。通过elisa测量angptl3蛋白水平并与给药前1天和0天的水平相比较。结果在图7中所示的是在人pcs转基因小鼠中所测量的鼠类angptl3蛋白(mangptl3)的水平。相对于pbs对照来表示所显示的数据并代表每组中2只雄性和2只雌性的平均值。误差条代表标准差。数据表明给予ad-52981的一种单一注射液减少了angptl3蛋白在小鼠中的水平，以一种剂量依赖性的方式，用60mg/kg的剂量将angptl3蛋白的水平降低了超过五倍(参见图7)。序列seqidno：1＞gi|41327750|ref|nm_014495.2|智人血管生成素样3(angptl3)，mrnattccagaagaaaacagttccacgttgcttgaaattgaaaatcaagataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgatcaagacaattcatcatttgattctctatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgtaaaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagacgaagggccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcgctgcaaaccagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaaaatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaaaaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaacctgaaactccagaacacccagaagtaacttcacttaaaacttttgtagaaaaacaagataatagcatcaaagaccttctccagaccgtggaagaccaatataaacaattaaaccaacagcatagtcaaataaaagaaatagaaaatcagctcagaaggactagtattcaagaacccacagaaatttctctatcttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagttgaatgaaataagaaatgtaaaacatgatggcattcctgctgaatgtaccaccatttataacagaggtgaacatacaagtggcatgtatgccatcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttatatcaggtagtccatggacattaattcaacatcgaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggttttgggaggcttgatggagaattttggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaattatgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgggaaatcacgaaaccaactatacgctacatctagttgcgattactggcaatgtccccaatgcaatcccggaaaacaaagatttggtgttttctacttgggatcacaaagcaaaaggacacttcaactgtccagagggttattcaggaggctggtggtggcatgatgagtgtggagaaaacaacctaaatggtaaatataacaaaccaagagcaaaatctaagccagagaggagaagaggattatcttggaagtctcaaaatggaaggttatactctataaaatcaaccaaaatgttgatccatccaacagattcagaaagctttgaatgaactgaggcaaatttaaaaggcaataatttaaacattaacctcattccaagttaatgtggtctaataatctggtattaaatccttaagagaaagcttgagaaatagattttttttatcttaaagtcactgtctatttaagattaaacatacaatcacataaccttaaagaataccgtttacatttctcaatcaaaattcttataatactatttgttttaaattttgtgatgtgggaatcaattttagatggtcacaatctagattataatcaataggtgaacttattaaataacttttctaaataaaaaatttagagacttttattttaaaaggcatcatatgagctaatatcacaactttcccagtttaaaaaactagtactcttgttaaaactctaaacttgactaaatacagaggactggtaattgtacagttcttaaatgttgtagtattaatttcaaaactaaaaatcgtcagcacagagtatgtgtaaaaatctgtaatacaaatttttaaactgatgcttcattttgctacaaaataatttggagtaaatgtttgatatgatttatttatgaaacctaatgaagcagaattaaatactgtattaaaataagttcgctgtctttaaacaaatggagatgactactaagtcacattgactttaacatgaggtatcactataccttattseqidno：2＞gi|297278846|ref|xm_001086114.2|预测的：猕猴血管生成素样3(angptl3)，mrnaatatatagagttaagaagtctaggtctgcttccagaagaacacagttccacgttgcttgaaattgaaaatcaggataaaaatgttcacaattaagctccttctttttattgttcctctagttatttcctccagaattgaccaagacaattcatcatttgattctgtatctccagagccaaaatcaagatttgctatgttagacgatgtaaaaattttagccaatggcctccttcagttgggacatggtcttaaagactttgtccataagactaagggccaaattaatgacatatttcaaaaactcaacatatttgatcagtctttttatgatctatcactgcaaaccagtgaaatcaaagaagaagaaaaggaactgagaagaactacatataaactacaagtcaaaaatgaagaggtaaagaatatgtcacttgaactcaactcaaaacttgaaagcctcctagaagaaaaaattctacttcaacaaaaagtgaaatatttagaagagcaactaactaacttaattcaaaatcaacctgaaactccagaacatccagaagtaacttcacttaaaagttttgtagaaaaacaagataatagcatcaaagaccttctccagactgtggaagaacaatataagcaattaaaccaacagcacagtcaaataaaagaaatagaaaatcagctcagaatgactaatattcaagaacccacagaaatttctctatcttccaagccaagagcaccaagaactactccctttcttcagctgaatgaaataagaaatgtaaaacatgatggcattcctgctgattgtaccaccatttacaatagaggtgaacatataagtggcatgtatgccatcagacccagcaactctcaagtttttcatgtctactgtgatgttgtatcaggtaaaacctgtctaaggagaatagatggatcacaaaacttcaatgaaacgtgggagaactacaaatatggtttcgggaggcttgatggagaattctggttgggcctagagaagatatactccatagtgaagcaatctaattacgttttacgaattgagttggaagactggaaagacaacaaacattatattgaatattctttttacttgggaaatcacgaaaccaactatacgct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