本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及苯丙氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的苯丙氨酸操纵子以及它们的应用。
背景技术：
：l-苯丙氨酸(l-phenylalanine)是人和动物的8种必需氨基酸之一，主要用于高甜度低热量的新型甜味剂阿斯巴甜的原料，还广泛应用于食品、饲料添加剂以及医药等领域。目前国内外工业化生产l-苯丙氨酸的主要方法是微生物发酵法。此外，l-苯丙氨酸还可以通过微生物代谢途径进一步衍生合成d-苯丙氨酸、苯丙酮酸、扁桃酸、乙酸苯酯、苯基乙醇、苯乙胺、苯乙烯和肉桂酸等重要应用价值的化合物。然而，微生物中l-苯丙氨酸的合成途径及调控方式较复杂，是高效发酵生产l-苯丙氨酸及其衍生物的关键限制因素。微生物合成氨基酸(如l-组氨酸、l-苏氨酸、l-苯丙氨酸、l-亮氨酸、l-异亮氨酸和l-色氨酸等)的操纵子基因的转录表达存在衰减调节机制。当胞内特定氨基酸浓度较高时，氨基酸操纵子的转录提前终止。相反地，当胞内特定氨基酸缺乏时，rna聚合酶转录氨基酸操纵子。微生物发酵生产l-苯丙氨酸或其衍生物的过程中，胞内l-苯丙氨酸逐步积累，通过上述衰减调控机制反馈阻遏苯丙氨酸操纵子的表达，不利于l-苯丙氨酸或其衍生物的生物合成。因此，为了构建高效生产苯丙氨酸或其衍生物的工程菌，亟需开发苯丙氨酸衰减子改造的方法，以提高苯丙氨酸操纵子表达水平和苯丙氨酸产量。技术实现要素：本发明的目的是提供苯丙氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的苯丙氨酸操纵子以及它们的应用。本发明首先保护dna分子甲(苯丙氨酸衰减子突变体)，为如下(a1)、(a2)、(a3)、(a4)或(a5)：(a1)序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示的dna分子；n1为105以上118以下的自然数(n1优选为117)，n2为123以上176以下的自然数(n2具体可为123以上146以下的自然数或147以上176以下的自然数，更具体可为123、146或176)；(a2)将苯丙氨酸衰减子的第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子，n3为104以上117以下的自然数(n3优选为116)；(a3)将苯丙氨酸衰减子相关序列的第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子，n3为104以上117以下的自然数(n3优选为116)；(a4)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接标签序列得到的dna分子；(a5)在(a1)或(a2)或(a3)的末端连接连接序列得到的dna分子。苯丙氨酸衰减子突变体为苯丙氨酸衰减子截短体或苯丙氨酸衰减子变体。苯丙氨酸衰减子截短体如序列表的序列2第n1-123位核苷酸所示。苯丙氨酸衰减子变体如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4为124以上176以下的自然数(n4具体可为124以上146以下的自然数或147以上176以下的自然数，更具体可为146或176)。本发明还保护所述dna分子甲在促进下游目的基因表达中的应用。所述应用中，所述dna分子甲作为调控元件。所述应用中，所述dna分子甲位于所述目的基因的启动子和所述目的基因的起始密码子之间。所述应用中，所述启动子具体可为序列表的1所示的启动子pthr-trc。所述应用中，所述目的基因具体可为序列表的序列3所示的gfp基因。本发明还保护dna分子乙，自上游至下游依次包括：所述dna分子甲和目的基因。所述目的基因具体可为序列表的序列3所示的gfp基因。本发明还保护dna分子丙，自上游至下游依次包括：启动子、所述dna分子甲、目的基因和终止子。所述启动子具体可为序列表的1所示的启动子pthr-trc。所述目的基因具体可为序列表的序列3所示的gfp基因。所述终止子具体可为“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。所述dna分子甲或所述dna分子乙或所述dna分子丙中，不具有苯丙氨酸衰减子第1至n3位核苷酸，n3为104以上117以下的自然数(n3优选为116)。所述dna分子乙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列2第117至176位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因所述dna分子丙自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第117至176位核苷酸，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。本发明还保护dna分子丁(解除衰减调控的苯丙氨酸操纵子基因，又称苯丙氨酸操纵子基因突变体)，是将苯丙氨酸操纵子基因中的苯丙氨酸衰减子第1至n3位核苷酸去除后得到的dna分子；n3为104以上117以下的自然数(n3优选为116)。本发明还保护dna分子戊，是将苯丙氨酸操纵子基因进行如下两个改造后得到的dna分子：(1)将苯丙氨酸衰减子第1至n3位核苷酸去除；n3为104以上117以下的自然数(n3优选为116)；(2)将编码分支酸变位酶-预苯酸脱水酶双功能酶的基因从编码野生蛋白的基因突变为编码解除了反馈阻遏的突变蛋白的基因。所述解除了反馈阻遏的突变蛋白具体可为phea*蛋白。所述野生蛋白具体可为phea蛋白。所述dna分子戊具体可为序列表的序列2第117至1307位核苷酸所示的dna分子。所述dna分子戊具体可为序列表的序列2第117至1413位核苷酸所示的dna分子。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重组载体也属于本发明的保护范围。含有所述dna分子丁或所述dna分子戊的重组菌也属于本发明的保护范围。所述重组菌可为将所述dna分子丁或所述dna分子戊导入出发菌进行过表达得到的重组菌。所述出发菌为埃希氏菌属细菌或棒杆菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，例如大肠杆菌k-12或其衍生菌株。所述棒杆菌属细菌具体可为谷氨酸棒杆菌，例如谷氨酸棒杆菌13032。所述出发菌可为将编码3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(arof蛋白)的基因导入初始菌得到的重组菌。所述初始菌为埃希氏菌属细菌或棒杆菌属细菌。所述埃希氏菌属细菌具体可为大肠杆菌，例如大肠杆菌k-12或其衍生菌株。所述棒杆菌属细菌具体可为谷氨酸棒杆菌，例如谷氨酸棒杆菌13032。编码arof蛋白的基因也可与所述dna分子丁一起导入所述出发菌。编码arof蛋白的基因也可与所述dna分子戊一起导入所述出发菌。arof蛋白为如下(b1)或(b2)：(b1)由序列表中序列8所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b2)将序列8的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶功能的由序列8衍生的蛋白质。编码arof蛋白的基因的开放阅读框可如序列表的序列7中第195至1265位核苷酸所示。编码arof蛋白的基因可如序列表的序列7所示。本发明还保护以上任一所述重组菌在制备苯丙氨酸中的应用。应用所述重组菌生产苯丙氨酸时，采用发酵培养基培养所述重组菌。所述发酵培养基可以是丰富培养基，也可以是无机盐培养基。培养基包含碳源、氮源、无机离子、抗生素和其它的营养因子。作为碳源，可以使用葡萄糖、乳糖、半乳糖等糖类；也可以是甘油、甘露醇等醇类；也可以使用葡萄糖酸、柠檬酸、丁二酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨水、硫酸铵、磷酸铵、氯化铵等无机氮源；也可以使用玉米浆、豆粕水解液、毛发粉、酵母提取物、蛋白胨等有机氮源。无机离子包含铁、钙、镁、锰、钼、钴、铜、钾等离子中的一种或多种。其它营养因子还包括生物素、维生素b1、吡哆醛等维生素。所述发酵培养基中的碳源为葡萄糖。所述发酵培养基具体可为：葡萄糖20.0g/l、硫酸铵15.0g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、七水硫酸镁2.0g/l、酵母粉2.0g/l、碳酸钙15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量为水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量为水。所述培养的条件具体可为：37℃、220rpm震荡培养36h。所述培养的条件具体可为：将种子液以3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养36h。种子液的制备方法如下：将重组菌接种至液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h，得到种子液。所述种子液的od600nm值具体可为5.0。所述培养的过程中进行如下过程控制：培养过程中，用氨水调节反应体系的ph值使其维持在6.8-7.0；培养过程中，每隔3-4h取样一次，检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/l时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/l。本发明还保护一种提高微生物生产苯丙氨酸的能力的方法，包括如下步骤：删除微生物的苯丙氨酸操纵子基因中从苯丙氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸；n3为104以上117以下的自然数(n3优选为116)。所述微生物为具有苯丙氨酸操纵子的微生物。所述微生物具体可为埃希氏菌属微生物。所述埃希氏菌属微生物具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌k-12或其衍生菌株。本发明还保护一种解除微生物中苯丙氨酸操纵子反馈阻遏的方法，包括如下步骤：删除微生物的苯丙氨酸操纵子基因中从苯丙氨酸衰减子第1位开始计数的第1至n3位核苷酸；n3为104以上117以下的自然数(n3优选为116)。所述微生物为具有苯丙氨酸操纵子的微生物。所述微生物具体可为埃希氏菌属微生物。所述埃希氏菌属微生物具体可为大肠杆菌，更具体可为大肠杆菌k-12或其衍生菌株。以上任一所述苯丙氨酸操纵子基因包括苯丙氨酸衰减子和编码分支酸变位酶-预苯酸脱水酶双功能酶(phea*蛋白或phea蛋白)的基因。phea*蛋白为如下(c1)或(c2)：(c1)由序列表中序列6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(c2)将序列6的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有分支酸变位酶-预苯酸脱水酶双功能酶功能的由序列6衍生的蛋白质。phea蛋白为如下(d1)或(d2)：(d1)由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(d2)将序列5的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有分支酸变位酶-预苯酸脱水酶双功能酶功能的由序列5衍生的蛋白质。所述苯丙氨酸衰减子具体如序列表的序列2第1至123位核苷酸所示。所述苯丙氨酸衰减子相关序列具体如序列表的序列2第1至176位核苷酸所示。编码phea*蛋白的基因具体如序列表的序列2第147至1307位核苷酸所示。所述苯丙氨酸操纵子基因具体如序列表的序列2第1至1307位核苷酸所示。所述苯丙氨酸操纵子基因具体如序列表的序列2第1至1413位核苷酸所示。以上任一所述苯丙氨酸具体可为l-苯丙氨酸。本发明公开了一种改造苯丙氨酸衰减子的方法，该方法为删除衰减子中编码前导肽的基因phel和终止子茎环结构中前段反向互补回文序列，而保留了终止子后段反向互补回文序列。本发明的发明人通过去除苯丙氨酸衰减子的特定序列，意外的获得了可以显著提高基因表达水平的苯丙氨酸衰减子突变体。显而易见，根据本发明的试验结果，本领域技术人员可轻易推论得到，去除上述衰减子的终止子茎环结构中前段反向互补回文序列的部分序列，在一定程度上破坏终止子二级互补结构，同样可能得到相似性能的苯丙氨酸衰减子突变体和苯丙氨酸操纵子突变体。因此，这种类似的改造苯丙氨酸衰减子的方法也在本发明的保护范围之中。显而易见，本发明解除大肠杆菌的苯丙氨酸衰减子的方法，同样可应用于其它菌属的苯丙氨酸衰减子。本发明还公开了一种解除衰减调控的苯丙氨酸操纵子基因，具体为去除编码前导肽的基因phel和终止子茎环结构中前段反向互补回文序列、而保留终止子后段反向互补回文序列的苯丙氨酸操纵子基因。应用本发明提供的苯丙氨酸衰减子改造方法，显著提高了工程菌的苯丙氨酸发酵性能。本发明在实践上可用于细菌发酵生产苯丙氨酸。显而易见，本发明还可用于苯丙氨酸代谢途径下游化合物如d-苯丙氨酸、苯丙酮酸、扁桃酸、乙酸苯酯、苯基乙醇、苯乙胺、苯乙烯和肉桂酸等的生物合成。除了改造染色体上原位的苯丙氨酸操纵子基因之外，作为基因过表达的其它方法，如在染色体上整合≥1拷贝的上述解除衰减调控的苯丙氨酸操纵子基因同样在本专利的保护范围之内；此外，通过质粒过表达上述解除衰减调控的苯丙氨酸操纵子基因同样也在本专利的保护范围之内。应用本发明提供的苯丙氨酸衰减子改造方法，显著提高了苯丙氨酸操纵子或其它基因的表达水平，从而提高工程菌的苯丙氨酸及其衍生物的发酵性能。本发明获得高效解除反馈阻遏的核酸序列，构建了高效生产苯丙氨酸的菌株，为改进苯丙氨酸发酵生产提供了新方法。采用本发明提供的方案，可以显著提高苯丙氨酸及其衍生物产量，对于苯丙氨酸及其衍生物的生产领域具有极其重大的应用推广价值。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中如未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段和市售的常用仪器、试剂，可参见《分子克隆实验指南(第3版)》(科学出版社)、《微生物学实验(第4版)》(高等教育出版社)以及相应仪器和试剂的厂商说明书等参考。atcc：https://www.atcc.org/。大肠杆菌k12mg1655：atcc编号为700926。pacyc184质粒：neb公司，产品目录号e4152s。pgfpuv载体：clontechlaboratories,inc.，catalogno.632312。大肠杆菌ec135：记载于如下文献：zhangetal,plosgenetics，2012,8(9):e1002987。实施例1、衰减子突变体调控gfp基因的表达一、构建重组质粒pacyc184-pthr-trc1、合成序列表的序列1所示的双链dna分子(启动子pthr-trc)。2、以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy1947和wy1948组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。wy1947：ctagtctagagcttttcattctgactgcaac；wy1948：cccaagcttacattatacgagccggatgattaattgtcaactgtctgtgcgctatgcct。3、取步骤2得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶xbai和hindiii进行双酶切，回收酶切产物。4、取pacyc184质粒，用限制性内切酶xbai和hindiii进行双酶切，回收载体骨架(约4.1kb)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc。二、构建各个重组质粒1、构建重组菌gfp3248(1)以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3248和wy3258组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以pgfpuv载体为模板，采用wy3105和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；将pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a2混合后作为模板，采用wy3248和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3。wy3248：cccaagcttagtcacttaaggaaacaaacatga；wy3258：agttcttctcctttactcatagaaccagaaccagaacccagcgccagtaacgggttttc；wy3105：ggttctggttctggttctatgagtaaaggagaagaacttttca；wy1859：acatgcatgccaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttatttgtagagctcatccatgcca。(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物a3，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收酶切产物。(3)取重组质粒pacyc184-pthr-trc，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收载体骨架。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌ec135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3248。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3248进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和sphi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，rbs序列“agtcacttaaggaaacaaac”，序列表的序列2第1至176位核苷酸(包含完整的苯丙氨酸衰减子和phea基因的开放阅读框中编码前10个氨基酸残基的序列)，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3248的大肠杆菌ec135命名为重组菌gfp3248。2、构建重组菌gfp3250(1)以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3250和wy3258组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以pgfpuv载体为模板，采用wy3105和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；将pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a2混合后作为模板，采用wy3250和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3。wy3250：cccaagcttcttttttattgataacaaaaaggcaacact。(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物a3，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收酶切产物。(3)取重组质粒pacyc184-pthr-trc，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收载体骨架。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌ec135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3250。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3250进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和sphi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第117至176位核苷酸(包括苯丙氨酸衰减子截短体和phea基因的开放阅读框中编码前10个氨基酸残基的序列)，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3250的大肠杆菌ec135命名为重组菌gfp3250。3、构建重组菌gfp3251(1)以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3251和wy3258组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以pgfpuv载体为模板，采用wy3105和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；将pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a2混合后作为模板，采用wy3251和wy1859组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3。wy3251：cccaagcttgataacaaaaaggcaacactatga。(2)取步骤(1)得到的pcr扩增产物a3，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收酶切产物。(3)取重组质粒pacyc184-pthr-trc，用限制性内切酶hindiii和sphi双酶切，回收载体骨架。(4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3)的载体骨架连接，化转至大肠杆菌ec135，并从转化子中提取质粒，得到重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3251。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3251进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和sphi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的1所示的启动子pthr-trc，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第127至176位核苷酸(包含phea基因的开放阅读框中编码前10个氨基酸残基的序列，且完全去除了苯丙氨酸衰减子)，连接序列“ggttctggttctggttct”，序列表的序列3所示的gfp基因，终止子序列“ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttg”。含有重组质粒pacyc184-pthr-trc-phela-gfp3251的大肠杆菌ec135命名为重组菌gfp3251。4、构建gfp对照将重组质粒pacyc184-pthr-trc导入大肠杆菌ec135，得到的重组菌命名为gfp对照。三、gfp荧光强度分析试验菌株为：重组菌gfp3248、重组菌gfp3250或重组菌gfp3251。设置gfp对照作为对照菌株。1、将试验菌株或对照菌株接种至含34mg/l氯霉素的液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。2、取步骤1得到的菌液，按照1％接种量接种于含34mg/l氯霉素的液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养12小时。3、取150μl步骤2得到的菌液，加入黑边透底的96孔板中，使用高通量多功能酶标仪(infinite200pro型，瑞士tecan)同时检测细胞密度和gfp荧光信号。检测细胞密度的相关参数设置见表1。检测gfp荧光信号的相关参数设置见表2。表1吸光度(absorbance)波长(wavelength)600nm带宽(bandwidth)9nm闪光次数(numberofflashes)25建立时间(settletime)0ms表2荧光顶读(fluorescencetopreading)激发波长(excitationwavelength)400nm发射波长(emissionwavelength)510nm激发带宽(excitationbandwidth)9nm发射带宽(emissionbandwidth)20nm收集(gain)100(手动，manual)闪光次数(numberofflashes)15积分时间(integrationtime)20μs滞后时间(lagtime)0μs建立时间(settletime)0msz位置(z-position)20000μm(手动，manual)各个试验菌株的荧光强度值＝实测荧光值÷细胞密度-对照菌株的实测荧光值÷对照菌株的细胞密度。设置三次重复试验，相应的平均值和标准差结果见表3。与重组菌gfp3248(完全保留苯丙氨酸衰减子)相比，重组菌gfp3250的荧光强度提高了5.2倍。与重组菌gfp3251(完全去除苯丙氨酸衰减子)相比，重组菌gfp3250的荧光强度提高了3.7倍。结果表明，位于启动子和目的基因之间的苯丙氨酸衰减子截短体可以作为调控元件，促进目的基因的表达。苯丙氨酸衰减子突变体如序列表的序列2第n1-n2位核苷酸所示，n1为105以上118以下的自然数(n1优选为117)，n2为123以上176以下的自然数(n2具体可为123以上146以下的自然数或147以上176以下的自然数，更具体可为123、146或176)。苯丙氨酸衰减子突变体包括苯丙氨酸衰减子截短体和苯丙氨酸衰减子变体(全称为在苯丙氨酸衰减子截短体下游连接其他核苷酸的变体)。苯丙氨酸衰减子截短体如序列表的序列2第n1-123位核苷酸所示。苯丙氨酸衰减子变体如序列表的序列2第n1-n4位核苷酸所示，n4为124以上176以下的自然数(n4具体可为124以上146以下的自然数或147以上176以下的自然数，更具体可为146或176)。表3荧光强度重组菌gfp3248770.4±65.2重组菌gfp32504778.4±463.2重组菌gfp32511010.9±128.6实施例2、制备苯丙氨酸一、构建重组质粒pacyc184-pjj1、合成序列表的序列4所示的双链dna分子(启动子pjj)。2、以步骤1制备的双链dna分子为模板，采用wy843和wy842组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。wy843：tgctctagacaattccgacgtctaagaaa；wy842：cccaagcttggtcagtgcgtcctgctgat。3、取步骤2得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶xbai和hindiii进行双酶切，回收酶切产物。4、取pacyc184质粒，用限制性内切酶xbai和hindiii进行双酶切，回收载体骨架(约4.1kb)。5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pacyc184-pjj。二、三个重组质粒的构建1、以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3248和wy4020组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a1；以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3250和wy4020组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a2；以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy3251和wy4020组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a3；以大肠杆菌k12mg1655的基因组dna为模板，采用wy4021和wy4022组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物a4。wy3248：cccaagcttagtcacttaaggaaacaaacatga；wy3250：cccaagcttcttttttattgataacaaaaaggcaacact；wy3251：cccaagcttgataacaaaaaggcaacactatga；wy4020：cttcaaccagcgcacaggcttgttgccc；wy4021：gggcaacaagcctgtgcgctggttgaagwy4022：cgcggatcccgcacagcgttttcagagtwy4020和wy4021用于在编码分支酸变位酶-预苯酸脱水酶双功能酶的基因中引入一个点突变(该点突变对应序列表的序列2第1071位核苷酸，为g→t的突变)。将大肠杆菌k12mg1655的基因组中引入上述点突变前的相应基因编码的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶双功能酶命名为phea蛋白(如序列表的序列5所示)。将引入上述点突变后的相应基因编码的分支酸变位酶-预苯酸脱水酶双功能酶命名为phea*蛋白(如序列表的序列6所示)。与phea蛋白相比，phea*蛋白的差异仅在于将phea蛋白第309位氨基酸残基由甘氨酸突变为了半胱氨酸，从而解除了反馈阻遏。2、将步骤1得到的pcr扩增产物a1和pcr扩增产物a4混合后作为模板，采用wy3248和wy4022组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物b1；将步骤1得到的pcr扩增产物a2和pcr扩增产物a4混合后作为模板，采用wy3250和wy4022组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物b2；将步骤1得到的pcr扩增产物a3和pcr扩增产物a4混合后作为模板，采用wy3251和wy4022组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物b3。3、取重组质粒pacyc184-pjj，用限制性内切酶hindiii和bamhi双酶切，回收载体骨架。4、取步骤2得到的pcr扩增产物b1，用限制性内切酶hindiii和bamhi双酶切，回收酶切产物。5、将步骤3的载体骨架和步骤4的酶切产物连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-phel3248a*。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-phel3248a*进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和bamhi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列4所示的启动子pjj，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，rbs序列“agtcacttaaggaaacaaac”，序列表的序列2所示的dna分子。6、取步骤2得到的pcr扩增产物b2，用限制性内切酶hindiii和bamhi双酶切，回收酶切产物。7、将步骤3的载体骨架和步骤6的酶切产物连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-phel3250a*。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-phel3250a*进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和bamhi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列4所示的启动子pjj，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第117至1413位核苷酸所示的dna分子。8、取步骤2得到的pcr扩增产物b3，用限制性内切酶hindiii和bamhi双酶切，回收酶切产物。9、将步骤3的载体骨架和步骤8的酶切产物连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-phel3251a*。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-phel3251a*进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和bamhi酶切位点之间插入了特异dna分子；特异dna分子自上游至下游依次由如下元件组成：序列表的序列4所示的启动子pjj，限制性内切酶hindiii的酶切识别序列，序列表的序列2第127至1413位核苷酸所示的dna分子。三、构建三个重组质粒1、以大肠杆菌k12mg1655的基因组为模板，采用wy4023和wy4024组成的引物对进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。wy4023：acatgcatgccaaagcatagcggattgttttcwy4024：cgcggatccttaagccacgcgagccgtca经测序，pcr扩增产物中，sphi和bamhi酶切位点之间的核苷酸序列如序列表的序列7所示，编码序列表的序列8所示的蛋白质。序列8所示的蛋白质为3-脱氧-d-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶(arof蛋白)。序列表的序列7中，开放阅读框为第195至1265位核苷酸。2、取步骤1得到的pcr扩增产物，用限制性内切酶sphi和bamhi双酶切，回收酶切产物。3、取重组质粒pacyc184-pjj-phel3248a*，用限制性内切酶sphi和bamhi双酶切，回收载体骨架。4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-phel3248a*-arof。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-phel3248a*-arof进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和bamhi酶切位点之间插入了步骤二的5中所述的特异dna分子，在sphi和bamhi酶切位点之间插入了序列表的序列7所示的arof基因(重组质粒中，特异dna分子与arof基因反向存在)。5、取重组质粒pacyc184-pjj-phel3250a*，用限制性内切酶sphi和bamhi双酶切，回收载体骨架。6、将步骤2的酶切产物和步骤5的载体骨架连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-phel3250a*-arof。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-phel3250a*-arof进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和bamhi酶切位点之间插入了步骤二的7中所述的特异dna分子，在sphi和bamhi酶切位点之间插入了序列表的序列7所示的arof基因(重组质粒中，特异dna分子与arof基因反向存在)。7、取重组质粒pacyc184-pjj-phel3251a*，用限制性内切酶sphi和bamhi双酶切，回收载体骨架。8、将步骤2的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒pacyc184-pjj-phel3251a*-arof。根据测序结果，对重组质粒pacyc184-pjj-phel3251a*-arof进行结构描述如下：在pacyc184质粒的xbai和bamhi酶切位点之间插入了步骤二的9中所述的特异dna分子，在sphi和bamhi酶切位点之间插入了序列表的序列7所示的arof基因(重组质粒中，特异dna分子与arof基因反向存在)。四、构建重组菌将重组质粒pacyc184-pjj-phel3248a*-arof导入大肠杆菌k12mg1655，得到重组菌，将其命名为工程菌phe3248。将重组质粒pacyc184-pjj-phel3250a*-arof导入大肠杆菌k12mg1655，得到重组菌，将其命名为工程菌phe3250。将重组质粒pacyc184-pjj-phel3251a*-arof导入大肠杆菌k12mg1655，得到重组菌，将其命名为工程菌phe3251。三、苯丙氨酸工程菌的摇瓶发酵试验试验菌株为：工程菌phe3248、工程菌phe3250或工程菌phe3251。1、取试验菌株，划线接种于固体lb培养基平板，37℃静置培养12小时。2、完成步骤1后，挑取平板上的菌苔，接种至液体lb培养基中，37℃、220rpm振荡培养8h，得到种子液(od600nm值＝5.0)。3、完成步骤2后，将种子液按照3％的接种量接种至发酵培养基中，37℃、220rpm震荡培养。发酵培养基：葡萄糖20.0g/l、硫酸铵15.0g/l、磷酸二氢钾2.0g/l、七水硫酸镁2.0g/l、酵母粉2.0g/l、碳酸钙15.0g/l、微量元素混合液5ml/l，余量为水。微量元素混合液：feso4·7h2o10g/l、cacl21.35g/l、znso4·7h2o2.25g/l、mnso4·4h2o0.5g/l、cuso4·5h2o1g/l、(nh4)6mo7o24·4h2o0.106g/l、na2b4o7·10h2o0.23g/l、cocl2·6h2o0.48g/l、35％hcl10ml/l，余量为水。培养过程中，用氨水调节反应体系的ph值使其维持在6.8-7.0。培养过程中，每隔3-4h取样一次，使用生物传感分析仪sba-40d检测葡萄糖含量，当体系中的葡萄糖含量低于5g/l时，补加葡萄糖并使体系中的葡萄糖浓度达到10g/l。培养36h后取样，12000g离心2分钟，取上清液(即发酵上清)，检测l-苯丙氨酸浓度。结果见表4(三次重复试验的平均值±标准差)。与工程菌phe3248以及工程菌phe3251相比，工程菌phe3250发酵生产l-苯丙氨酸的产量显著提高。表4发酵上清中的l-苯丙氨酸含量(g/l)工程菌phe32480.82±0.07工程菌phe32501.55±0.25工程菌phe32510.77±0.15l-苯丙氨酸浓度的检测方法：高效液相法，在参考文献(氨基酸和生物资源，2000，22，59-60)中氨基酸检测方法的基础上进行优化，具体方法如下(2,4-二硝基氟苯(fdbn)柱前衍生高效液相法)：取10μl上清液于2ml离心管中，加入200μl0.5mnahco3水溶液和100μl1％(体积比)fdbn-乙腈溶液，于60℃水浴中暗处恒温加热60min，然后冷却至室温，然后加入700μl0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/lkoh水溶液调整ph)并摇匀，静置15min，然后过滤并收集滤液。滤液用于上样，进样量为15μl。色谱柱为c18柱(zorbaxeclipsexdb-c18，4.6*150mm,agilent,usa)；柱温：40℃；紫外检测波长：360nm；流动相a为0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/100mlkoh水溶液调整ph)，流动相b为55％(体积比)乙腈水溶液，流动相总流量为1ml/min。洗脱过程：洗脱起始时刻(0min)流动相a占流动相总流量的体积份数为86％、流动相b占流动相总流量的体积份数为14％；洗脱过程分为4个阶段，每个阶段中流动相a和流动相b占流动相总流量的体积份数均为线性变化；第1阶段(从起始时刻开始共进行2min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为88％、流动相b占流动相总流量的体积份数为12％，第2阶段(从第1阶段结束时刻开始共进行2min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为86％、流动相b占流动相总流量的体积份数为14％，第3阶段(从第2阶段结束时刻开始共进行6min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为70％、流动相b占流动相总流量的体积份数为30％，第4阶段(从第3阶段结束时刻开始共进行10min)结束时流动相a占流动相总流量的体积份数为30％、流动相b占流动相总流量的体积份数为70％。以市售l-苯丙氨酸为标准品制作标准曲线，计算样品的苯丙氨酸浓度。最后应说明的是：显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。sequencelisting<110>中国科学院微生物研究所<120>苯丙氨酸衰减子突变体和解决反馈阻遏的苯丙氨酸操纵子以及它们的应用<130>gncyx171071<160>8<170>patentinversion3.5<210>1<211>192<212>dna<213>人工序列<400>1gcttttcattctgactgcaacgggcaatatgtctctgtgtggattaaaaaaagagtgtct60gatagcagcttctgaactggttacctgccgtgagtaaattaaaattttattgacttaggt120cactaaatactttaaccaatataggcatagcgcacagacagttgacaattaatcatccgg180ctcgtataatgt192<210>2<211>1413<212>dna<213>人工序列<400>2atgaaacacataccgtttttcttcgcattcttttttaccttcccctgaatgggaggcgtt60tcgtcgtgtgaaacagaatgcgaagacgaacaataaggcctcccaaatcggggggccttt120tttattgataacaaaaaggcaacactatgacatcggaaaacccgttactggcgctgcgag180agaaaatcagcgcgctggatgaaaaattattagcgttactggcagaacggcgcgaactgg240ccgtcgaggtgggaaaagccaaactgctctcgcatcgcccggtacgtgatattgatcgtg300aacgcgatttgctggaaagattaattacgctcggtaaagcgcaccatctggacgcccatt360acattactcgcctgttccagctcatcattgaagattccgtattaactcagcaggctttgc420tccaacaacatctcaataaaattaatccgcactcagcacgcatcgcttttctcggcccca480aaggttcttattcccatcttgcggcgcgccagtatgctgcccgtcactttgagcaattca540ttgaaagtggctgcgccaaatttgccgatatttttaatcaggtggaaaccggccaggccg600actatgccgtcgtaccgattgaaaataccagctccggtgccataaacgacgtttacgatc660tgctgcaacataccagcttgtcgattgttggcgagatgacgttaactatcgaccattgtt720tgttggtctccggcactactgatttatccaccatcaatacggtctacagccatccgcagc780cattccagcaatgcagcaaattccttaatcgttatccgcactggaagattgaatataccg840aaagtacgtctgcggcaatggaaaaggttgcacaggcaaaatcaccgcatgttgctgcgt900tgggaagcgaagctggcggcactttgtacggtttgcaggtactggagcgtattgaagcaa960atcagcgacaaaacttcacccgatttgtggtgttggcgcgtaaagccattaacgtgtctg1020atcaggttccggcgaaaaccacgttgttaatggcgaccgggcaacaagcctgtgcgctgg1080ttgaagcgttgctggtactgcgcaaccacaatctgattatgacccgtctggaatcacgcc1140cgattcacggtaatccatgggaagagatgttctatctggatattcaggccaatcttgaat1200cagcggaaatgcaaaaagcattgaaagagttaggggaaatcacccgttcaatgaaggtat1260tgggctgttacccaagtgagaacgtagtgcctgttgatccaacctgatgaaaaggtgccg1320gatgatgtgaatcatccggcactggattattactggcgattgtcattcgcctgacgcaat1380aacacgcggctttcactctgaaaacgctgtgcg1413<210>3<211>717<212>dna<213>人工序列<400>3atgagtaaaggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggt60gatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacgga120aaacttacccttaaatttatttgcactactggaaaactacctgttccatggccaacactt180gtcactactttctcttatggtgttcaatgcttttcccgttatccggatcatatgaaacgg240catgactttttcaagagtgccatgcccgaaggttatgtacaggaacgcactatatctttc300aaagatgacgggaactacaagacgcgtgctgaagtcaagtttgaaggtgatacccttgtt360aatcgtatcgagttaaaaggtattgattttaaagaagatggaaacattctcggacacaaa420ctcgagtacaactataactcacacaatgtatacatcacggcagacaaacaaaagaatgga480atcaaagctaacttcaaaattcgccacaacattgaagatggatccgttcaactagcagac540cattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattac600ctgtcgacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagcgtgaccacatggtcctt660cttgagtttgtaactgctgctgggattacacatggcatggatgagctctacaaataa717<210>4<211>162<212>dna<213>人工序列<400>4caattccgacgtctaagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtat60cacgaggccctttcgtcttcacctcgagtccctatcagtgatagagattgacctccctat120cagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacc162<210>5<211>386<212>prt<213>大肠杆菌<400>5metthrsergluasnproleuleualaleuargglulysileserala151015leuaspglulysleuleualaleuleualagluargarggluleuala202530valgluvalglylysalalysleuleuserhisargprovalargasp354045ileasparggluargaspleuleugluargleuilethrleuglylys505560alahishisleuaspalahistyrilethrargleupheglnleuile65707580ilegluaspservalleuthrglnglnalaleuleuglnglnhisleu859095asnlysileasnprohisseralaargilealapheleuglyprolys100105110glysertyrserhisleualaalaargglntyralaalaarghisphe115120125gluglnpheilegluserglycysalalysphealaaspilepheasn130135140glnvalgluthrglyglnalaasptyralavalvalproilegluasn145150155160thrserserglyalaileasnaspvaltyraspleuleuglnhisthr165170175serleuserilevalglyglumetthrleuthrileasphiscysleu180185190leuvalserglythrthraspleuserthrileasnthrvaltyrser195200205hisproglnpropheglnglncysserlyspheleuasnargtyrpro210215220histrplysileglutyrthrgluserthrseralaalametglulys225230235240valalaglnalalysserprohisvalalaalaleuglysergluala245250255glyglythrleutyrglyleuglnvalleugluargileglualaasn260265270glnargglnasnphethrargphevalvalleualaarglysalaile275280285asnvalseraspglnvalproalalysthrthrleuleumetalathr290295300glyglnglnalaglyalaleuvalglualaleuleuvalleuargasn305310315320hisasnleuilemetthrargleugluserargproilehisglyasn325330335protrpgluglumetphetyrleuaspileglnalaasnleugluser340345350alaglumetglnlysalaleulysgluleuglygluilethrargser355360365metlysvalleuglycystyrprosergluasnvalvalprovalasp370375380prothr385<210>6<211>386<212>prt<213>人工序列<400>6metthrse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