用于微量DNA提取的提取剂及其使用方法和应用与流程

本发明属于遗传工程技术领域，具体涉及一种用于微量dna提取的提取剂及使用方法和应用。

背景技术：

20世纪50年代，随着dna双螺旋结构模型的创立，科学家们进一步从本质上证实基因是决定人类生、老、病、死和一切生命现象的物质基础。随后兴起的分子生物学技术，特别是核酸杂交、核酸扩增和核酸序列分析等技术在基因研究过程中凸显出至关重要的作用。然而，所有这些技术首先面临的问题就是如何提取高质量的核酸，而且核酸的纯度和完整性也直接关系到后续实验的成败。目前研究人员已开发出了多种专业化的核酸提取方法，例如：酚氯仿抽提法、硅胶膜吸附柱法、磁珠法，这些方法可以有效的从核酸含量丰富的样本中提取高质量的核酸。然而，当样本极其微量，例如：单个囊胚，这些方法提取出来的核酸就无法满足后续实验的需要。

目前，现行微量dna提取方法提取的核酸dna总量小，还需要配合全基因组扩增或巢式pcr扩增，才能进行后续检测，额外增加的操作不仅存在试剂价格昂贵、而且操作繁琐、耗时、耗力。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于微量dna提取的提取剂。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

用于微量dna提取的提取剂，包括裂解液和中和液，裂解液由naoh和na2edta组成；中和液由tris-base组成。所述tris-base的中文名称为三羟甲基氨基甲烷。

进一步，所述naoh的浓度为1～50mmol/l，na2edta的浓度为0.1～1mmol/l。

进一步，所述tris-base的浓度为1～10mmol/l，ph值为4～7。

本发明的目的之二在于保护所述提取剂的使用方法，具体包括以下步骤：

a.微量核酸裂解液和中和液配制：

裂解液：称取0.04～2gnaoh，溶于90ml蒸馏水中，加入0.2～2ml50mmol/lna2edta,定容至100ml,混匀，常温保存备用；

中和液：称取0.1211～1.211gtris-base溶解于90ml蒸馏水中，稀盐酸调节ph至4-7，定容至100ml；

b.微量样本的收集：通过采用不同微量样本收集技术手段，收集微量样本，并将微量样本置于pcr管中；

c.微量样本dna裂解：

①向装入微量样本的pcr管中，加入5ul裂解液，1ul浓度为10ug/ul蛋白酶k,混匀；

②将pcr管置于pcr仪上，56℃10分钟，95℃10分钟；

③取出pcr管，置冰上，加入5ul中和液，混匀；

④4℃备用。

本发明的目的还在于保护所述提取剂在提取单个猪囊胚中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提取剂所采用的裂解液为实验室常用化学试剂，成本低廉，节约了实验成本；(2)本发明提取剂所采用的裂解液成份稳定，不需现用现配，能够反复20000次使用，不影响使用效果，且可在室温保存至少4-6个月；(3)利用本发明的提取剂提取微量样本dna过程中操作简单、快速，不需要繁琐的洗脱、离心等步骤；(4)本发明提取的微量核酸中dna含量高，无需额外的全基因组扩增或巢式pcr扩增，可直接用于后续实验检测。

附图说明

图1为实施例3的电泳检测结果图谱，m为dnamarker；

图2为实施例6的电泳检测结果图谱；其中，泳道1-4为实施例4中的利用提取剂提取的猪囊胚dna为模板进行pcr扩增的目的条带；泳道5-8为按照实施例4的酚氯仿法抽提的猪囊胚dna为模板进行pcr扩增的目的条带；泳道9-12为按照实施例4的试剂盒法提取的猪囊胚dna为模板进行pcr扩增的目的条带；m为dnamarker。

具体实施方式

所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1提取微量细胞dna

1、配制dna提取剂：

(1)裂解液：称取0.1gnaoh,溶于100ml去离子灭菌水中；另取1个烧杯，称取0.1861gna2edta,溶于10ml去离子灭菌水中；取0.4mlna2edta溶液与99.6mlnaoh溶液混匀，常温保存备用。

(2)中和液：称取0.4844gtris-base溶解于90ml去离子灭菌水中，稀盐酸调节ph至5，定容至100ml。

2、提取微量细胞dna：

(1)猪胎儿成纤维细胞生长至90％，pbs洗涤2遍，0.05％胰酶消化细胞；

(2)离心收集细胞，并用血细胞计数板计数；

(3)分别取50，100，500，5000，50000个细胞，每个数量取2管，离心，彻底去除上清；

(4)分别向装入细胞的pcr管中，加入5ul本发明的裂解液，1ul浓度为10ug/ul蛋白酶k,混匀；

(5)将pcr管置于pcr仪上，56℃10分钟，95℃10分钟；

(6)取出pcr管，置冰上，加入5ul中和液，混匀；

(7)-20℃备用。

实施例2微量细胞dnapcr扩增

利用q5高保真酶(neb,m0493)对实施例1中提取的微量细胞dna进行猪免疫球蛋白kappa轻链(pigk)扩增检测。引物信息如下：

pigk上游扩增引物的核苷酸序列为:ggaacacagaggaaggagagaaaa

pigk下游扩增引物的核苷酸序列为:ctaagcctcacactcgttcctgc

扩增片段长度：519bp

1、pcr扩增体系

(1)将试剂放置冰上至完全溶解，颠倒混匀，并瞬时离心；

(2)按如下方法配制扩增体系：

(3)将配制好的pcr体系，混匀，离心，

2、pcr扩增

将混匀的pcr管置于pcr仪，按表1所示条件进行扩增：

表1：pcr扩增反应条件

实施例3电泳检测

(1)称取0.3g琼脂糖加入30mltbe溶液，倒入锥形瓶中混匀，加热溶解；

(2)待冷却至不烫手时加入1ulgoldview,混匀，倒入已插好梳子的配胶槽中，冷却30分钟；

(3)将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中，

(4)取4ulpcr产物，加入0.4ul10×loadingbuffer混匀，按照顺序点样，在左边孔内点上dnamarker；

(5)120v,电泳30分钟；

(6)电泳结束后，取出胶，放入凝胶成像系统中观察拍照，得到如图1所示结果。

从图1可以看出，用本发明提取的50，100，500，5000，50000个猪胎儿成纤维细胞dna作为模板进行猪免疫球蛋白kappa轻链基因扩增，均能扩增出目的条带，并且条带清晰(见图1泳道1-10),条带亮度与细胞量成正比。

该结果表明，本发明方法提取猪胎儿成纤维细胞细胞dna,细胞数量可以低至50个；操作简单、快速；提取的dna不用巢式pcr扩增或全基因组扩增，直接就能满足后续pcr检测需要。

实施例4提取单个猪囊胚dna

收集猪卵母细胞进行体外成熟培养，成熟卵母细胞经孤雌激活后培养6-7天，发育至囊胚，在体式显微镜下用口吸管收集12枚猪囊胚，将囊胚分装至pcr管中，1枚/管。使用下述三种平行的方法分别提取4枚猪囊胚dna,进行对比实验。

1、提取方法

(1)配制dna提取剂：

①裂解液：称取0.1gnaoh,溶于100ml去离子灭菌水中；另取1个烧杯，称取0.1861gna2edta,溶于10ml去离子灭菌水中；取0.4mlna2edta溶液与99.6mlnaoh溶液混匀，常温保存备用。

②中和液：称取0.4844gtris-base溶解于90ml去离子灭菌水中，稀盐酸调节ph至4-7，定容至100ml。

(2)单个猪囊胚dna裂解：

①分别向装入囊胚的4个pcr管中，加入5ul裂解液，1ul浓度为10ug/ul蛋白酶k,混匀；

②将pcr管置于pcr仪上，56℃10分钟，95℃10分钟；

③取出pcr管，置冰上，加入5ul中和液，混匀；

④-20℃备用。

2、酚氯仿抽提法

(1)配制包含100mmnacl,50mmol/ltris-hcl,10mmol/ledta以及0.5％sds的核酸裂解液；

(2)分别向装入囊胚的4个pcr管中加入100ul裂解液，2ul10ug/ul蛋白酶k,混匀，56℃孵育30分钟；

(3)将囊胚裂解产物转入2ml离心管中，加入等体积酚氯仿，混匀；

(4)室温放置10分钟，12000rpm离心5分钟；

(5)小心吸取上清，加入等体积氯仿，混匀，12000rpm离心5分钟；

(6)小心吸取上清，加入1/10体积的醋酸钠，混匀

(7)加入2倍体积冷无水乙醇，颠倒混匀，-80℃，放置30分钟；

(8)12000rpm离心15分钟，弃上清；

(9)加入500ul70％乙醇，轻轻颠倒洗涤，12000rpm离心15分钟，弃上清；

(10)自然干燥，加入10ulte溶解，-20℃存放备用；

3、试剂盒法

2014年，takayuki等研究发现：与其他方法相比使用yeasttrna(ambion)能获得相对较好的囊胚dna，但该方法需配合repli-gminikit进行全基因组扩增，从而增加dna总量。具体方法如下：

(1)配制包含100mmol/ltris-hcl(ph8.0)，100mmol/lkcl，125μg/ml蛋白酶k，0.02％gelatine，0.45％tween-20以及60μg/mlyeasttrna的微量核酸裂解液；

(2)分别向装入囊胚的4个pcr管中加入10ul微量核酸裂解液，混匀；

(3)放入pcr仪上，56℃孵育10分钟，95℃10分钟；

(4)-20℃存放备用；

(5)取4uldna与3ulbufferd1混匀；

bufferd1：

reconstitutedbufferdlb:9ul

无核酸酶水：32ul

混匀

(6)65℃孵育10分钟，加入3ul终止液；

终止液：

stopsolution:12ul

无核酸酶水：68ul

混匀

(7)向上述混合液加入40ulrepli-g，混匀；

(8)30℃孵育16小时；

(8)60℃孵育3分钟，-20℃存放备用；

实施例5单个猪囊胚dnapcr扩增

利用q5高保真酶(neb,m0493)对实施例3中提取的12个猪囊胚dna进行猪免疫球蛋白重链(pigh)扩增检测。引物信息如下：

pigh上游扩增引物的核苷酸序列:aggcgggttggaattctgag

pigh下游扩增引物的核苷酸序列:aacgcaccgactatcacgtt

扩增片段长度：1664bp

1、pcr扩增体系准备

(1)将试剂放置冰上至完全溶解，颠倒混匀，并瞬时离心；

(2)按如下方法配制扩增体系：

(3)将配制好的pcr体系，混匀，离心，

2、pcr扩增

将混匀的pcr管置于pcr仪，按如下条件进行扩增：

表2：pcr扩增反应条件

实施例6电泳检测

(1)称取0.15g琼脂糖加入30mltbe溶液，倒入锥形瓶中混匀，加热溶解；

(2)待冷却至不烫手时加入1ulgoldview,混匀，倒入已插好梳子的配胶槽中，冷却30分钟；

(3)将冷却好的凝胶拔掉梳子后放入电泳槽中，

(4)取4ulpcr产物，加入0.4ul10×loadingbuffer混匀，按照顺序点样，在左边孔内点上dnamarker；

(5)150v,电泳30分钟；

(6)电泳结束后，取出胶，放入凝胶成像系统中观察拍照，得到如图2所示结果。

从图2可以看出，本发明的提取剂提取的单个猪囊胚dna作为模板进行猪免疫球蛋白重链基因扩增，都能扩增出目的条带，并且条带清晰(见图2泳道1-4),与已报道的试剂盒法扩增效果相当(见图2泳道9-12)。而以酚氯仿法提取的猪囊胚dna为模板，其pcr扩增没有明显的目的条带(见图2泳道5-8)。

该结果表明，利用本发明的提取剂来提取微量dna，方法简单、快速，而且得到的囊胚dna量较大，不需要额外增加全基因组扩增就能直接用于后续的pcr检测。

实施例7配制dna提取剂

(1)裂解液：称取0.04gnaoh,溶于100ml去离子灭菌水中；另取1个烧杯，称取0.1861gna2edta,溶于10ml去离子灭菌水中；取2mlna2edta溶液与98.0mlnaoh溶液混匀，常温保存备用。

(2)中和液：称取0.1211gtris-base溶解于90ml去离子灭菌水中，稀盐酸调节ph至5，定容至100ml。

实施例8配制dna提取剂

(1)裂解液：称取0.04gnaoh,溶于100ml去离子灭菌水中；另取1个烧杯，称取0.1861gna2edta,溶于10ml去离子灭菌水中；取2mlna2edta溶液与98.0mlnaoh溶液混匀，常温保存备用。

(2)中和液：称取0.1211gtris-base溶解于90ml去离子灭菌水中，稀盐酸调节ph至5，定容至100ml。

本发明实施例1、实施例7和实施例8中提取剂所采用的裂解液成份稳定，不需现用现配，能够反复20000次使用，不影响使用效果，且可在室温保存至少4-6个月。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

<110>重庆市畜牧科学院

<120>用于微量dna提取的提取剂及其使用方法和应用

<160>4

<210>1

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>猪pigk上游扩增序列

<400>1

ggaacacagaggaaggagagaaaa

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>猪pigk下游扩增序列

<400>2

ctaagcctcacactcgttcctgc

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>猪pigh上游扩增序列

<400>3

aggcgggttggaattctgag

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>猪pigh下游扩增序列

<400>4

aacgcaccgactatcacgtt