本发明涉及固载酶催化，具体涉及一种pickering乳液固载酶用于固定床连续化反应的方法。
背景技术：
酶催化反应具有条件温和，催化效率高，专一性强等优点，其高效的化学、立体和区域选择性有助于降低成本，提高反应效率，避免不必要的副反应以及减少环境污染。因此，酶作为一种重要的生物催化剂已被广泛用于药物、手性化合物和光学活性化合物等多种有机物的合成反应中，并显示出巨大的应用前景。
通常，酶催化反应在水介质中进行，而大部分有机反应底物仅溶于有机溶剂，因此形成典型的油水两相体系。油水两相体系虽然能够在一定程度上保持酶的稳定性，避免有机溶剂对酶的毒害作用。然而该体系的局限性在于一方面酶催化反应只能发生在油水界面处，酶与反应底物之间接触困难，导致反应速率缓慢，转化效率低，从而影响酶催化反应性能。另一方面，不利于对水敏感的酶催化反应，如酯化反应，酯交换反应等，水的存在会抑制反应的进行。
近年来的研究表明，酶在非水介质中仍可表现出催化活性，并且表现出在水介质中所不具有的特有的催化特性，如更高的底物溶解性、酯交换反应的可逆性以及酶催化的特异性。离子液体作为一种新型的非水溶剂，具有无毒、不挥发，热稳定性好、结构可设计、可回收再利用和对有机、无机、及高分子化合物好的溶解性等优点，被誉为绿色溶剂，广泛应用于各类生物催化中。r.m.lau等利用南极假丝酵母脂肪酶(candidaantarcticalipaseb，calb)在无水的[bmim][bf4]或[bmim][pf6]中催化丁酸乙酯和丁醇的酯交换反应，4h后反应转化率可达到81％(org.lett.,2000,2,4189–4191)。专利cn104531823a公开了一种以离子液体作为绿色介质酶催化拆分dl-薄荷醇的方法，该方法显著提高了酶在离子液体中的活性与稳定性，反应转化率与对映体过量率高，离子液体与酶可回收再利用，工艺绿色、高效、环保。然而离子液体粘度大，搅拌耗能，规模化应用困难。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种pickering乳液固载酶用于固定床连续化反应的方法。该方法通过油包离子液型pickering乳液固载酶，可有效解决油水两相体系中反应效率低，且不利于对水敏感的催化反应等问题；此外，该方法将离子液分割成微米级液滴，并用于固定床反应器，避免因离子液粘度大而难以实现连续化、规模化的难题。
本发明提供的一种pickering乳液固载酶用于固定床连续化反应的方法，包括如下步骤：
(1)界面活性的sio2的制备：采用超声波将60～80nm的sio2分散于甲苯中，然后加入二氯二甲基硅烷和正己胺(催化剂)；在60℃、氮气保护下，经过3～6h的搅拌回流，再将上述混合体系离心分离，得到的固体用甲苯和甲醇分别洗涤3-4次，真空干燥后，获得具有界面活性的sio2；所述sio2与二氯二甲基硅烷的质量比为1:0.3～0.7；所述二氯二甲基硅烷与正己胺的质量比为1:1.6～2.4。
(2)固载酶催化剂pickering乳液的制备：将酶溶液加入到离子液中，经磁力搅拌混合均匀；然后将界面活性sio2经超声波分散于有机溶剂后加入至上述包含酶的离子液中，最后经高速搅拌形成固载酶催化剂的pickering乳液；所述的离子液与界面活性sio2质量比为1:0.02～0.06；所述的离子液与有机溶剂的体积比为1:1～5；所述的酶在离子液中浓度为0.1-1.0g/l；所述的高速搅拌转数为5000～10000rpm；
所述有机溶剂为甲苯、己烷、辛烷；
所述酶为南极假丝酵母脂肪酶a(cala)、南极假丝酵母脂肪酶b(calb)、褶皱假丝酵母脂肪酶(crl)或洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶(bcl)；
所述离子液由阳离子和阴离子构成，所述阳离子为1-烷基-3-甲基咪唑，其中烷基为甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、辛基、癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基；所述阴离子为六氟磷酸或双三氟甲烷磺酰亚胺。
(3)将上述制备的固载酶催化剂pickering乳液装入固定床反应器中进行连续催化反应，通过恒流泵以精确控制反应流速，从内径为2cm的反应器上端输送反应物溶液，定时检测出口产物产率；所述反应器温度为25～50℃；所述反应器流速范围为2～10ml/h。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、酶固载过程简单，固载率高，最大限度的保持了酶结构的完整性和活性，提高了酶的稳定性。
2、反应物与分散在离子液内部的酶能够有效的接触，解决了油水两相体系的传质问题，从而提高酶的利用效率，降低反应成本。
3、离子液作为反应介质，可以扩展更多对水敏感且具有高附加值的酶催化反应，如酯化反应，酯交换反应等。
4、将离子液转化为油包离子液型pickering乳液，并可用于固定床连续化反应，有效解决了离子液在应用过程中因粘稠引起的搅拌耗能、规模化困难等问题。
5、提供了一种新的固载酶方法，酶无需分离即可实现重复利用，操作简便易行，适用于规模化生产。
6、该反应体系非常稳定，酶催化反应可连续运转4000小时以上。
综上所述，本发明不仅方法简单，操作方便，酶利用率高；且条件温和，反应和传质速率快，适用反应类型多，易于规模化。
附图说明
图1固载酶催化剂的pickering乳液用于连续化反应示意图
具体实施方式
实施例1
1)将干燥后0.8gsio2纳米颗粒分散到12ml甲苯中，加入0.25g二氯二甲基硅烷和0.4g正己胺，在60℃以及氮气保护条件下搅拌下回流3个小时。然后离心、洗涤、干燥后即可得到界面活性纳米sio2。
2)将0.2ml浓度为4g/l的calb酶溶液加入到6.5ml1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液中，经磁力搅拌混合均匀；然后将0.18g界面活性sio2超声分散于8ml辛烷并加入到上述离子液与酶的混合液中；最后经5000rpm高速搅拌形成固载酶催化剂的pickering乳液。
3)将所制备的固载酶催化剂的pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为45℃；通过恒流泵以2.5ml/h的流速通入浓度为0.1mol/l1-苯乙醇和0.4mol/l乙酸乙烯酯的辛烷溶液，进行酯交换手性拆分反应；反应连续进行4000小时，转化率大于49％，生成的手性醇和手性酯ee值均大于95％。
实施例2
1)将干燥后1.0gsio2纳米颗粒分散到15ml甲苯中，加入0.35g二氯二甲基硅烷和0.65g正己胺，在60℃以及氮气保护条件下搅拌下回流4个小时。然后离心、洗涤、干燥后即可得到界面活性纳米sio2。
2)将0.4ml浓度为4g/l的calb酶溶液加入到10ml1-丁基-3-甲基咪唑双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐离子液中，经磁力搅拌混合均匀；然后将0.3g界面活性sio2超声分散于20ml辛烷并加入到上述离子液与酶的混合液中；最后经6500rpm高速搅拌形成固载酶催化剂的pickering乳液。
3)将所制备的固载酶催化剂的pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为50℃；通过恒流泵以3.5ml/h的流速通入浓度为0.15mol/l1-苯乙胺和0.4mol/l甲氧基乙酸乙酯的甲苯溶液，进行胺酰基化手性拆分反应；反应连续进行1000小时，转化率大于47％，生成的手性胺和手性酰胺ee值大于90％。
实施例3
1)将干燥后1.2gsio2纳米颗粒分散到20ml甲苯中，加入0.48g二氯二甲基硅烷和1.0g正己胺，在60℃以及氮气保护条件下搅拌下回流5个小时。然后离心、洗涤、干燥后即可得到界面活性纳米sio2。
2)将0.4ml浓度为10g/l的bcl酶溶液加入到15ml1-乙基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液中，经磁力搅拌混合均匀；然后将0.6g界面活性sio2超声分散于45ml辛烷并加入到上述离子液与酶的混合液中；最后经7000rpm高速搅拌形成固载酶催化剂的pickering乳液。
3)将所制备的固载酶催化剂的pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为25℃；通过恒流泵以5ml/h的流速通入浓度为0.2mol/l苯甲醇和0.4mol/l乙酸乙烯酯的己烷溶液，进行酯交换反应；反应连续进行720小时，转化率大于95％。
实施例4
1)将干燥后1.5gsio2纳米颗粒分散到20ml甲苯中，加入0.8g二氯二甲基硅烷和1.6g正己胺，在60℃以及氮气保护条件下搅拌下回流4个小时。然后离心、洗涤、干燥后即可得到界面活性纳米sio2。
2)将1.0ml浓度为15g/l的crl酶溶液加入到20ml1-丁基-3-甲基咪唑双(三氟甲烷磺酰)亚胺盐离子液中，经磁力搅拌混合均匀；然后将1.0g界面活性sio2超声分散于80ml己烷并加入到上述离子液与酶的混合液中；最后经8500rpm高速搅拌形成固载酶催化剂的pickering乳液。
3)将所制备的固载酶催化剂的pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为35℃；通过恒流泵以8ml/h的流速通入浓度为0.2mol/l4-苯基-2-丁醇和0.4mol/l乙酸乙烯酯的己烷溶液，进行酯交换手性拆分反应；反应连续进行1000小时，转化率大于49％，生成的手性醇和手性酯ee值均大于99％。
实施例5
1)将干燥后2gsio2纳米颗粒分散到30ml甲苯中，加入1.4g二氯二甲基硅烷和3.6g正己胺，在60℃以及氮气保护条件下搅拌下回流6个小时。然后离心、洗涤、干燥后即可得到界面活性纳米sio2。
2)将1.2ml浓度为25g/l的cala酶溶液加入到30ml1-丙基基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐离子液中，经磁力搅拌混合均匀；然后将1.8g界面活性sio2超声分散于150ml己烷并加入到上述离子液与酶的混合液中；最后经10000rpm高速搅拌形成固载酶催化剂的pickering乳液。
3)将所制备的固载酶催化剂的pickering乳液转移至内径为2.0cm固定床反应器中，设定反应器温度为45℃；通过恒流泵以10ml/h的流速通入浓度为0.25mol/l1-羟基茚满和0.5mol/l乙酸乙烯酯的己烷溶液，进行酯交换手性拆分反应；反应连续进行1500小时，转化率大于49％，生成的手性醇和手性酯ee值大于98％。