本发明涉及一种利用大肠杆菌发酵生产胸腺磷酸化酶的方法，属于生物工程领域。
背景技术：
：胸苷是一种重要的医药原料中间体和生化试剂，在生物化工领域的研究和生产中有着十分广泛的应用。胸苷是制备抗爱滋病药——叠氮胸苷(azt)的重要原料，但要求其含量必须在98％以上，而且其中的5-甲基尿苷的含量不能超过0.3％。目前胸苷的制备主要有化学合成和dna酶解两种方法：由化学合成法所得到的胸苷粗品中含有油状物，色素，5-甲基尿苷等胸苷衍生物，并且存在光学异构体难以去除；工艺过程中亦需要使用大量有毒有害的有机溶剂，对环境污染亦存在危险。而酶解法通过水解rna或dna等天然物质，所得到的胸苷粗品中含有脱氧腺苷(da)，脱氧胞苷(dc)，脱氧乌苷(dg)，脱氧肌苷(di)等杂质，分离提取十分复杂。胸苷磷酸化酶在生物合成核苷药物中具有重要作用。合成出的核苷药物被广泛应用于医药领域，如治疗艾滋病的hiv逆转录酶抑制剂齐夫多定(azt)、双脱氧肌苷(ddl)、扎西他滨(ddc)等。胸苷磷酸化酶可特异性作用于β-胸苷，催化β-胸苷可逆磷酸化反应，由β-胸苷生成脱氧核糖-1-磷酸及胸腺嘧啶，亦可由脱氧核糖-1-磷酸和胸腺嘧啶生成β-胸苷。技术实现要素：本发明的发明目的是获得一种适合于工业化生产的利用大肠杆菌发酵生产胸腺磷酸化酶的方法，包括以下步骤：(1)挑取含有seqidno.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于高压灭菌后的一级培养基中，30℃，250rpm，过夜培养；(2)将步骤(1)获得的产品按照1:100的接种比例接入到高压灭菌后的二级培养基中，于30℃中培养至菌体od值5-6后，立即将其置于25℃中，震荡，250rpm培养1小时；(3)向步骤(2)获得的产品中加入iptg至其终浓度为0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时；(4)将培养液于4℃条件下，12000g下离心20分钟，收集湿菌体，然后利用菌体进一步发酵生产胸苷磷酸化酶。。其中一级培养基由下列物质组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。二级培养基由下列物质组成：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。上述描述中过夜是指12-16小时。获得湿菌体后，还可以包括以下步骤：将湿菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体。本发明中获得的菌体于-70℃保存。其中，seqidno.3这一人工序列所编码的氨基酸序列为seqidno：4，是一种胸苷磷酸化酶蛋白突变体。这一突变体是以大肠杆菌mg1655的胸苷磷酸化酶蛋白出发，通过将其第10位由leu突变为ala、第209位由ala突变为gly、第210位由phe突变为gly、第221位由ala突变为val、第413位由ala突变为asp得到一种新的胸腺磷酸化酶。本发明所公开的方法通过表达胸苷磷酸化酶突变体，能有效提高单位菌体的总酶活，可有效降低抗爱滋病药物中间体β-胸苷的生产成本。只要一般的发酵车间(如氨基酸、维生素生产车间)即可进行投入生产，不需购置特殊设备，易于推广应用。附图说明图1为胸苷磷酸化酶突变体seqidno.3表达载体图谱。具体实施方式为了更好的解释本发明，下面结合实施例对本发明进行进一步的阐述。在本实施例中所用到的仪器、试剂，除非有特殊说明，均为市售产品。实施例1将大肠杆菌mg1655置于lb培养基中培养，控制温度为37.0℃，180rpm培养1天，离心收集沉淀，用dna提取纯化试剂盒qiaampkit(qiagen，germany)提取纯化大肠杆菌mg1655基因组dna。用pfu高保真酶对大肠杆菌mg1655基因组dna进行pcr扩增，所用引物为1655tp-f5'atgtttctcgcacaagaaattattcg3'1655tp-r5'ttattcgctgatacggcgataga3'由于大肠杆菌mg1655的dna的gc含量接近50％，故使用pfu高保真酶直接扩增。之后将扩增的片段用taq聚合酶72℃处理10分钟，在dna3'端添加碱基a。之后将其连接到pmd19t-simple(takara宝生物公司，北京)克隆载体中，挑取单克隆送至南京金斯瑞生物进行测序。测序得到dna序列为seqidno.1，相应的氨基酸序列为seqidno.2。实施例2通过全基因合成的方法，对基因的二级结构以及密码子偏好性进行调整，以实现在大肠杆菌中的高表达。同时，在合成时引入以下位置的五个氨基酸突变:l10a,a209g,f210g,a221v,a413d，利用primerpremier(http://primer3.ut.ee/)和optimizer(http://genomes.urv.es/optimizer/)进行设计，并保证tm差异控制在3℃以内，引物长度控制在50base以内，得到以下引物：合成上述引物，并将获得的引物加双蒸水溶解后，加到如下的反应体系中，使得各引物的终浓度为30nm，首尾引物的终浓度为0.6μm。2mmdntpmix(2mmeachdntp)5μl10×pfubuffer5μlpfudnapolymerase(10u/μl)0.5μlddh2o使得反应体系总体积至50μl将配制好的pcr反应体系置于博日xpcycler基因扩增仪中，按下列程序进行扩增：98℃30s，65℃45s，72℃120s，35x。将pcr得到的dna片段进行切胶纯化，利用同源重组的方法克隆进pet30a的ndei/xhoi位点。挑取单克隆进行测序。测序成功的dna序列为seqidno.3，对应的氨基酸序列为seqidno.4。实施例3挑取含有seqidno.3表达载体的大肠杆菌单菌落接种于10ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l。30℃，250rpm过夜培养。次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到100ml高压灭菌后的培养基中：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l。于30℃中培养至菌体od5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时。加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，250rpm继续培养16小时。培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体。然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗两次，收集菌体，-70℃保存。实施例4按下列的体系构建标准酶反应液对获得的胸苷磷酸化酶进行活性检测：0.2m磷酸钾缓冲液(ph7.4)，25mm的胸苷，lmm的edta。用50ml离心管装1oml的标准酶反应液，按5％的湿菌体量加入发酵菌体；将上述的反应液在恒温水浴中振荡反应，反应条件为25℃水浴下反应3小时，反应结束后，将反应液在沸水中10分钟终止反应。将反应液转入离心管中，在12000r/min离心去除沉淀，取上清液用naoh稀溶液稀释100倍。用紫外分光光度计，测量稀释好的上清液在290nm处吸光值的变化。用空白液作为对照，按照前述的实验组处理方式进行相同的处理。酶活单位定义为：在ph7.4时，25℃下，1min内od290nm变化0.01所需要的湿菌体量定义为一个酶活力单位；结果表明含有五个突变位点的胸苷磷酸化酶活力为3.60u/mg，而突变前仅为0.32u/mg湿菌体，酶活增加约10倍左右。sequencelisting<110>南京诺云生物科技有限公司<120>一种利用大肠杆菌发酵生产胸苷磷酸化酶的方法<130>2016<160>4<170>patentinversion3.3<210>1<211>1323<212>dna<213>escherichiacolimg1655<400>1atgtttctcgcacaagaaattattcgtaaaaaacgtgatggtcatgcgctgagcgatgaa60gaaattcgtttctttatcaacggtattcgcgacaacactatctccgaagggcagattgcc120gccctcgcgatgaccattttcttccacgatatgacaatgcctgagcgtgtctcgctgacc180atggcgatgcgagattcaggaaccgttctcgactggaaaagcctgcatctgaatggcccg240attgttgataaacactccaccggtggcgtcggcgatgtgacttcgctgatgttggggccg300atggtcgcagcctgcggcggctatattccgatgatctctggtcgcggcctcggtcatact360ggcggtacgctcgacaaactggaatccatccctggcttcgacattttcccggatgacaac420cgtttccgcgaaattattaaagacgtcggcgtggcgattatcggtcagaccagttcactg480gctccggctgataaacgtttctacgcgacccgtgatattaccgcaaccgtggactccatc540ccgctgatcaccgcctctattctggcgaagaaacttgcggaaggtctggacgcgctggtg600atggacgtgaaagtgggtagcggcgcgtttatgccgacctacgaactctctgaagccctt660gccgaagcgattgttggcgtggctaacggcgctggcgtgcgcaccaccgcgctgctcacc720gacatgaatcaggtactggcctccagtgcaggtaacgcggttgaagttcgtgaagcggtg780cagttcctgacgggtgaatatcgtaacccgcgtctgtttgatgtcacgatggcgctgtgc840gtggagatgctgatctccggcaaactggcgaaagatgacgccgaagcgcgcgcgaaattg900caggcggtgctggacaacggtaaagcggcagaagtctttggtcgtatggtagcggcacaa960aaaggcccgaccgacttcgttgagaactacgcgaagtatctgccgacagcgatgctgacg1020aaagcagtctatgctgataccgaaggttttgtcagtgaaatggatacccgcgcgctgggg1080atggcagtggttgcaatgggcggcggacgccgtcaggcatctgacaccatcgattacagc1140gtcggctttactgatatggcgcgtctgggcgaccaggtagacggtcagcgtccgctggcg1200gttatccacgcgaaagacgaaaacaactggcaggaagcggcgaaagcggtgaaagcggca1260attaaacttgccgataaagcaccggaaagcacaccaactgtctatcgccgtatcagcgaa1320taa1323<210>2<211>440<212>prt<213>escherichiacolistr.k-12substr.mg1655<400>2metpheleualaglngluileilearglyslysargaspglyhisala151015leuseraspglugluileargphepheileasnglyileargaspasn202530thrilesergluglyglnilealaalaleualametthrilephephe354045hisaspmetthrmetprogluargvalserleuthrmetalametarg505560aspserglythrvalleuasptrplysserleuhisleuasnglypro65707580ilevalasplyshisserthrglyglyvalglyaspvalthrserleu859095metleuglyprometvalalaalacysglyglytyrileprometile100105110serglyargglyleuglyhisthrglyglythrleuasplysleuglu115120125serileproglypheaspilepheproaspaspasnargpheargglu130135140ileilelysaspvalglyvalalaileileglyglnthrserserleu145150155160alaproalaasplysargphetyralathrargaspilethralathr165170175valaspserileproleuilethralaserileleualalyslysleu180185190alagluglyleuaspalaleuvalmetaspvallysvalglysergly195200205alaphemetprothrtyrgluleuserglualaleualaglualaile210215220valglyvalalaasnglyalaglyvalargthrthralaleuleuthr225230235240aspmetasnglnvalleualaserseralaglyasnalavalgluval245250255argglualavalglnpheleuthrglyglutyrargasnproargleu260265270pheaspvalthrmetalaleucysvalglumetleuileserglylys275280285leualalysaspaspalaglualaargalalysleuglnalavalleu290295300aspasnglylysalaalagluvalpheglyargmetvalalaalagln305310315320lysglyprothraspphevalgluasntyralalystyrleuprothr325330335alametleuthrlysalavaltyralaaspthrgluglyphevalser340345350glumetaspthrargalaleuglymetalavalvalalametglygly355360365glyargargglnalaseraspthrileasptyrservalglyphethr370375380aspmetalaargleuglyaspglnvalaspglyglnargproleuala385390395400valilehisalalysaspgluasnasntrpglnglualaalalysala405410415vallysalaalailelysleualaasplysalaprogluserthrpro420425430thrvaltyrargargileserglu435440<210>3<211>1323<212>dna<213>人工序列<400>3atgttcctggctcaggaaatcatccgtaaaaaacgtgacggtcacgctctgtctgacgaa60gaaatccgtttcttcatcaacggtatccgtgacaacaccatctctgaaggtcagatcgct120gctctggctatgaccatcttcttccacgacatgaccatgccggaacgtgtttctctgacc180atggctatgcgtgactctggtaccgttgctgactggaaatctctgcacctgaacggtccg240atcgttgacaaacactctaccggtggtgttggtgacgttacctctctgatgctgggtccg300atggttgctgcttgcggtggttacatcccgatgatctctggtcgtggtctgggtcacacc360ggtggtaccctggacaaactggaatctatcccgggtttcgacatcttcccggacgacaac420cgtttccgtgaaatcatcaaagacgttggtgttgctatcatcggtcagacctcttctctg480gctccggctgacaaacgtttctacgctacccgtgacatcaccgctaccgttgactctatc540ccgctgatcaccgcttctatcctggctaaaaaactggctgaaggtctggacgctctggtt600atggacgttaaagttggttctggtggtggtatgccgacctacgaactgtctgaagctctg660gttgaagctatcgttggtgttgctaacggtgctggtgttcgtaccaccgctctgctgacc720gacatgaaccaggttctggcttcttctgctggtaacgctgttgaagttcgtgaagctgtt780cagttcctgaccggtgaataccgtaacccgcgtctgttcgacgttaccatggctctgtgc840gttgaaatgctgatctctggtaaactggctaaagacgacgctgaagctcgtgctaaactg900caggctgttctggacaacggtaaagctgctgaagttttcggtcgtatggttgctgctcag960aaaggtccgaccgacttcgttgaaaactacgctaaatacctgccgaccgctatgctgacc1020aaagctgtttacgctgacaccgaaggtttcgtttctgaaatggacacccgtgctctgggt1080atggctgttgttgctatgggtggtggtcgtcgtcaggcttctgacaccatcgactactct1140gttggtttcaccgacatggctcgtctgggtgaccaggttgacggtcagcgtccgctggct1200gttatccacgctaaagacgaaaacaactggcaggaagacgctaaagctgttaaagctgct1260atcaaactggctgacaaagctccggaatctaccccgaccgtttaccgtcgtatctctgaa1320taa1323<210>4<211>440<212>prt<213>人工序列<400>4metpheleualaglngluileilearglyslysargaspglyhisala151015leuseraspglugluileargphepheileasnglyileargaspasn202530thrilesergluglyglnilealaalaleualametthrilephephe354045hisaspmetthrmetprogluargvalserleuthrmetalametarg505560aspserglythrvalalaasptrplysserleuhisleuasnglypro65707580ilevalasplyshisserthrglyglyvalglyaspvalthrserleu859095metleuglyprometvalalaalacysglyglytyrileprometile100105110serglyargglyleuglyhisthrglyglythrleuasplysleuglu115120125serileproglypheaspilepheproaspaspasnargpheargglu130135140ileilelysaspvalglyvalalaileileglyglnthrserserleu145150155160alaproalaasplysargphetyralathrargaspilethralathr165170175valaspserileproleuilethralaserileleualalyslysleu180185190alagluglyleuaspalaleuvalmetaspvallysvalglysergly195200205glyglymetprothrtyrgluleuserglualaleuvalglualaile210215220valglyvalalaasnglyalaglyvalargthrthralaleuleuthr225230235240aspmetasnglnvalleualaserseralaglyasnalavalgluval245250255argglualavalglnpheleuthrglyglutyrargasnproargleu260265270pheaspvalthrmetalaleucysvalglumetleuileserglylys275280285leualalysaspaspalaglualaargalalysleuglnalavalleu290295300aspasnglylysalaalagluvalpheglyargmetvalalaalagln305310315320lysglyprothraspphevalgluasntyralalystyrleuprothr325330335alametleuthrlysalavaltyralaaspthrgluglyphevalser340345350glumetaspthrargalaleuglymetalavalvalalametglygly355360365glyargargglnalaseraspthrileasptyrservalglyphethr370375380aspmetalaargleuglyaspglnvalaspglyglnargproleuala385390395400valilehisalalysaspgluasnasntrpglngluaspalalysala405410415vallysalaalailelysleualaasplysalaprogluserthrpro420425430thrvaltyrargargileserglu435440当前第1页12