专利名称：一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法
—种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法技术领域
一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵生产普鲁兰酶的技术领域。
背景技术：
普鲁兰酶(pullulanase，EC. 3. 2.1. 41)是一类可以特异性水解普鲁兰、支链淀粉及其极限糊精中的α-1，6_糖苷键的脱支酶。在淀粉糖化过程中，普鲁兰酶与糖化酶共同作用，普鲁兰酶切割支链淀粉分支点，糖化酶只需切割线性的低聚糖，即可显著地提高淀粉的水解效率。使用普鲁兰酶不仅可降低糖化酶用量，还可使DE值提高到97%以上，提高水解产物葡萄糖或麦芽糖的质量和纯度。
目前已发现多种产普鲁兰酶的微生物，但大部分都无法应用于工业生产，主要原因有(I)酶的耐热耐酸性差，淀粉的糖化过程在55°c -60°c、pH 4. 5-5. O的范围内进行， 而大多数种类的普鲁兰酶在此范围内活性很低；(2)酶活水平低，很多普鲁兰酶产生菌胞外分泌普鲁兰酶的能力不强，分泌的普鲁兰酶又容易遭到蛋白酶的降解，因此难以进行工业化生产。目前，普鲁兰酶的工业化生产菌株极少，只有诺维信公司和杰能科公司有能力工业化生产并销售此酶。诺维信公司的普鲁兰酶产品占领了中国乃至世界95%以上的市场份额，其价格相当昂贵。我国关于普鲁兰酶的研究主要集中在产普鲁兰酶菌株的筛选和优化等方面，效果均不太理想。随着基因工程技术的发展，利用基因工程技术改造菌种，进一步提高酶的产量及活性，降低生产成本成为可能，并在世界范围内越来越得到重视。近几年， 我国学者利用基因工程技术构建基因工程菌株，取得了一定的效果。例如，2006年，夏子芳 用大肠杆菌表达系统表达海栖热胞菌普鲁兰酶基因，得到少量酶活；2008年，张明焱在大肠杆菌表达系统中表达Iicheniforms的普鲁兰酶编码基因，获得5. 6 U/mL酶活；2010年,王淑军等从深海古菌Thermococcus siculi HJ21中PCR扩增出一种新的普鲁兰酶基因，并在大肠杆菌中得到表达，但酶活较低。综上所述，在普鲁兰酶的微生物发酵生产过程中，不论是野生菌还是工程菌，主要存在的问题就是胞外酶活较低，造成了普鲁兰酶的生产成本上升，形成工业化生产的障碍。
本发明利用基因工程表达调控技术，构建了适用于普鲁兰酶表达分泌的基因工程菌株，在自诱导培养基中实现过量表达普鲁兰酶，并通过添加甘氨酸改变细胞通透性而进一步提高胞外普鲁兰酶的产量，为工业化生产奠定了基础。发明内容
( I)要解决的技术问题本发明的目的是提供基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法。本发明目的不仅仅在于通过微生物菌株发酵生产胞外普鲁兰酶，而是通过构建适合的大肠杆菌表达系统将具有优良的耐酸耐热性能的长野芽孢杆菌普鲁兰酶基因在大肠杆菌中获得高效重组表达，而且利用自诱导培养基并通过添加甘氨酸调控细胞透性的策略进一步提高重组大肠杆菌生产胞外普鲁兰酶的能力和产量，从而开发新型重组普鲁兰酶的生产工艺和应用价值。
(2)技术方案本发明首先构建表达长野芽孢杆菌UaciBm naganoensisXCTCC M 2012388普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌，将来源于长野芽孢杆菌的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达，在此基础上，将重组大肠杆菌在自诱导培养基中发酵培养以高效表达普鲁兰酶，并通过添加甘氨酸获得胞外普鲁兰酶的高效生产。
一种长野芽抱杆菌naganoensis) LBMAE-1,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012388 ；来源于CCTCC NO M 2012388菌株的普鲁兰酶基因/^7，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。
用CCTCC NO M 2012388菌株构建重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7的方法，将来源于CCTCC NO M 2012388菌株的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达；步骤为一、普鲁兰酶基因的获得CCTCC NO Μ 2012388 培养基=CaCl2 O. 25 g/L, MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L,(NH4) 2SO4 0.2 g/L,酵母提取物2 g/L,无水葡萄糖5 g/L, KH2PO4 3 g/L,无机盐溶液 I mL/L，用双蒸水配制，pH 5. O。无机盐溶液=ZnSO4 · 7H20 O.1 g/L, MnCl2 · H2O O. 03 g/ L, H3BO3 O. 3 g/L, CoCl2 · 6H20 0. 2 g/L, CuCl2 · 2H20 0. 01 g/L, NiCl2 · 6H20 0. 02 g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 03 g/L。
将CCTCC NO M 2012388菌种接种于含有25 mL培养基的250 mL摇瓶中，于37°C、 200 rpm振荡培养7 2 h。培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用基因组 DNA 提取试剂盒 Genomic DNA Extraction Miniprep System (VI0GENE 公司)提取基因组DNA。
合成引物1:5，- RaacaGGATCCaRatRRRaacaccacaaaC _3，，合成弓I物 2 :5’ - attccctcgagtttaccatcagatgggct -3’。
引物I含有BamHl限制性酶切位点，引物2含有Xho I限制性酶切位点。
PCR 反应体系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,dNTP(25 mmol/L)0. 5 yL，引物 I (50 pmol/μ L) I yL，引物 2 (50 pmol/μ L) I μ L，基因组 DNA 5 μ L，Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 0. 5 μ L。
以CCTCC NO M 2012388基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增普鲁兰酶基因。 PCR反应过程95°C预变性5 min ；95°C I min、60°C O. 5 min、72°C 2 min，进行30个循环； 72°C延伸 10 min。
利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
DNA溶液中加入1/10体积的乙酸钠溶液(3 mol/L, pH 5. 2)和2倍体积无水乙醇，-20°C沉淀 lh。12000 rpm 于 4°C离心 30 min。加入 75% 乙醇 500 μ L 洗涤，12000 rpm 于4°C离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，所得普鲁兰酶基因立即使用或_20°C保存。
二、含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建目的基因Z^/7及质粒pET20b (+)的酶切利用质粒提取试剂盒Min1-Plasmid Rapid Isolation Kit (北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pET20b (+)。
按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖， 振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入 1/10的Loading Buffer或将管置于65°C保温lOmin，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。
反应体系组成10XHBuffer 4 μ L，基因组 DNA 10 μ L, BamHl 2 μ L, Xhol 2 μ L, ddH20将体系补足40 μ L0
目的基因pul与质粒pET20b (+)的连接将目的基因/^/7与质粒pET20b (+)连接，反应体系组成如下质粒pET20b (+) 0.8 μ L， 目的基因Ζ^/74.2 μ L7Ligation Solution 5 μ L0混合连接液，将其置于16°C培养箱中连接反应12小时，得重组质粒pET20b (+) -pul。
重组质粒pET20b (+) -pul转化大肠杆菌在100 μ L大肠杆菌疋coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L重组质粒 pET20b (+)-/^/7，轻轻混匀，冰浴中静置30分钟。转入42°C水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。加入700 μ L的LB液体培养基，37°C、100 rpm摇床温育培养lh。培养后菌液3000 rpm离心2min,弃上清600 μ L,剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL氨节抗生素的LB平板上，37°C倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌疋 coli BL21 (DE3) / pET20b (+) _/^/人
带有信号肽PelB的目的基因与质粒pET28a(+)的连接将重组质粒pET20b (+)-/^/7及表达载体pET28a(+)分别用限制性内切酶油al RXhol 分步单酶切。按照水、缓冲液、重组质粒pET20b(+)-/7W或表达载体pET28a(+)、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65°C保温lOmin，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩。反应体系组成10XH Buffer 4 μ L，pET20b (+)或 pET28a(+) 10 μ I,IbaI 2 μ I,IAoI 2 μ L, ddH20将体系补足40 μ L0
将胶回收线性化的目标片段PelB_/w7与pET28a(+)载体连接，反应体系组成如下载体 pET28a(+) I μ L,目标片段 PelB_/w/74 μ L, Ligation Solution 5 μ L。混合连接液，将其置于16°C培养箱中连接反应12小时，得重组质粒pET28a(+)-PelB-Z^人
重组质粒pET28a (+) -VeYQ-pul转化大肠杆菌在100 μ L大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L pET28a(+)-PelB-/^7，轻轻混匀，冰浴中静置30min。转入42°C水浴中，热击90s。快速转移至冰浴中，冷却2min。加入700 μ L的LB液体培养基，37°C、100 rpm摇床温育培养lh。培养后菌液3000 rpm离心2min,弃上清600 μ L,剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养。获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌疋 coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-PelB-/w人
三、重组大肠杆菌的培养和胞外普鲁兰酶的生产自诱导培养自诱导培养基(g/L) :β_乳糖I 50，无水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24， 胰蛋白胨10，酵母提取物5，Na2HPO4 7. LNa2SO4 O. 71，NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液400 μ L/ L, pH 7. 5 8· O。
痕量元素溶液(g/L)=FeCl3 8. 125，CaCl2 2. 22, MnCl2 2. 52, ZnSO41. 61, CoCl2O.26，CuCl2 O. 27，NiCl2 O. 26，Na2MoO4 O. 41，Na2SeO3 O. 346，H3BO3 O. 124，HCl 2. 19。
将重组菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) -PelB-/w7 于含有 50 μ g/mL 卡那霉素的 LB固体培养基上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有50 μ g/mL 卡那霉素的液体LB培养基中于37°C、200 rpm振荡培养，随时监测培养基中OD6tltl的变化情况，待0D_达到2 3时，按5% 10%接种量接种于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自诱导培养基中，于l(T40°C、200rpm震荡培养2 20h后，添加终浓度I 25 g/L的甘氨酸，温度转为 1(T40°C培养6(T70h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心IOmin后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。
分别考察了诱导温度、甘氨酸使用浓度、37°C下培养时间和乳糖浓度的影响，最终确定了自诱导条件为自诱导培养基中乳糖浓度为10 g/L，在37°C下培养2h后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸并转入20°C下培养70h。培养结束后,将发酵液于10000 rpm离心IOmin 后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。
采用优化的自诱导培养基和发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到505 U/ mL。
普鲁兰酶测定方法取100 μ L用100 mM、pH 5. O的醋酸缓冲液适当稀释的酶液与等体积的溶于100 mM、 pH 5. O醋酸缓冲液中的10 g/L普鲁兰相混合于50 °C水浴中保温30min。加入DNS试剂 300 μ L摇匀，置于沸水中煮沸15min，取出以流动水迅速冷却后，于540 nm波长处，以O. 5 cm比色杯,测 定反应液的吸光度值。
酶活单位定义在上述指定的条件下，每min催化分解普鲁兰多糖生成相当于I μ mol葡萄糖的还原糖所需的酶为I个酶活单位(U)。
(3)有益效果成功克隆了长野芽孢杆菌(也CiBw1S naganoensis) CCTCC NO M 2012388普鲁兰酶编码基因，该基因全长2781 bp，编码926个氨基酸残基，其基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1，其氨基酸组成为SEQ ID N0:2。
将质粒pET20b(+)的信号妝 PelB 与长野芽抱杆菌naganoensis)CCTCC NO M 2012388普鲁兰酶编码基因连结，并共同插入表达载体pET28a(+)中，转化入相应表达宿主瓦BL21(DE3)中成功构建带有信号肽和目的基因/^7的重组菌株万.coli BL21 (DE3) / pET28a(+)-PelB-Z^人
将自诱导培养基和添加甘氨酸调控细胞透性的策略用于重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/w7的培养和普鲁兰酶的发酵产酶，优化自诱导培养基和发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可以达到505 U/mL,比长野芽孢杆菌OfeciJAz1S naganoensis) CClCC M 2012388出发菌株的酶活力(O. 4 U/mL)提高1260倍。这些工作为重组大肠杆菌高效生产胞外普鲁兰酶提供了有效策略，对于开发新型重组胞外普鲁兰酶的生产工艺和应用价值具有重要意义。
生物材料样品保藏长野芽孢杆菌iBaciIlus naganoensis ) LBMAE-1已进行保藏，保藏单位中国典型培养物保藏中心，简写CCTCC，地址中国武汉武汉大学，保藏编号 CCTCC NO M 2012388，保藏日期为 2012 年 9 月 28 日。
具体实施方式
实施例1LB培养基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7. O。需要时使用前加入卡那霉素(50 μ g/mL)，固体培养基添加15 g/L琼脂粉。
挑取重组大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C，200 rpm振荡培养过夜。 取I mL培养液转接于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm 振荡培养至OD6tltl约为O. 6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度O. 8 mmol/L，在培养温度30°C下进行诱导培养12h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心IOmin后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。利用LB培养基和IPTG诱导方式，获得胞外重组普鲁兰酶活力为8 U/mL。
实施例2 LB培养基胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L, NaCl 10 g/L, pH7. O。需要时使用前加入卡那霉素(50 μ g/mL)，固体培养基添加15 g/L琼脂粉。
挑取重组大肠杆菌万.coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7阳性克隆单菌落接种于3 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C，200 rpm振荡培养过夜。 取I mL培养液转接于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37°C、200 rpm 振荡培养至OD6tltl约为O. 6。向培养物中加入诱导物IPTG至终浓度O. 4 mmol/L，在培养温度30°C下进行诱导培养12h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心IOmin后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。利用LB培养基和IPTG诱导方式，获得胞外重组普鲁兰酶活力为 11 U/mL。
实施例3自诱导培养基(g/L) :β_乳糖10，无水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7. 1，Na2SO4 O. 71，NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L / L, pH 7. 5 8· O。痕量元素溶液(g/L) =FeCl3 8. 125，CaCl2 2. 22，MnCl2 2. 52，ZnSO41. 61， CoCl2 O. 26, CuCl2 O. 27, NiCl2 O. 26, Na2MoO4 O. 41, Na2SeO3 O. 346, H3BO3 O. 124, HCl 2.19。
重组菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) - el^>-pul 菌液接种于 50 mL含 50mg/L卡那霉素的自诱导培养基中，于37°C、200rpm震荡培养3小时后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸， 温度转为20°C培养60小时。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。采用自诱导培养基和优化的发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到306. 5 U/mL。
实施例4自诱导培养基(g/L) :β_乳糖10，无水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7.1,Na2SO4 O. 71 ,NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L/L，pH 7· 5 8· 0。痕量元素溶液(g/L) =FeCl3 8. 125, CaCl2 2· 22，MnCl2 2. 52, ZnSO41. 61, CoCl2O.26，CuCl2 O. 27，NiCl2 O. 26，Na2MoO4 O. 41，Na2SeO3 O. 346，H3BO3 O. 124，HCl 2. 19。
重组菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) - el^>-pul 菌液接种于 50 mL 含 50mg/L 卡那霉素的自诱导培养基中，于37°C、200rpm震荡培养2h后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸，温度转为20°C培养60h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。采用自诱导培养基和优化的发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到 440. 7 U/mL。
实施例5自诱导培养基(g/L) :β_乳糖10，无水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7.1,Na2SO4 O. 71 ,NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L/L， pH 7· 5 8· O。痕量元素溶液(g/L) =FeCl3 8. 125,CaCl2 2· 22，MnCl2 2. 52,ZnSO41. 61,CoCl2O.26，CuCl2 O. 27，NiCl2 O. 26，Na2MoO4 O. 41，Na2SeO3 O. 346，H3BO3 O. 124，HCl 2. 19。
重组菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) - el^>-pul 菌液接种于 50 mL 含 50mg/L 卡那霉素的自诱导培养基中，于37°C、200rpm震荡培养3h后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸，温度转为20°C培养70h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。采用自诱导培养基和优化的发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到 405. 2 U/mL。
实施例6自诱导培养基(g/L) :β_乳糖10，无水葡萄糖O. 5，甘油5，KH2PO4 6. 8，MgSO4 O. 24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7.1,Na2SO4 O. 71 ,NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L/L， pH 7· 5 8· O。痕量元素溶液(g/L) =FeCl3 8. 125,CaCl2 2· 22，MnCl2 2. 52,ZnSO41. 61,CoCl2O.26，CuCl2 O. 27，NiCl2 O. 26，Na2MoO4 O. 41，Na2SeO3 O. 346，H3BO3 O. 124，HCl 2. 19。
重组菌疋co7iBL21 (DE3) / pET28a (+) - el^>-pul 菌液接种于 50 mL 含 50mg/L 卡那霉素的自诱导培养基中，于37°C、200rpm震荡培养2h后，添加终浓度6 g/L的甘氨酸，温度转为20°C培养70h。培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10分钟后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。采用自诱导培养基和优化的发酵产酶条件后，胞外普鲁兰酶酶活可达到 505 U/mL。
权利要求
1.一种长野芽孢杆菌(ifeci77w5· Aagafloefl1Si1S) LBMAE-1,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012388 ；来源于CCTCC NO M 2012388菌株的普鲁兰酶基因/^7，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1，其氨基酸序列为SEQ ID NO: 2。
2.用权利要求1所述CCTCCNO M 2012388菌株构建重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3) / pET28a(+)-PelB-/^7的方法，其特征在于将来源于CCTCC NO M 2012388菌株的普鲁兰酶基因在大肠杆菌中进行重组表达；步骤为(1)普鲁兰酶基因的获得CCTCC NO Μ 2012388 培养基CaCl2 O. 25 g/L，MgSO4 · 7H20 O. 5 g/L, (NH4)2SO4 0.2 g/L，酵母提取物2 g/L，无水葡萄糖5 g/L, KH2PO4 3 g/L，无机盐溶液I mL/L，用双蒸水配制，pH 5. O ；无机盐溶液=ZnSO4 · 7H20 O.1 g/L, MnCl2 · H2O O. 03 g/L, H3BO3 O. 3 g/L, CoCl2 · 6H20 0. 2 g/L, CuCl2 · 2H20 0. 01 g/L, NiCl2 · 6H20 0. 02 g/L, Na2MoO4 · 2H20 0. 03 g/L ；将CCTCC NO M 2012388菌种接种于含有25 mL培养基的250 mL摇瓶中，于37°C、 200 rpm振荡培养72 h，培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞，利用 VI0GENE 公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因组DNA ；弓I物1:5，- gaacaGGATCCagatgggaacaccacaaaC Sf,弓I物 2 :5，- attccctcgagtttaccatcagatgggct _3，；引物I含韦BamHl限制性酶切位点，引物2含有通ο I限制性酶切位点；PCR 反应体系ddH20 37 μ L，10 X Reaction Buffer 5 μ L,25 mmol/L 的 dNTP 0.5 μ L,50 pmol/μ L 的引物 I 取 I yL，50 pmol/μ L 的引物 2 取 I μ L，基因组 DNA 5 μ L,5 U/μ L 的 Taq DNA polymerase 0. 5 μ L ；以CCTCC NO Μ 2012388基因组DNA为模板，采用PCR方法扩增普鲁兰酶基因，PCR反应过程95°C预变性 5 min ；95°C I min,60°C 0. 5 min、72°C 2 min，进行 30 个循环；72°C 延伸10 min ；利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit 纯化DNA片断DNA溶液中加入1/10体积pH 5. 2、3 mo I/L的乙酸钠溶液和2倍体积无水乙醇，_20°C 沉淀lh，12000 rpm于4°C离心30 min，加入75%乙醇500 μ L洗涤，12000 rpm于4°C离心 30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，所得普鲁兰酶基因立即使用或-20°C 保存；(2)含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建目的基因/^/7及质粒pET20b (+)的酶切利用北京博大泰克生物基因技术有限公司的质粒提取试剂盒Min1-Plasmid Rapid Isolation Kit 提取质粒 pET20b (+)；按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入1/10的 Loading Buffer或将管置于65°C保温lOmin，终止酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成10 XH Buffer 4 μ L，基因组 DNA 10 μ L, BamHl 2 μ I, Ι οΙ 2 μ L, ddH20将体系补足40 μ L ；目的基因/^/7与质粒pET20b (+)的连接将目的基因/^/7与质粒pET20b (+)连接，反应体系组成如下质粒pET20b (+) 0.8 μ L， 目的基因4. 2 μ L7Ligation Solution 5 μ L，混合连接液，将其置于16°C培养箱中连接反应12h，得重组质粒pET20b (+) -pul ；重组质粒pET20b (+) -pul转化大肠杆菌在100 μ L大肠杆菌疋coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L重组质粒 pET20b (+) -/^/7，轻轻混匀，冰浴中静置30min，转入42°C水浴中，热击90s ;快速转移至冰浴中，冷却2 min,加入700 μ L的LB液体培养基，37°C、100 rpm摇床温育培养lh，培养后菌液3000 rpm离心2 min,弃上清600 μ L,剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL氨节抗生素的LB平板上，37°C倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3) / pET20b (+) -pul ；带有信号肽PelB的目的基因与质粒pET28a(+)的连接将重组质粒pET20b (+)-/^/7及表达载体pET28a(+)分别用限制性内切酶油al RXhol 分步单酶切，按照水、缓冲液、重组质粒pET20b (+) -pul或表达载体pET28a(+)、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2s使液体集中于管底，37°C水浴3h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65°C保温10 min，终止酶切反应；酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成 IOXH Buffer 4 μ L，pET20b (+)-/ 7 或pET28a (+) 10 μ I,IbaI 2 μ Ι,Ι οΙ 2 μ L, ddH20 将体系补足40 μ L ;将胶回收线性化的目标片段PelB-/w7与pET28a(+)载体连接，反应体系组成如下载体 pET28a(+) I μ L,目标片段 PelB-/w/7 4 μ L, Ligation Solution 5 μ L,混合连接液， 将其置于16°C培养箱中连接反应12h，得重组质粒pET28a(+)-PelB-/w7 ；重组质粒pET28a(+)-PelB-/ W转化大肠杆菌在100 μ L大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)感受态细胞悬液中加入10 μ L pET28a(+)-PelB-/^7，轻轻混匀，冰浴中静置30 min，转入42°C水浴中，热击90s，快速转移至冰浴中，冷却2 min,加入700 μ L的LB液体培养基，37°C、100 rpm摇床温育培养lh，培养后菌液3000 rpm离心2 min,弃上清600 μ L,剩余菌液混勻后涂布到含有50 μ g/mL 卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌疋 coli BL21 (DE3) / pET28a (+)-PelB-/w人
3.用权利要求2所述重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/w7生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于自诱导培养自诱导培养基g/L :β-乳糖I 50，无水葡萄糖0.5，甘油5,KH2PO4 6. 8,MgSO4 0.24，胰蛋白胨 10，酵母提取物 5，Na2HPO4 7. l，Na2S04 0. 71 ,NH4Cl 2. 67，痕量元素溶液 400 μ L/L， 用双蒸水配制，PH 7. 5^8. O ；痕量元素溶液 g/L =FeCl3 8. 125，CaCl2 2. 22，MnCl2 2. 52，ZnSO41. 61，CoCl2 0. 26， CuCl2 0. 27，NiCl2 0. 26，Na2MoO4 0. 41，Na2SeO3 0. 346，H3BO3 0. 124，HCl 2. 19 ；将重组菌疋 coli BL21 (DE3) / pET28a(+) - el^>-pul 于含有 50 μ g/mL 卡那霉素的 LB 固体培养基上过夜活化培养，从固体平板上挑取单个菌落接种于3 mL含有·50 μ g/mL卡那霉素的液体LB培养基中于37°C、200 rpm振荡培养，随时监测培养基中OD6tltl的变化情况，待 0D_达到2 3时，按5°/Γ Ο%接种量接种于50 mL含50 μ g/mL卡那霉素的自诱导培养基中， 于l(T40°C、200rpm震荡培养2 20h后，添加终浓度I 25g/L的甘氨酸，温度转为1(T40°C培养6(T70h;培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10 min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定。
4.根据权利要求3所述重组大肠杆菌疋coli BL21 (DE3)/ pET28a(+)-PelB-/^7生产胞外普鲁兰酶的方法，其特征在于分别考察了诱导温度、甘氨酸使用浓度、37°C下培养时间和乳糖浓度的影响，最终确定了自诱导条件为自诱导培养基中乳糖浓度为10 g/L，在 37°C下培养2h后，添加终浓度6g/L的甘氨酸并转入20°C下培养70h ;培养结束后，将发酵液于10000 rpm离心10 min后得发酵上清用于菌株胞外酶活的测定；胞外普鲁兰酶酶活达 505 U/mL。
全文摘要
一种基因重组大肠杆菌及其高效生产普鲁兰酶的方法，属于微生物发酵技术领域。本发明将质粒pET20b(+)的信号肽PelB与长野芽孢杆菌(Bacillusnaganoensis)CCTCC NOM2012388普鲁兰酶基因pul连接，并共同插入表达载体pET28a(+)中，构建带有信号肽和目的基因的重组菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a(+)-PelB-pul。将自诱导培养和添加甘氨酸调控细胞透性的策略用于胞外普鲁兰酶的发酵生产，采用乳糖浓度10g/L的自诱导培养基，于37℃、200rpm震荡培养约2h后，添加终浓度6g/L的甘氨酸并转入20℃下培养70h，胞外普鲁兰酶酶活达505U/mL，比野生菌出发菌株的酶活力提高1260倍。本发明的应用具有重要意义。
文档编号C12N1/21GK102994425SQ201210481749
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月24日 优先权日2012年11月24日
发明者聂尧, 徐岩, 严伟 申请人:江南大学