表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种大肠杆菌工程菌，本发明还提供一种大肠杆菌工程菌的制备方法，步骤是克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的cDNA，双酶切上述cDNA，将酶切片段连接pCold-TF载体,鉴定得到的质粒pCold-TF-LiP是否阳性表达，将阳性质粒pCold-TF-LiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌，本发明还提供大肠杆菌工程菌的应用，方法是将大肠杆菌工程菌接种于液体培养基，液体培养基中加入氨苄青霉素，培养至OD600为0.58～0.62，加入蛋白诱导剂IPTG，诱导重组蛋白表达，本发明的大肠杆菌工程菌表达量高，活性极强，酶活为3528U/L。
【专利说明】表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种大肠杆菌工程菌，具体是一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌、制备方法及其应用。
【背景技术】
[0002]木质素是地球上已知的第二大量的生物高聚物，结构非常复杂，不容易降解(Martinez,A.T.，et al.2005."Biodegradation of lignoceIIulosics:microbial，chemical，and enzymatic aspects of the fungal attack of lignin.〃Int Microbiol8:195-204)。由于缺乏适当的处理，许多木质素变成了废物，引发了各种各样的环境问题。伴随着能源的日益紧张，已有国内外研究人员试图通过转变木质素来生产乙醇作为替代能源并取得一定进展。木质纤维素也被用于制造纸的原材料、培养食用菌和动物饲料(Sanchez, C.2009.^Lignocellulosic residues:biodegradation and bioconversion byfung1."Biotechnol Adv 27:185-194)。我国每年的木质素废物产量巨大，堆积如山，随之衍生的木质素生物转变和资源化利用具有广阔的应用前景。虽然木质素的用途多样，然而由于缺乏强有力的木质素资源化转变技术，极大地制约了它的资源化利用。截至目前，木质素的利用率仍旧是非常低的。分解木质素的方法是多样的。特别地，微生物降解木质素是当前公认的既经济又友好的方式。微生物通过分泌木质素降解酶，能有效地降解木质素。木质素过氧化物酶就是一种重要的木质素降解酶，由包含亚铁血红素的糖蛋白构成(Choinowski, T., et al.1999.^The crystal structure of lignin peroxidase at 1.70A resolution reveals a hydroxy group on the cbeta of tryptophan 171:a novelradical site formed during the redox cycle."J Mol Biol 286:809-827)，主要由真菌等微生物分泌，种类繁多，包括 Ligninase H2、Ligninase H8、Ligninase A、LigninaseB、Ligninase C、Ligninase LG2、Ligninase LG3、Ligninase LG5、Ligninase LG6、Ligninperoxidase lipj、 Lignin peroxidase isoform A、 Lignin peroxidase isoform lipB、Lignin peroxidase isoform lipD、Lignin peroxidase isoform lipE、Lignin peroxidaseisoform IipG 等(http:// www.uniprot.0rg/)。
[0003]自然界中许多微生物例如白腐真菌可以分泌木质素过氧化物酶。因此，白腐真菌已普遍应用于木质素的生物降解。例如黄孢原毛平革菌(一种白腐真菌)分泌的木质素过氧化物酶具有较强的木质素降解能力。尽管白腐真菌依赖其强大的木质素降解能力而被普遍应用于木质素降解研究中，但是当同细菌相比较，其繁殖速度一般低于细菌，致使其在实际的推广使用中受到了一定的限制。此外，白腐真菌分泌的木质素过氧化物酶的数量是有限的，难于大规模的应用于木质素废物的生物降解和工业生产中的纸浆漂白，仅仅依赖现存的微生物分泌的少量的木质素过氧化物酶进行降解是不现实的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是将细菌快速的繁殖能力和白腐真菌木质素过氧化物酶强大的木质素降解能力结合起来，通过基因克隆和重组的方法得到一种能表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌，另外提供大肠杆菌工程菌的制备方法和应用。
[0005]本发明的能表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌，构建其所需的步骤如下:
(O克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的CDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase LG3，蛋白序列为SEQ ID NO:01 ;通过木质素过氧化物酶的序列构建其基因的cDNA序列，适当调整，得到所述基因的cDNA序列为SEQ ID N0:02。
[0006](2)用如I和通ο I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4 DNA连接酶连接pCold-TF载体，得到重组原核表达质粒pCold-TF-Zi凡
[0007](3)鉴定重组原核表达质粒pCold-TF-Zi产是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCoId-TF-Zi凡
[0008](4)将阳性重组质粒pCoId-TF-ZiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。
[0009]鉴定重组原核表达质粒pCold-TF-Zi/^是否阳性表达的方法为:
(一)热击法将重组原核表达质粒pCold-TF-Zi/^导入至DH5 α感受态细胞中。
[0010](二)菌液PCR扩增鉴定，得到阳性克隆的DH5 α ;所述PCR扩增所使用的正向引物为 5，- aactcgagatggcatttaaacagctttttgcgg - 3，，序列为 SEQ ID N0:03,反向引物为 5’-aaggatcccgctcccggaggcggtgg - 3，，序列为 SEQ ID N0:04。
[0011](三)碱裂解法对上述阳性克隆的DH5α提取重组质粒。
[0012](四)重组质粒进行I和通OI双酶切鉴定，对目的片段进行测序，测序正确的重组质粒为阳性重组质粒pCoId-TF-Zi凡
[0013]本发明还提供一种大肠杆菌工程菌在表达木质素过氧化物酶中的应用，步骤是: 将表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌接种于LB液体培养基，LB液体培养基中
加入氨苄青霉素80~120mg/L, 35~37°C，180~220 rpm,培养至OD600为0.58-0.62，加入蛋白诱导剂IPTG，16°C，200rpm，诱导重组蛋白表达12~16h。所述LB液体培养基的配方为:蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，加水50ml。
[0014]将诱导表达后的大肠杆菌工程菌装入离心管中，离心，弃上清液，加入缓冲液重悬，超声破碎，加入镍柱，进行纯化。
[0015]本发明的有益效果是:
1.本发明合成的木质素过氧化物酶来源于黄孢原毛平革菌，白腐真菌属于真菌门担子菌纲，形状为丝状，黄孢原毛平革菌是白腐真菌中的典型代表，具有较强的木质素降解能力。
[0016]2.本发明所使用的大肠杆菌BL21具有很快的繁殖能力，保证了重组得到的大肠杆菌工程菌能在很短的时间里生产一定数量的木质素过氧化物酶，能用于木质素固体废物的降解和纸浆工业的漂白。
[0017]3.本发明所获得的一种能表达合成的木质素过氧化物酶基因的大肠杆菌工程菌体积小易培养，适合大规模工业化生产木质素过氧化物酶。
[0018]4.本发明选取的Ligninase LG3的全长蛋白质序列是已知的,而其它的木质素过氧化物酶基因很多是片段的，克隆片段或非全长基因序列很难获得基因的全部功能，可能导致其构建的工程菌表达的木质素过氧化物酶没有活性。
[0019]5.本发明选取Ligninase LG3相较于其它木质素过氧化酶蛋白质序列长度适中且蛋白质全长序列已知，便于基因克隆，节省了时间和成本。
[0020]6.本发明将选取的Ligninase LG3构建入原核载体pCold-TF中，得到重组原核表达载体pCold-TF-Zi凡原核载体pCold-TF中的TF能够增加外源蛋白的可溶性，因此能够增加Ligninase LG3蛋白的可溶性。本发明得到的含有Ligninase LG3的大肠杆菌工程菌表达量大，蛋白产量高，具有满足工业生产的巨大潜力，可望大规模应用于固体废物的降解和环境污染治理。
[0021]7.本发明的木质素过氧化物酶是Ligninase LG3，我们发现，其所表达的木质素过氧化物酶具有活性，且酶活性非常高，酶活为3528 U/L。相比现有技术的工程菌表达的过氧化物酶无活性的技术相比，具有巨大的效果和显著的进步。 【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为原核表达载体pCold-TF-Zi产双酶切后的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M为Marker，I代表取样1，2代表取样2。
[0023]图2为菌液PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
其中，M为Marker，1、2、3、4、5是以菌液为模板的PCR扩增产物，条带6是阴性对照，条带7是阳性对照。
[0024]图3为可溶性分析的SDS-PAGE图；
其中，M为Protein Marker，I为总蛋白，2为上清，3为沉淀。
【具体实施方式】
[0025]实施例1
1、克隆木质素过氧化物酶基因的cDNA
从数据库UniPiOtKB筛选得到木质素过氧化物酶的蛋白质序列(P21764)为SEQ ID:N0:01，为Met Ala Phe Lys Gln Leu Phe Ala Ala He Ser Leu Ala Leu Ser Leu Ser AlaAla Asn Ala Ala Ala Val He Glu Lys Arg Ala Thr Cys Ser Asn Gly Lys Thr Val GlyAsp Ala Ser Ser Cys Ala Trp Phe Asp Val Leu Asp Asp He Gln Gln Asn Leu Phe HisGly Gly Gln Cys Gly Ala Glu Ala His Glu Ser He Arg Leu Val Phe His Asp Ser IleAla He Ser Pro Ala Met Glu Ala Gln Gly Lys Phe Gly Gly Gly Gly Ala Asp Gly SerHe Met He Phe Asp Asp He Glu Thr Ala Phe His Pro Asn He Gly Leu Asp Glu IleVal Lys Leu Gln Lys Pro Phe Val Gln Lys His Gly Cys Thr Pro Gly Asp Phe He AlaPhe Ala Gly Ala Val Ala Leu Ser Asn Cys Pro Gly Ala Pro Gln Met Asn Phe Phe ThrGly Arg Ala Pro Ala Thr Gln Ala Ala Pro Asp Gly Leu Val Pro Glu Pro Phe His ThrVal Asp Gln He He Asn Arg Val Asn Asp Ala Gly Glu Phe Asp Glu Leu Glu Leu ValTrp Met Leu Ser Ala His Ser Val Ala Ala Val Asn Asp Val Asp Pro Thr Val Gln GlyLeu Pro Phe Asp Ser Thr Pro Gly He Phe Asp Ser Gln Phe Phe Val Glu Thr Gln LeuArg Gly Thr Ala Phe Pro Gly Ser Gly Gly Asn Gln Gly Glu Val Glu Ser Pro Leu ProGly Glu He Arg He Gln Ser Asp His Thr He Ala Arg Asp Ser Arg Thr Ala Cys GluTrp Gln Ser Phe Val Asn Asn Gln Ser Lys Leu Val Asp Asp Phe Gln Phe lie Phe LeuAla Leu Thr Gln Leu Gly Gln Asp Pro Asn Ala Met Thr Asp Cys Ser Asp Val lie ProGln Ser Lys Pro He Pro Gly Asn Leu Pro Phe Ser Phe Phe Pro Ala Gly Lys Thr lieLys Asp Val Glu Gln Ala Cys Ala Glu Thr Pro Phe Pro Thr Leu Thr Thr Leu Pro GlyPro Glu Thr Ser Val Gln Arg lie Pro Pro Pro Pro Gly Ala。
[0026]为了使该蛋白质能在原核表达载体中1?效地表达，对该蛋白质序列(P21764)的cDNA进行了一些修饰和改造，在克隆引物序列5’两端添加了和Z如I双酶切位点，获得的基因片段经和Z如I双酶切法融合入原核表达载体pCold-TF，获得重组原核表达质粒PCold-TF-Zi户，该重组质粒表达的融合蛋白加入组氨酸标签，有利于融合蛋白的鉴定及纯化。所述 cDNA 序列为 SEQ ID NO:02, SEQ ID N0:02 为 atggcatttaaacagctttttgcggcgattagcctggcgctgagcctgagcgcggctaatgctgcggcggtgattgaaaaacgtgcgacctgcagcaatggcaaaaccgtgggcgatgcgagcagctgtgcgtggtttgatgtgctggatgatattcagcagaatctgtttcatggcggccagtgcggtgcggaggcgcacga aagcattcgtctggtgtttcatgatagcattgcgattagtcccgcgatggaagcgcagggaaaattcggcggtggtggggccgatggcagcattatgatttttgatgatattgaaaccgcgtttcatccgaatattggcctggacgaaattgtgaaactgcagaaaccgtttgtgcagaaacatggctgcacgccgggtgattttatcgcgtttgcaggggcagtcgcgctgagcaattgtccgggtgctccgcagatgaatttctttaccggccgtgcaccggcaacccaagccgcaccggatggcctggtgccggaaccctttcataccgtggatcagattatcaatcgtgtgaatgatgcgggcgaatttgatgaactggaactggtgtggatgctgagcgcgcatagcgtggcggcagtaaatgacgtggacccgaccgtgcagggcctgccttttgatagcaccccgggtatttttgattctcagttttttgttgaaacccagctgcgtggcaccgcgtttccgggctcaggcggcaatcagggcgaagtggaaagtccgctgcctggcgaaattcgtattcagagtgatcataccattgcgcgtgatagccgtaccgcgtgcgaatggcagagctttgtgaataatcagagcaaactggtggatgattttcagtttatctttctggcgctgacccaattaggccaggaccctaatgcgatgactgattgcagcgatgtgattccgcagagcaaacccattccgggcaacctgccgtttagcttttttccggcaggcaaaaccattaaggatgtggagcaggcgtgtgcggaaaccccttttccgaccctgaccaccctgcctggtccagagaccagcgtgcagcgtattccaccgcctccgggagcgtaao
[0027]2、构建重组表达载体pCoId-TF-ZiP
用及I和ZAo I双酶切克隆的木质素过氧化物酶基因片段。双酶切体系为:1.5 μ LBam^ I, 1.5μ L Xho Ι,2μ L 10 X buffer，5 μ L 酶切物质，10 μ L PCR 水。37°C，酶切 90min。参照胶回收试剂盒进行酶切产物回收，获得相应双酶切基因片段。
[0028]T4 DNA连接酶连接pCold-TF空载体。连接体系为:1.5 μ L Τ4 DNA连接酶，2 μ L10ΧΤ4 DNA连接酶buffer，1.5μ L 50%的聚乙二醇(PEG)，5 μ L双酶切的载体，10 μ L上述双酶切基因片段，室温连接，得到含有重组原核表达质粒pCold-TF-Zi/^的连接体系产物。
[0029]3、得到阳性重组质粒pCold-TF-Zi/7
(一)取1(^1^含有重组原核表达质粒？(:01(^^-^/?的连接体系产物加入IOOyLDH5 α感受态细胞，混匀，冰浴20min，转入42°C热激90s。
[0030](二)将上述热激后的产物加入ImL LB液体培养基,置于37°C恒温振荡培养箱中培养lh。从中取200 μ L涂布在含氨苄青霉素的LB固体培养基的培养皿上，用胶带密封。放在37°C恒温培养箱中倒置培养12~16h。挑取7~8个单菌落至5mL含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C震荡培养12~16h，所述LB固体培养配方为，蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠0.5g，0.75g琼脂粉，加水50ml。
[0031]以菌液为模板进行PCR扩增初步验证阳性菌株，得到阳性克隆的DH5 α。
[0032]PCR 扩增引物为:正向引物:5’ - aactcgagatggcatttaaacagctttttgcgg - 3，，反向引物:5’ - aaggatcccgctcccggaggcggtgg - 3’。所述 PCR 扩增的体系为 50 μ L 体系:IOXbuffer 5 μ L, dNTP 2.5 yL，正向引物 0.75 yL，反向引物 0.75 “1^，酶0.75 μ L,模板5 μ L,加水补足至50 μ L0
[0033]所述PCR运行的程序:预变性温度为94°C，时间为5min ;变性温度为94°C，时间为30 s ;退火温度为56°C，时间为30s ;延伸温度为72°C，时间为70s ;循环34次；后延伸温度为72°C，时间为5 min ;12°C低温保存。
[0034]所述PCR产物的证实通过1%琼脂糖凝胶电泳:量取0.4 g琼脂糖至锥形瓶中，加Λ40 mL TBE电泳缓冲液，置于微波炉中，调至高火，煮2min左右，至透明，取出。胶制好后，点样，盖好电泳槽，开启电源，10 min左右，观察电泳结果。
[0035](三)碱裂解法对上述阳性克隆的DH5α提取重组质粒。
[0036](四)重组质粒进行I和通οI双酶切鉴定，鉴定结果如图1所示。对目的片段送上海生物工程公司进行测序验证，得到阳性重组质粒pCold-TF-Zi凡
[0037]4、将阳性重组质粒pCold-TF-Zi/^转化进大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于含100 mg/L氨苄青霉素的固体LB培养基上筛选阳性工程菌，得到表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。检测重组表达载体PCold-TF-ZiP是否构建成功，检测结果如图2所示。
[0038]实施例2
上述大肠杆菌工程菌在表达木质素过氧化物酶中的应用
将实施例1制备的大肠杆菌工程菌接种于LB液体培养基，含氨苄青霉素100mg/L，37°C, 200 rpm，培养至OD6tltl约为0.6左右，加入蛋白诱导剂IPTG，16°C，200 rpm，诱导重组蛋白表达12~16 h。所述LB液体培养基的配方为:蛋白胨0.5g，酵母提取物0.25g，氯化钠 0.5g,加水 50ml ο
[0039]实施例3
木质素过氧化物酶的分离提纯
将实施例2诱导培养后的的大肠杆菌工程菌装入离心管中，12000rpm离心lmin，弃上清液，加入PBS缓冲液重悬，超声破碎，加入ImL镍柱，进行纯化。
[0040]将实施例2诱导培养后的的大肠杆菌工程菌，1000Orpm离心5min,离心收集并分析蛋白可溶性，超声破碎，分别取总蛋白、上清液和沉淀进行SDS-PAGE蛋白电泳分析，具体结果如图3所示，表明该木质素过氧化物酶蛋白能够在大肠杆菌BL21中高效表达。
[0041]实施例4
大肠杆菌工程菌分泌的木质素过氧化物酶酶活的测定
木质素过氧化物酶酶活的测定采用VA (藜芦醇)为底物的方法:
取 10 mmol/L 藜芦醇溶液 0.6 mL、250 mmol/L 酒石酸缓冲液(pH=3.0) 1.2 mL> 10 μ L实施例3得到的酶液与10 μ L FeSO4溶液(0.01g/mL)混匀。在室温下，往上述体系中加20mmol/L H2O2溶液60 μ L。同时以未加H2O2溶液的上述体系为参比，于310nm处，使用紫外分光光度计测定3min前后反应体系吸光度的变化情况。酶活力单位(U):每分钟催化藜芦醇形成I μ mol藜芦醛所需的酶量。计算中的ε 31(1=9300 πιο1.cnT1。通过上述方法测得的酶活为352U/L
【权利要求】
1.一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌，其特征是，制备方法是: (O克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的CDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase LG3，蛋白序列为 SEQ ID N0:01 ； (2)用BeuM I和通ο I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4DNA连接酶连接pCold-TF载体，得到重组原核表达质粒pCold-TF-Zi产； (3 )鉴定重组原核表达质粒pCo I d-TF-Zi^是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCold-TF-Zi/7 ； (4)将阳性重组质粒pCoId-TF-ZiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。
2.一种表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是， (O克隆黄孢原毛平革菌木质素过氧化物酶的基因的cDNA，所述木质素过氧化物酶为Ligninase LG3，蛋白序列为 SEQ ID N0:01 ； (2)用及I和通ο I双酶切克隆的上述cDNA，获得相应酶切片段，将酶切片段用T4DNA连接酶连接pCold-TF载体，得到重组原核表达质粒pCold-TF-Zi产； (3 )鉴定重组原核表达质粒pCo I d-TF-Zi^是否阳性表达，得到阳性重组质粒pCold-TF-Zi/7 ； (4)将阳性重组质粒pCoId-TF-ZiP导入至大肠杆菌BL21感受态细胞中，获得表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌。
3.如权利要求2所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是，所述cDNA序列为SEQ ID N0:02。
4.如权利要求2所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是，鉴定重组原核表达质粒pCold-TF-Zi/^是否阳性表达的方法为: (一)热击法将重组原核表达质粒pCold-TF-Zi/^导入至DH5a感受态细胞中； (二)菌液PCR扩增鉴定，得到阳性克隆的DH5a ； (三)碱裂解法对上述阳性克隆的DH5a提取重组质粒； (四)重组质粒进行ifeMlI和ZA0 I双酶切鉴定，对目的片段进行测序，测序正确的重组质粒为阳性重组质粒pCold-TF-Zi/7。
5.如权利要求4所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌的制备方法，其特征是，步骤(二)的菌液PCR扩增鉴定使用的正向引物为5’ - aactcgagatggcatttaaacagctttttgcgg - 3，，反向引物为 5，- aaggatcccgctcccggaggcggtgg - 3，。
6.如权利要求1所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌在表达木质素过氧化物酶中的应用。
7.如权利要求6所述的表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌在表达木质素过氧化物酶中的应用，其特征是，将表达木质素过氧化物酶的大肠杆菌工程菌接种于含有氨苄青霉素的液体培养基中，培养，加入蛋白诱导剂IPTG，分离提纯，得到表达的木质素过氧化物酶。
8.如权利要求7所述的应用，其特征是，液体培养基为LB液体培养基，氨苄青霉素的浓度为80~120mg/L，培养温度为35~37°C。
9.如权利要求7所述的应用，其特征是，培养至OD6tltl为0.58~0.62时加入蛋白诱导剂 IPTG ，16°C 培养。
【文档编号】C12N9/08GK103540606SQ201310544399
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年11月6日 优先权日:2013年11月6日
【发明者】陈明, 晏铭, 曾光明, 杜长青, 张嘉超, 鲁伦慧, 朱艺, 赖萃, 许飘, 武海鹏 申请人:湖南大学