一种强广谱启动子及其应用的制作方法

本发明涉及一种强广谱启动子及其应用，属于基因工程领域。

背景技术：

启动子是位于结构基因5'端上游的dna序列，能活化rna聚合酶，使之与模板dna准确的结合并具有转录起始的特异性。由于不同宿主之间rna聚合酶存在不同程度的差异，因此，它们所识别的启动子也存在着保守序列上的差异，导致目前所鉴定的启动子只能在某一特定宿主或少数几个宿主中具有活性。

随着分子生物学的不断发展，分子改造工具的开发以及代谢途径的优化正成为目前的主流研究方向。但是，由于启动子的宿主范围的限制，导致目前所开发的改造工具和优化后的合成途径只能在某一特定范围宿主内使用，大大限制了其应用范围，严重的降低了一些研究的重要意义。目前关于多宿主启动子仅有的一些少量的报道，且主要集中于细菌范围内的广谱启动子构建，如大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭启动子pveg，还没有原核细菌和真菌之间穿梭启动子的报道。因此，一个具有在包含革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌和酵母菌的广泛宿主范围内具有活性的启动子具有很大的研究意义和应用价值。

技术实现要素：

为了满足目前对广谱的分子改造工具和基因表达框的需求，本发明提供了一个强广谱启动子，并将其应用至广谱表达框和广谱质粒的构建。

本发明的第一个目的是提供一个广谱启动子，该启动子在多个宿主具有启动子的活性，使下游基因得到表达的能力。

在本发明的一种实施方式中，所述广谱启动子为psh，其序列如seqidno.1所示，该启动子在革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌中均具有启动子活性。

本发明的第二个目的是提供一种强广谱启动子的构建方法：

(1)挑选一个具有高活力的酿酒酵母启动子；

(2)在上述启动子非核心区域插入原核细菌启动子保守序列；

(3)将构建好的新启动子和荧光蛋白基因相连，其中采用原核细菌通用的核糖体结合位点；

(4)将启动子和荧光蛋白基因一起分别插入到多个宿主的表达载体上，并转入相应宿主，通过荧光显微镜和荧光酶标仪来进行定性和定量。

在本发明的一种实施方式中，所述真核启动子是报道的酿酒酵母启动子pmin，其序列如seqidno.2所示。在本发明的一种实施方式中，所述原核细菌启动子保守序列是指包含ttgaca和tataat两段dna序列，其间隔的序列如seqidno.3所示。在本发明的一种实施方式中，所述的原核细菌通用核糖体结合位点，序列如seqidno.4所示。

本发明的第三个目的是提供一种强广谱启动子的应用，所述的广谱启动子psh在革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌中均具有很强的启动子活力。

在本发明的一种实施方式中，常见强启动子pj23119(seqidno.7)主要应用在革兰氏阴性细菌大肠杆菌中，在其他菌种中不具有启动子的作用；强启动子p43(seqidno.8)主要应用在革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌中，在其他菌种中不具有启动子的作用；强启动子pgpd(seqidno.9)主要应用在真菌酿酒酵母中，在其他菌种中不具有启动子的作用。所述强广谱启动子为psh，其序列如seqidno.1所示，该启动子在革兰氏阴性细菌大肠杆菌中与强启动子pj23119相比、在革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌中与强启动子p43相比和真菌酿酒酵母中与强启动子pgpd相比均具有强度相当或更强的启动子活性。

在本发明的一种实施方式中，强广谱启动子应用于一种广谱遗传霉素抗性基因表达框，其序列如seqidno.5所示，包含强广谱启动子、原核细菌通用核糖体结合位点、遗传霉素抗性基因、原核转录终止子和真核转录终止子。该广谱遗传霉素抗性基因表达框能够在革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌和真菌中表达。

在本发明的一种实施方式中，所述强广谱启动子，其序列如seqidno.1所示。在本发明的一种实施方式中，所述原核细菌通用核糖体结合位点，其序列如seqidno.4所示；所述遗传霉素抗性基因，其序列如seqidno.10所示；所述原核转录终止子，其序列如seqidno.11所示；在本发明的一种实施方式中，所述真核转录终止子，其序列如seqidno.12所示。

在本发明的一种实施方式中，强广谱启动子应用于一种大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母穿梭载体，包含有大肠杆菌载体puc18复制子、枯草芽孢杆菌载体pub110复制子、酿酒酵母载体py26复制子和广谱遗传霉素抗性基因表达框。该穿梭载体在遗传霉素筛选条件下能够在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中稳定遗传。

有益效果：

本发明根据文中所述的强广谱启动子构建方法成功构建了一个强度很高的广谱启动子psh，该启动子在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中均具有很强的启动子活力。通过荧光蛋白的表达结果分析，在大肠杆菌中，psh是强pj23119中活力的2.1倍；在枯草芽孢杆菌中，psh是强启动子p43活力的1.2倍；在酿酒酵母中，psh是强启动子pgpd的1.1倍。

本发明根据所获得的强广谱启动子构建了广谱的遗传霉素抗性基因表达框，该表达框能在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中表达。据此本发明还构建了一个大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母穿梭载体，该载体能够在具有遗传霉素筛选条件下在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中稳定存在。

附图说明

图1：e.coli/py26-psh-gfp绿色荧光蛋白表达

图2：s.cerevisiae/py26-psh-gfp绿色荧光蛋白表达

图3：s.cerevisiae/py26-pmin-gfp绿色荧光蛋白表达

图4：b.subtilis/pucb18-psh-gfp绿色荧光蛋白表达

具体实施方式

具体实施方式中涉及的引物序列如表1所示。

表1引物列表

菌株的培养条件：

lb培养基(l)：10g蛋白胨，5g酵母膏，10g氯化钠。

ynb培养基(l)：1.74gynb，5g硫酸铵，20g葡萄糖，50mg亮氨酸，50mg组氨酸，50mg色氨酸。

ypd培养基(l)：20g蛋白胨，10g酵母膏，20g葡萄糖。

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌培养条件：37℃，220rpm；酿酒酵母培养条件：30℃，220rpm。菌株培养过程中添加相应浓度的抗生素以维持其质粒稳定性。

荧光强度测定方法：

将发酵液离心10min(10000×g，4℃)，吸取上清液200μl用nunc96孔黑色酶标板进行荧光检测，检测时做4个复孔，所用仪器为bioteksynergy4多功能酶标仪，操作软件为gen5。荧光强度参数设置为，激发：488/9nm发射：509/9nm,顶端发光，氚气灯，增益为自动调整增益。

实施例1广谱启动子的构建

人工合成设计的启动子psh(如seqidno.1所示)和pmin(如seqidno.2所示)，以#1和#2，#3和#2为引物，通过pcr扩增，随后与以#4和#5为引物，通过pcr扩增的绿色荧光蛋白gfp(如seqidno.13所示)dna片段进行融合，构建psh-gfp表达框和pmin-gfp表达框。通过#6和#7、#8和#9为引物扩增psh-gfp表达框，随后分别插入到bamhi/sacii酶切过的大肠杆菌和酿酒酵母穿梭载体py26和bamhi/psti酶切的枯草芽孢杆菌质粒pucb18中，产生重组质粒py26-psh-gfp、pucb18-psh-gfp、py26-pmin-gfp和pucb18-pmin-gfp，之后以py26-psh-gfp和pucb18-psh-gfp为模板，以为#10和#11，#10和#12引物，pcr获得质粒骨架，然后通过磷酸化后自连接的方法分别从py26-psh-gfp和pucb18-psh-gfp两个质粒上去除启动子psh，产生质粒py26-gfp和pucb18-gfp。

然后将py26-psh-gfp、py26-gfp和py26-pmin-gfp转到大肠杆菌中，通过在含有100mg/l氨苄青霉素的lb培养基中培养，24h后，采用荧光显微镜分析，发现e.coli/py26-psh-gfp(图1)中有绿色荧光蛋白表达，而e.coli/py26-pmin-gfp和e.coli/py26-gfp中均为荧光蛋白表达。结果表明，pmin启动子在大肠杆菌中没有启动子活力，而psh在大肠杆菌中有启动子活力。

将py26-psh-gfp、py26-gfp和py26-pmin-gfp转到酿酒酵母菌中，通过分别在尿嘧啶缺失的ynb培养基中培养，24h后，采用荧光显微镜分析，发现s.cerevisiae/py26-psh-gfp(图2)和s.cerevisiae/py26-pmin-gfp(图3)均有绿色荧光蛋白表达，且荧光强度接近，而s.cerevisiae/py26-gfp无绿色荧光蛋白表达。结果表明，pmin在酿酒酵母中是强启动子。

随后将pucb18-psh-gfp、pucb18-pmin-gfp和pucb18-gfp转入枯草芽孢杆菌，通过在含有50mg/l卡那霉素的lb培养基中培养，24h后，采用荧光显微镜分析，发现b.subtilis/pucb18-psh-gfp(图4)中绿色荧光蛋白得到表达，而对照b.subtilis/pucb18-gfp和b.subtilis/pucb18-pmin-gfp中均无绿色荧光蛋白表达。结果表明，pmin启动子在枯草芽孢杆菌中没有启动子活力，而psh在枯草芽孢杆菌中有启动子活力。

以上结果表明psh在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中具有启动子活力。

实施例2广谱启动子的强度分析

以#13和#14为引物，pcr扩增大肠杆菌强启动子pj23119(如seqidno.7所示)dna片段，以#15和#16为引物，pcr扩增绿色荧光蛋白gfp基因(如seqidno.13所示)dna片段，通过融合pcr产生pj23119-gfp表达框，插入到bamhi/sacii酶切的py26-psh-gfp质粒上，同时替换掉原有psh启动子，产生py26-pj23119-gfp质粒。

将质粒py26-pj23119-gfp转入大肠杆菌中，与e.coli/py26-psh-gfp同时在含有100mg/l遗传霉素的lb培养基中培养，12h后通过荧光酶标仪测定荧光强度，结果显示:e.coli/py26-psh-gfp与e.coli/py26-pj23119-gfp的相对荧光强度分别为15370和7318，因此e.coli/py26-psh-gfp的荧光蛋白含量使e.coli/py26-pj23119-gfp的2.10倍，psh是强pj23119中活力的2.10倍。

以#17和#18为引物，pcr扩增枯草芽孢杆菌强启动子p43(如seqidno.8所示)dna片段，以#19和#20为引物，pcr扩增绿色荧光蛋白gfp基因(如seqidno.13所示)dna片段，通过融合pcr产生p43-gfp表达框，插入到bamhi/psti酶切的pucb18-psh-gfp质粒上，同时替换掉原有psh启动子，产生pucb18-p43-gfp质粒。

将质粒pucb18-p43-gfp转入枯草芽孢杆菌中，与b.subtilis/pucb18-psh-gfp同时在含有100mg/l遗传霉素的lb培养基中培养，12h后通过荧光酶标仪测定荧光强度，结果显示:b.subtilis/pucb18-psh-gfp与b.subtilis/pucb18-p43-gfp的相对荧光强度分别为10711和8852，因此，b.subtilis/pucb18-psh-gfp荧光蛋白含量是b.subtilis/pucb18-p43-gfp的1.21倍，psh是强启动子p43活力的1.21倍。

以#21和#22为引物，pcr扩增酿酒酵母强启动子pgpd(如seqidno.9所示)dna片段，以#23和#24为引物，pcr扩增绿色荧光蛋白gfp基因(如seqidno.13所示)dna片段，通过融合pcr产生pgpd-gfp表达框，插入到酶切的py26-psh-gfp质粒上，同时替换掉原有psh启动子，产生py26-pgpd-gfp质粒。

将质粒py26-pgpd-gfp转入大肠杆菌中，与s.cerevisiae/py26-psh-gfp同时在含有400mg/l遗传霉素的ypd培养基中培养，12h后通过荧光酶标仪测定荧光强度，结果显示:s.cerevisiae/py26-psh-gfp与s.cerevisiae/py26-pgpd-gfp的相对荧光强度分别为7377和6587，因此，s.cerevisiae/py26-psh-gfp荧光蛋白含量是s.cerevisiae/py26-pgpd-gf的1.12倍，psh是强启动子pgpd的1.1倍。

以上结果表明：启动子psh在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中均为强启动子。

实施例3广谱遗传霉素抗性基因表达框的构建

以#25和#26为引物，pcr扩增强广谱启动子psh(如seqidno.1所示)dna片段，以#27和#28为引物，pcr扩增遗传霉素抗性基因kanr(如seqidno.10所示)dna片段，以#29和#30为引物，pcr扩增人工合成的原核终止子t0(如seqidno.11所示)和真核终止子te(如seqidno.12所示)dna片段，通过融合pcr产生psh-kanr-t0-te(如seqidno.5所示)表达框，该表达框为广谱的遗传霉素抗性基因表达框。

实施例4大肠杆菌/枯草芽孢杆菌/酿酒酵母穿梭载体的构建

以#31和#32为引物，pcr扩增大肠杆菌质粒puc18复制子dna片段，以#33和#34为引物，pcr扩增枯草芽孢杆菌质粒pub110复制子dna片段，以#35和#36为引物，pcr扩增酿酒酵母质粒py26复制子dna片段，将上述三个不同质粒的复制子dna片段与广谱的遗传霉素抗性基因表达框psh-kanr-t0-te(如seqidno.5所示)进行重组。重组产物转入大肠杆菌后在遗传霉素平板上进行筛选，进而获得质粒pebs(如seqidno.6所示)。将pebs分别转入枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中，发现均有阳性克隆长出，将阳性克隆挑选并提取质粒验证，发现pebs质粒能在枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中稳定遗传。

以上结果表明：pebs质粒是一个只有一个抗性基因筛选标记的大肠杆菌/枯草芽孢杆菌/酿酒酵母三穿梭载体，同时psh-kanr-t0-te是广谱的遗传霉素抗性基因表达框。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>江南大学

<120>一种强广谱启动子及其应用

<160>15

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>120

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

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<211>123

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<213>人工合成

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<212>dna

<213>人工合成

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<210>4

<211>13

<212>dna

<213>人工合成

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<213>人工合成

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