盐芥v-焦磷酸酶基因启动子序列和其缺失突变体的应用的制作方法

专利名称：盐芥v-焦磷酸酶基因启动子序列和其缺失突变体的应用的制作方法
技术领域：
本发明属农作物和林木的生物工程育种领域，具体说，涉及一种植物基因启动子序
列(盐芥编码液泡膜焦磷酸酶基因^r/7启动子的序列)的克隆、改造和应用。
背景技术：
盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，土壤中高浓度Na+对许多植物的生长和 发育造成很大的伤害。土壤盐碱化和次生盐碱化问题，已经成为世界灌溉农业可持续发 展的制约因素。随着人口的增长以及水资源的匮乏，提高水资源利用效率、充分开发和 利用盐碱地已成为关系国计民生的重要课题。近年来，随着对拟南芥、水稻等模式生物 的深入研究和生物技术的迅速发展，已为培育高度盐耐性作物新品种提供了新思路、新 方法和新材料，利用分子生物学方法和手段发现新的遗传资源是培育高度耐盐耐旱新品 种的重要环节。
随着分子生物学技术以及植物基因工程的迅速发展，利用转基因技术来改变一些作 物的性状，提高其对外界胁迫条件的耐受性从而增加作物的产量己经成为一种重要的技 术。外源基因在转基因植物中低水平表达和非特异性表达是制约植物基因工程发展的一 个重要因素，主要原因是缺少理想的启动子。
常见的启动子可分为组成型启动子、组织特异启动子和诱导表达启动子。不同启动 子启动的基因表达强度有很大差别，往往具有明显的种属特异性。在某些情况下， 一种 类型的启动子往往兼有其他类型启动子的特性。组织特异启动子由于其表达的空间特异 性，可将外源基因在转基因植物中定位表达，这不但可以降低植物负担、减轻对作物农 艺性状的影响，而且可以提高外源基因产物在特定部位的浓度，增加转基因的效果。目 前组织特异性启动子主要应用在以下几方面:①提高作物的抗冻、抗旱、抗盐能力和防 止水果腐烂，②改良花丼品质、控制观赏花齐的颜色，③提高植物的抗病性、抗虫性和 抗除草剂能力，④开发生物反应器用于生物制药，⑤创建雄性不育系和恢复系，⑥用于 植物的分化发育研究等(王瑞琲，2008)。诱导型启动子可使转基因在特定条件下表达， 在植物抗逆基因工程中急待开放应用。巳报道的诱导型启动子有胁迫诱导启动子和化学 物质诱导启动子两大类，前一类包括热诱导启动子、冷诱导启动子、干早诱导启动子、 损伤诱导启动子等，后一类有激素诱导启动子、乙醇诱导启动子、固醇诱导启动子等。 尽管目前已有一定数量的器官特异性启动子和诱导表达的启动子，但在多数工作中，所 用的启动子仍为组成型启动子，如花椰菜花叶病毒35SRNA基因启动子(CaMV35S)、玉 米泛素基因启动子(Ubil)，水稻肌动蛋白基因启动子(Actl)等，其主要原因是可用 的诱导型启动子和组织特异性启动子或受专利保护或启动子的启动能力较弱。
在植物基因工程中大量应用组成型启动子，使用组成型强启动子可以提高外源基因 的表达强度，在一定程度上对目的基因的表达有很强的促进作用，但是随之也带来了一 些问题，如组成型启动子使基因产物在宿主的整个生命周期以及所有的组织器官持续表 达不仅造成了宿主体内资源的浪费，而且往往导致转基因材料的某些性状的改变。影响转基因材料正常的生长发育，使其出现发育迟缓，植株矮化等现象。如Shan等在棉花 中组成型表达GhDREBl基因，虽然提高了植物的抗逆性，但是其开花期与对照植株相比 明显推迟。Nakashima等在水稻中用玉米的泛素基因启动子组成型表达0sNAC6基因，造 成植株生长期延长，产量降低。此外，组成型表达一些基因虽然可以增加作物的抗逆性， 但是对转基因作物的安全性也造成一定的影响，比如组成型表达抗虫基因可以在一定程 度上防止病虫害，但是由于果实或者种子中也存在该蛋白，往往为转基因材料的释放造 成一定的困难。
近年来，越来越多的科研者乐意采用诱导型启动子或者组织特异性启动子构建植物 表达载体。与组成型表达启动子相比，它们启动的转基因只有在特定的环境下或者在特 定的组织中才有高强度表达，因此可以根据实验需要来控制目的基因的时空表达。Liu 等利用组成型启动子CaMV35S和胁迫诱导型启动子RD29A分别启动下游基因AtbZIP17 构建载体并转化拟南芥，结果表明这两种组合均可提高拟南芥的抗逆性，但是在正常生 长条件下，组成型表达该基因导致转基因材料发育迟缓，但是诱导型表达该基因则没有 这种状况。同样，Kazuo等人在水稻中过表达0sNAC6基因，利用组成型启动子导致水稻 生长延迟产量降低,但是利用其本身的启动子就可以解决这个问题。Aryadee等在烟草中 利用其本身启动子表达基因Rabl6A，只有在胁迫条件下该基因才能在叶中大量表达，从 而提高其抗逆性，而且转基因植株与对照相比其形态发育以及产量都没有受到影响。
虽然诱导型启动子与组成型启动子相比具有很多优点，但是目前已知的诱导型启动 子很少，应用比较广泛的主要还是RD29A等比较经典的启动子，而我国具有自主知识产 权的胁迫诱导型启动子更是少之又少，因此克隆鉴定新的胁迫诱导型启动子序列并找出 其中的核心作用元件具有重要的意义。
盐芥是一种生长于盐碱地中的拟南芥近亲物种，也是研究植物抗逆机制的重要模式 植物。盐芥和拟南芥的cDNA序列相似性非常高，但是盐芥对于非生物胁迫的抗逆性要 远远高于拟南芥，申请人克隆了盐芥中编码液泡膜焦磷酸酶的基因并对其进行了 功能分析。该基因在拟南芥中的同源基因是AVP1。将这两个基因分别转入酵母盐敏感突 变体，发现它们均能明显提高酵母的抗盐性；在烟草中分别过表达这两个基因也可显著 提高烟草的耐盐性，表明这两个基因的功能具有很高的相似性。分别检测这两个基因在 盐芥和拟南芥中的表达模式发现，在盐胁迫条件下，^K/^基因的表达受到明显的诱导 作用，而AVP1的表达基本没有变化。这说明二者的基因表达调控机制存在很大的差异， 克隆rsK尸7基因的启动子序列并对其进行功能分析，寻找其中的关键作用元件具有重要 的意义。
高等植物启动子一般由两部分组成 一部分是形成普遍性转录结构所需要的，通常 称为核心启动区，包括转录起始点及邻近的TATA框；另一部分是决定基因转录特异性 和活性的区域，由多个保守序列组成，这些保守序列在不同启动子的位置、种类及拷贝 数存在较大差异。两部分都参与基因转录的调控，但后一部分起主要的控制作用，寻找 启动子中的关键作用元件对于启动子的改造和利用具有重要意义。

发明内容
针对目前的研究现状，本发明的目的是提供一种植物基因启动子序列(盐芥编码液 泡膜焦磷酸酶基因7^F尸/启动子的序列)及其改造和应用。本发明所述的盐芥v-焦磷酸酶基因启动子及其缺失突变体的应用方法是从盐生植
物盐芥克隆V-焦磷酸酶基因启动子序列并进行生物信息学分析。
大体步骤是从盐生植物盐芥的基因组文库中筛选出携带7JF尸/启动子的克隆，截取 7SF尸/开放读码框5'上游的2200核苷酸序列作为全长启动子序列，以此为模板通过PCR 扩增获得不同长度的启动子片段T2 T7，分别将其与报告基因融合后转入拟南芥，确定 了 KF尸7启动子和其部分系列缺失突变体是盐胁迫诱导型启动子，其中T5启动子具有 较强的根特异性；7SPT7启动子和T5启动子分别与来自大肠杆菌的^"基因相连转入 烟草和玉米，确定了它们在转基因烟草和玉米中能正常行使启动功能，是盐胁迫诱导型 的强启动子。
其中，所述V-焦磷酸酶基因启动子全长序列为V-焦磷酸酶基因(R『"上游2200 bp的序列(其序列如序列表SEQIDNO. 3所示)。利用PLANTCARE在线分析软件分 析发现，该序列中存在多个调控元件，包括厌氧诱导响应元件ARE，干旱诱导响应元件 MBS， ABA响应元件ABRE，热诱导响应元件HSE，水杨酸响应元件TCAelement,茉 莉酸响应元件CGTCAmotif，光诱导响应元件SP1 ， ACE， AE-box, G-box等(见附图1 )。
其中，缺失突变体的构建是根据生物信息学分析结果，利用这些预测元件的间隔区 域设计上下游引物，通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段，产生成套缺失突变体(附 图2)，并将它们分别连接进入植物表达载体pCAMBIA1391z中的多克隆位点，而多克隆 位点的下游为GUS报告基因，即插入多克隆位点的启动子片段与^ys基因形成融合基因。
其中，所述用于构建融合基因的启动子可为启动子的全长序列，也可以为部分序列， 也可以为根据部分序列人工合成的脱氧多核苷酸。
所述的应用方法是通过在转基因植株中检测融合基因的表达来确定启动子序列的 功能及利用价值。
其中，所述的应用方法还可以是通过转融合基因获得对逆境抗性提高或降低的转基 因植株及后代。
本发明所克隆的盐芥启动子序列用于构建植物表达结构，插入植物表达载体后转入 农杆菌GV3101，通过花序侵染法转化拟南芥。转化植株产生的种子在加有抗生素的琼脂 培养基平板上筛选，萌发的小苗移栽到营养土中，成活后进行PCR检测，筛选转基因植 株。转基因植株连续自交2代产生纯合系。后者用于转基因表达强度分析。同时将克隆 的拟南芥」vA/基因的启动子序列与报告基因相连，构建融合基因ZrA -g"s的植物表达 载体，通过转基因植株中两个同源基因表达模式上的差异分析它们启动子功能的差异及 各自的利用价值。
本发明所说的启动子控制的表达模式分析，包括对7iPT7-Tl(全长启动子连接GUS 基因)转基因植株的染色分析，确定该启动子启动基因的表达部位，包括拟南芥根、茎、 叶、花和荚果，发现在根和叶中GUS表达强度要高于其他器官。根染色结果的组织学观 察表明，在根部GUS表达主要分布在中轴部位,根表皮和皮层组织中的表达量低。并且 在侧根发生部位，GUS表达强度要明显高于主根的其它部位。
本发明所说的植物抗逆性是指植物在整株、器官和/或细胞水平上表现出的耐(抗) 旱性、耐(抗)盐性、耐冷性、抗寒性、耐涝性、耐热性、抗(耐)辐射性、抗病性、 抗虫性、抗除草剂等特性及其组合。这种抗(耐)性在植株水平上可表现在某些发育阶段或全生育期，可通过多种指标衡量或评价。
本发明所说的植物主要指高等植物，包括各类作物和经济植物、观赏植物、生态植物、杂草等；包括被子植物、裸子植物；包括草本和木本植物等。
V-焦磷酸酶基因编码区5'上游区域的克隆和分析
用购自Merck公司的人BlueSTARTM Xho I Half-site Arms KIT和PhageMaker KIT
构建盐芥小片段基因组文库。从盐芥叶片提取基因组DNA，用限制酶y^oI部分消化。对部分酶解DNA的部分末端补平，然后在0.6%低熔点琼脂糖凝胶进行电泳，电泳完成后用手术刀切下含有10-23 Kb DNA片段的凝胶块回收DNA，回收产物纯化后用于连接反应。连接反应分别在3个无菌的0. 5 mL的离心管中独立进行。每管A -噬菌体载体1 (500ng~L)，基因组DNA片段分别为2、 4、 6 pL， lnLT4DNA连接酶，加无菌水至体积10pL，于4 °C连接16-24 h。然后将连接产物小心的加到50 |iL融化的包装提取物中，加入500 SM buffer(50 mM Tris-Cl, pH 7.3,100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 0.01%Glutin)，轻轻涡旋混匀，加入25pL氯仿，轻轻涡旋混匀后分为120个亚库保存在4 °C
备用o
根据盐芥TsVPl基因的序列信息，在其5'端设计PCR引物PTsVP-Pl (5'GTGGCGTCGGCGTTTCTTC 3')和PTsVP-P2 (5' CTTGGCGACGACACTCTGC 3'),
采用PCR方法分级筛选盐芥基因组文库。PCR阳性的亚库分成次级库再次进行筛选，经过3级筛选后对阳性亚库铺平板进行噬菌斑印迹法筛选。滤膜印迹时，噬菌斑直径大约0.5-0.8咖，分散良好，互不相连。滤膜吸印前应将平板预先放入4 。C至少1 h，然后将尼龙膜覆盖在长有适量噬菌斑的平板上，用3个不对称小孔进行定位。膜全部浸湿后继续在平板上放置l min。取出尼龙膜，印迹面朝上，室温放置IO miri晾干。
取1 ng回收的TsVPlcDNA，采用罗氏公司(Roche)的DIG-High Prime KIT进行探针标记，标记的方法见试剂盒说明书。杂交、显色使用Roche公司的DIG Nuceic AcidDetection KIT,操作过程和方法见试剂盒说明书。
用原位杂交的方法来分离阳性噬菌斑，杂交时，将尼龙膜依次放在被变性液(0.5MNa0H， 1. 5 M NaCl)饱和的滤纸上5 min，中和液(0.5 MTris'Cl， pH7.4; 1.5MNaCl)饱和的滤纸上5min，重复一次；然后将膜在2XSSC溶液中洗涤5min。尼龙膜处理完毕后，室温放置30min晾干，然后置于80。C烘干2 h，用保鲜膜包好，存放于4 。C备用。随机挑取阳性噬菌斑，将其转换为XBlueSTAR质粒。获得入BlueSTAR质粒后，对插入片段进行测序，得到基因编码区上游5452 bp的序列。
通过对盐芥TsVPl基因启动子序列进行Blast比对分析，其近5'端850核酸序列与拟南芥AT1G15670有很高的相似性(87。/。)。对盐芥TsVPl基因及其上游基因间隔区的4587 bp和拟南芥AVP1基因及其上游基因间隔区的4475 bp的核苷酸序列进行比对分析，发现盐芥丁^ 1基因的启动子序列与拟南芥『- 3犯基因」^7的启动子序列的相似性很低(〈10%)。通过NSITE-PL(http:〃www. softberry. com)程序分析启动子序列中的顺式作用元件，盐芥TsVPl基因启动子序列含有18个不同的顺式调控元件，拟南芥AVP1启动子序列中包含27个(可以和25个不同调控因子相互作用)顺式作用元件。其中有5个顺式作用元件(RSP00079， RSP00377, RSP00420， RSP00635, RSP00653)为两个启动子序列所共有。而且在盐芥TsVPl基因启动子序列中发现了多个胁迫相关顺式作用元件(如ABRE顺式作用元件RSP00049)。这两个基因启动子序列所包含的顺式作用元件的个数和种类
存在着巨大差异，与它们的不同表达模式相对应。
v-焦磷酸酶基因启动子的基本特征
根据测序和利用生物信息学工具分析结果，取近7iFP7基因开放读码框上游的2200bp的核甘酸序列(附图l)作为全长启动子，利用PLANTCARE在线分析软件对其进行生物信息学分析发现，在该启动子序列中存在的调控元件有厌氧诱导响应元件ARE，干旱诱导响应元件MBS， ABA响应元件ABRE，热诱导响应元件HSE，水杨酸响应元件TCAelement,茉莉酸甲酯响应元件CGTCA motif ，光诱导响应元件SP1、 ACE、 AE-box、 G-box等，推测该启动子控制的基因表达受到盐或干旱胁迫等的诱导。
v-焦磷酸酶基因启动子的成套缺失突变体构建和与报告基因的重组
根据V-焦磷酸酶基因7iFP7启动子序列，在预测的调控元件的间隔区域设计上下游引物，采用常规的分子克隆技术通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段，分别连接到植物表达载体，如pCam系pCAMBIA1391z和pR0K2的报告基因^/s上游的多克隆位点处，构建出成套缺失突变体。
用构建好的重组质粒转化大肠杆菌DH5a ，筛选转化克隆，提取重组质粒进行测序，然后选择重组正确的质粒采用冻融法转化农杆菌GV3101 。将克隆的拟南芥基因的启动子序列也与报告基因相连，构建^kp7-^as基因表达载体，然后采用同样程序获得携带7^A -^vs基因表达载体的农杆菌。以农杆菌为中介将由不同启动子(片段)启动的gt/5基因分别转入拟南芥，检测不同启动子(片段)启动基因的表达模式。拟南芥转化采用花浸染法。
V-焦磷酸酶基因全长启动子表达模式分析
通过对转Tl (7JK尸7全长启动子连接^/s基因结构)结构的转基因拟南芥植株的GUS染色观察，发现该启动子启动的GUS表达部位包括根、茎、叶、花和角果。其中在根和叶中的表达强度要高于其他器官的。在根部，该启动子启动的GUS表达部位主要是根的中轴位置，根皮层组织中GUS表达量低，即染色很浅。在主根中，侧根发生部位GUS表达量要明显高于主根的其他部位。通过对转Tl结构植株的不同器官的GUS酶活性测定，进一步证实了该启动子启动的《"s基因在植株根和叶中的表达强度要高于其他器官的(附图3)。
将转Tl-g"s结构的拟南芥植株用200 mM NaCl处理，在处理3、 6、 12、 16和24小时分别取材测量GUS酶活性，同时进行染色观察。由酶活性测定结果得出，GUS表达在盐胁迫条件下得到明显的提高，在16小时活性达到最大值，此时植株地上部分的GUS活性约是未处理植株的4倍，根中约是未处理植株的6倍(附图4)。染色观察发现，在盐胁迫条件下，根中，尤其是根尖处GUS染色强度大幅度提高。由于未受盐胁迫处理植株的叶片，GUS的表达量已很高，通过染色很难看出盐胁迫处理后GUS染色强度的明显变化。
V-焦磷酸酶基因启动子缺失突变体的表达模式分析
将一系列的缺失突变体分别与^a 基因融合，转入拟南芥。对转基因植株进行染色
分析，发现T2片段(1517 bp)启动的卯s基因表达在叶中的表达强度要明显低于Tl的，而在T2片段、T3片段(905 bp)、 T4片段(788 bp)和T5片段(667 bp)分别启动的基因在表达特异性和强度方面彼此差异不明显。T6片段(537 bp)与T5片段的启动活性相比，根中GUS表达量明显要低。T6片段和T7片段(328 bp)启动的基因，在表达强度和特异性方面没有明显的区别。这些结果表明，与完整的"Z/^启动子相比，T2片段所缺少的序列中存在促进报告基因在叶中高强度表达的调控元件；而与T5片段相比，T6片段缺少的序列中存在促进报告基因在根中高效表达的元件。
对转基因植株进行染色分析，发现T2、 T3、 T4、 T5分别启动的^AS基因在盐胁迫条件下其表达强度有明显增加，在根尖处的增强作用非常显著。而对转T6—^^基因植
株进行分析发现，这种盐诱导作用消失。
比较T3片段和T4片段的序列，发现T3片段多出的部分存在与地上组织特异表达相关的作用元件。对该段序列进行的生物信息学分析发现，存在10个光响应元件、1个ABA响应元件、1个干旱响应元件、1个热响应元件和1个昼夜节律调控元件，还有与叶部栅栏组织发育相关的元件有2个、还有未知功能的元件3个。
在T5与T6的差异序列中，存在与根部特异表达相关的元件，存在响应盐胁迫的元件，后者可以使报告基因在盐胁迫的条件下在植株根尖部位的表达显著上调。对这段差异序列进行生物信息学分析，发现存在4个预测的作用元件，分别为光诱导响应元件G-box、茉莉酸甲酯响应元件CGCTA-box、与植物防卫以及胁迫响应相关的元件TC-richr印eats以及蛋白结合位点Box III。将这段序列(130 bp)与拟南芥中AVP1的启动子片段进行序列比对，发现这两段启动子片段具有较高的相似性，但存在着序列差异。
经济植物的遗传转化
采用农杆菌介导法获得转基因植物。常用的转化方法有通过花序侵染法转化拟南芥、茄科植物叶盘遗传转化法、禾谷类作物愈伤组织转化法及幼胚感染法、丛生芽块转化法、无菌苗生长点转化法等。通常采用PCR方法和分子杂交方法检测转化植株，获得阳性转化植株进行后续分析。以下以烟草叶盘遗传转化和玉米自交系无菌苗茎尖生长点转化法为例予以说明。
A .烟草叶盘遗传转化及转基因植株的分析
取烟草无菌苗为材料，利用叶盘法迸行转化。农杆菌菌株为LBA4404，携帯含有^as基因和植物筛选标记基因新霉素磷酸转移酶基因nptll的Mini-Ti质粒或植物抗逆相关基因6eM (编码来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶，催化由胆碱合成甘氨酸甜菜碱)和除草剂抗性基因，g"s基因和抗逆相关基因分别由TsVPl启动子或其缺失突变体片段启动。采用常规转化方法进行转化，转基因小芽在含有选择剂卡那霉素(Kan) 150 pg/ml的诱导培养基上筛选，在生根培养基上生根。采用PCR和Southern杂交分析法确定转基因植株。通过PCR方法检测出分别含g^基因或耐盐相关基因的阳性植株，以不含目的基因的空载体转化植株为对照。Northern杂交表明转基因在烟草中有很高的表达水平，而
未转基因植株和不含目的基因的空载体转化植株不出现杂交信号。转基因烟草植株的分析
为了确定转基因的表达特异性和表达强度，对于转gi/s基因的烟草小苗，检测根、叶片和叶柄的GUS酶活性。在正常生长条件下，转基因烟草根系的GUS酶活性在转TsVPl启动子和T5片段的植株之间差异不显著，而叶片和叶柄的GUS酶活性则是转TsVPl启动子植株的显著高于转T5片段植株的。用250 mM NaCl溶液浸泡转基因烟草小苗根系24小时，转基因植株根系、叶片和叶柄的GUS酶活性均大幅度升高。与转TsVPl启动子的植株相比较，转T5片段植株的根系GUS酶活性无明显差异，而叶片和叶柄的GUS酶活性升高幅度相对较小。即在转基因烟草中TsVPl启动子和T5启动子均具有盐诱导特性，但T5启动子有较强的根特异性。
将转^t/l基因和对照植株(空载体转化烟草和未转基因植株)的叶片切成0.5cm2的叶盘，分别在含1.0%、 1.5%、 2.0。/。和2.5。/。NaCl的培养基上进行培养，并测定其相对生长量。在含有1.0y。NaCl的培养基上，各种叶盘生长旺盛，产生愈伤组织继而分化成芽，彼此之间的相对生长量没有显著差别。在加有1. 5% NaCl的培养基上，转TsVPl启动子和T5启动子的烟草叶盘呈绿色，边缘有愈伤组织生成。在加有2.(F。NaCl的培养基上，各种叶盘间的生长状况差异明显，来自对照植株的叶盘约半数死亡，其余生长较差；转T5启动子的叶盘依然存活，生长较好；转TsVPl启动子的叶盘相对生长量明显高于来自转T5启动子的，远高于对照植株叶盘的相对生长量。即通过检测转6e"基因烟草叶盘的盐耐受性发现，转TsVPl启动子的烟草与对照植株相比，其耐盐性及耐旱性明显提高，而转T5启动子的烟草与对照植株相比耐盐性及耐旱性提高幅度不如转T5启动子的。用不含目的基因的空载体转化烟草未影响再生植株的生理指标，所以转基因烟草耐盐性及耐旱性的改变是由于转基因6e"的表达促成，转T5启动子的烟草叶盘耐盐性提高幅度较小与其启动的Ae"在叶片中表达强度较低相对应。
为了解由不同启动子启动的6e"基因对转基因烟草植株耐旱性影响的差异，将转基因烟草小苗置于含10% (W/V) PEG 6000的MS无机盐溶液中进行渗透胁迫处理，检测叶片相对含水量的变化。在渗透胁迫过程中，烟草叶片相对含水量逐渐降低，转TsVPl启动子植株相对含水量降低速率显著低于对照植株的，18 h后叶片相对含水量从渗透胁迫处理前的94%-99%降低为62%-66%，转T5启动子的叶片相对含水量从96%-98%降低为64%-65%，而未转基因对照植株叶片的相对含水量从94%-98%降低到54%-60%。这说明不同启动子启动的6e"基因在烟草叶片中的表达强度有差异，但启动子之间的差异达不到显著程度。
B.玉米自交系遗传转化及转基因植株的分析
套袋获取玉米骨干自交系或杂交种种子，用70%乙醇浸泡10分钟，再用0.1%氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40 mL水/250mL三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-3(TC)下l-2天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上，在黑暗条件下继续萌发。待胚芽伸长至3-5厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖生长锥。
将带有双元载体(Mini-Ti质粒或带有TsVPl启动子一6et4和除草剂绿黄隆抗性基因ah或T5启动子一^M和a7s， Ws基因来自抗绿黄隆的拟南芥植株并进过修饰，李国圣等，2000， <〈科学通报》，45: 2181-2184)的根瘤农杆菌(AGL1或LBA4404)在附加抗生素的YEP培养基中28°C震荡培养，使细菌处于对数生长期。然后在3000 r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2改良MS液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100 mg/1乙酰丁香酮的1/2 MS改良液体培养基悬浮，稀释5-20倍用于转化。转化时首先将菌液倒在培养皿中，倾斜培养皿，将露出茎尖生长锥的玉米无菌苗顶端减压浸泡在菌液中4-8分钟(AGL1 6分钟，LBA4404 8分钟)。然后将浸染后的芽尖用无 菌滤纸吸干，将根部插入改良MS培养基中于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24 °C， 然后将无菌苗放在散射光下培养2天，再将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石和 下层壤土的花盆中，蛭石覆盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28 °C， 夜温18-23 。C，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。
转化植株长出3片叶后，喷洒20—30 mg/l绿黄隆(用量因自交系抗性而变化，沈 阳农药厂生产，有效成分25%)水溶液，以未转化植株为对照。喷洒量以植株掉液滴为 宜。对照植株在喷洒后3天停止生长，12天左右开始死亡。转化处理后的植株， 一些个 体的变化与对照植株相似，另一些个体则持续生长，无明显变化。存活植株长到5叶期， 将其定植到田间。抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测 外源基因，对PCR阳性植株套袋自交或姊妹交结实。
转化植株产生的种子播种在大田或温室，植株长到4-6叶期时取叶片提取DNA，采 用PCR技术检测是否带有外源基因，对PCR阳性植株进行Southern blotting检测和 RT-PCR检测，从中选出转基因植株。同时对转基因植株进行套袋自交留种，分析下一代 中转基因个体的比例，选出转基因纯合系进行转基因表达分析和植株抗性检测。
转基因玉米植株的分析及利用
釆为了解转基因的表达特异性和表达强度，采用实时定量RT-PCR方法分别检测玉 米转基因小苗根和叶片器官中^"基因的表达强度。由于来自同一转化结构的不同转 基因株系^M基因的表达强度差异大，因此，从10个独立转化体的后代株系中，剔除 2个表达量偏高和2个表达量偏低株系的测定值，取其它6个株系的测定值的平均数来 表示转基因表达强度。在正常生长条件下，转基因玉米根系的6e"基因的转录丰度在 转TsVPl启动子和T5启动子的株系之间差异不显著；而在叶片中，转TsVPl启动子的 显著高于转T5启动子的。用250mM NaCl溶液浸泡转基因玉米小苗根系24小时，转基 因植株根系和叶片的/^M基因的转录丰度均大幅度升高。与转TsVPl启动子的植株相 比较，转T5启动子植株的根系6eM基因的转录丰度无明显变化，而叶片te"基因的 转录丰度升高幅度也相对较小。即在转基因玉米中TsVPl启动子和T5启动子均表现盐 胁迫诱导特性，但T5启动子具有较强的根特异性。
转6e"基因的种子播种在砂盆中，浇灌0. 8% NaCl水溶液，以未转基因自交系为 对照。转基因植株的不同株系在盐水浇灌下表现出不同的耐盐性，多数转TsVPl启动子 的株系表现出比对照显著提高的耐盐性，半数以上株系的5叶期成活率在70%以上，而 对照自交系出苗后很快死亡，5叶期成活率不到20%，且植株严重受害。转T5启动子的 株系也表现出比对照明显提高的耐盐性，耐盐性与转TsVPl启动子的差异不明显。选出 耐盐性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，挑选出配合力与供体自交 系相同或有提高的转基因自交系用于耐盐玉米杂交种培育。
将转6et4基因的玉米种子和未转基因的对照自交系种子播在花盆中，分别在苗期 (3-7叶期)、雌雄穗发育期(9-13叶期)、开花授粉期进行干旱胁迫处理，检测干旱处 理对玉米生长发育的影响、细胞膜受损程度、单株产量及其它经济性状和生理指标的差 异等。综合多方面的测试结果，转TsVPl启动子和T5启动子的玉米分别比对照植株表 现出明显提高的耐旱性，且不因启动子不同而有明显差异。选出耐旱性优异的转基因植株套袋自交纯合，并进行配合力测定，选择配合力与供体自交系相同或有提高的转基因 自交系用于玉米单交种选育。 本发明的有益效果
本发明公开了盐芥编码液泡膜焦磷酸酶基因7SPT7启动子序列和其不同区段的功 能元件，构建了系列缺失突变体，通过检测由它们分别启动的^AS基因在拟南芥中的表 达，初步确定了它们的应用价值。进而在转基因烟草和玉米植株中进行验证，，确定了 7SKP7启动子和T5启动子在转基因烟草和玉米中能正常行使功能，是盐胁迫诱导型的 强启动子。该发明的价值在于
1) 为植物抗逆育种提供盐胁迫诱导型强启动子7ifT/和T5启动子。在植物转基因 抗逆育种中，目前缺少这类胁迫诱导型的启动子。
2) T5启动子启动的基因表达不仅强度高，而且表达强度因器官不同而异，根中高 强度表达，这对于启动植物抗逆相关基因的表达有重要意义。另外，由于序列短，便于 基因重组和植物多基因遗传转化。
3) 在7>fT/启动子区域鉴定出一系列转录调控元件，并通过成套缺失突变体的构 建和转基因植株的分析，初步确定了一些元件在启动基因表达中的左右，为7JF尸/启动 子和T5启动子改造打下了基础。


图1: 757尸/启动子序列及顺式元件分析；
图2:不同的TsVP7基因启动子片段与报告基因连接示意图
(+1代表该基因的转录起始位点)； 图3: Tl—^^基因在转基因拟南芥植株根和叶中的表达强度要高于其他器官；
图4:在0.2 M NaCI处理条件下TsW"启动子启动的GUS酶活性拟南芥各组织 中的变化。
具体实施例方式
实施例1:转TsVPl启动子启动的2fePZ5基因创造玉米耐旱自交系及应用
1) 构建7JKP/启动子与Z历/Y5的融合基因
采用常规的基因重组方法将7SKP7启动子与Z/^Z5"相连，经测序验证后重组到植物 表达载体pCUA质粒的T-DNA区。pCUA质粒为本实验室构建，携带植物选择标记基因ah。 然后采用冻融法导入农杆菌LBA4404或AGL0中。
2) 受体系统的建立 以我国生产上所用的玉米骨干自交系为材料，如郑58、掖 478、掖515等，取自交种子灭菌，离体培养诱导茎尖产生丛生芽块，以丛生芽块为受 体进行遗传转化。所用培养基有
种子萌发培养基KN03 1 900 mg/l， NH4N03 1650 mg/l， CaCl2 2 H20 440 mg/l， MgS04 7H20 370 mg/l， KH2P04 H20 170 mg/l， FeS04 7H20 27. 8 mg/l， ZnS04 7H20 10 mg/l， MnS04 4H20 22 . 3 mg/l， H3B03 10 mg/l， KI 0. 83 mg/l， Na2Mo04 2 H20 0. 5 mg/1 ， CuS04 5H20 0 . 025 mg/1 ， CoCl2 6H20 0. 025 mg/1 ，盐酸硫胺素10. 0 mg/1 ， 盐酸吡哆醇1.0 mg/l， 烟酸1.0 mg/l，甘氨酸2.0 mg/l，肌醇100.0 mg/l，生物素 0.05 mg/l，酪蛋白水解物500 mg/1,蔗糖30 g/l，琼脂粉7 g/l， pH 5.8-6.0。用于 种子萌发。液体培养基则去掉琼脂粉。A培养基种子萌发培养基附加6-BA 4. 5-9. 0 ,1/1和2， 4一D 1. 0-3. 0 ,1/1， 用于诱导离体培养芽尖产生丛生芽组织块和丛生芽组织块继代培养。
B培养基种子萌发培养基附加6-BA 4. 5 |imol/l和IBA (吲哚丁酸)1. 8 ,ol/l， 用于丛生芽组织块分化小苗。
成苗培养基种子萌发培养基附加6-BA 2.25 lamol/l和IBA 3.6 |amol/l，用于丛 生小芽发育成小苗。
生根培养基种子萌发培养基附加IBA 2.8-3.6 )Ltmo1/1，用于无根小苗生根。 基本培养基及植物生长调节物质热压灭菌；抗生素和除草剂等活性成分过滤灭菌，
在培养基灭菌后加入。
种子灭菌和萌发..玉米种子用70%乙醇浸泡10分钟，再用0. 1%氯化汞浸泡10-15 分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量 (30-40 mL/250 mL三角瓶)无菌水，封口后放在黑暗条件(23-30°C)下1—2天。萌 动(露白)后种子放在基本培养基上于黑暗条件下继续萌发。
茎尖培养和丛生芽组织块诱导、继代、分化萌发种子的胚芽伸长止3-5厘米时， 剥离胚芽鞘及幼叶，切取长约5毫米左右的上胚轴及茎尖，接种到A培养基上于黑暗下 (24-27°C)培养，并及时切去伸长的胚轴和剥去幼叶。培养6-10天后，茎尖开始不规 则膨大生长，在膨大的分生组织上出现数个瘤状或指状突起。20天后，在瘤状或指状突 起的表面开始形成不定芽及胚状体。 一般每4周继代培养一次。在继代培养中，若丛生 芽组织块丛生小芽偏多，2,4-D浓度取3.0 |nm0l/l;若丛生芽组织块愈伤组织化较重， 虽有大量的分生细胞团，但表面很少出现不定芽，可将2， 4-D浓度降为l.O pmo1/1， 继续培养则重新产生大量瘤状或指状突起。A培养基上的丛生芽组织块，少数有不定根 的产生。与幼叶存在一样，不定根也影响组织块的膨大生长及胚状体和丛生小芽的产生， 需要及早去掉。丛生芽组织块在转移到B培养基上2-3天后，色泽逐渐变黄，质地较柔 韧，5-6天后表面出现微小突起。扫描电镜下观察可见各期胚状体及不定芽。胚状体及 不定芽迅速发育，在组织块表面形成丛生小芽。
3)以丛生芽组织块为受体的转化和植株再生
将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有选择剂抗性基因和7iW>7启动子一Z/^/S基因) 的根瘤农杆菌(如AGL0和LBA4404)在附加抗生素的LB培养基(每升培养基含胰化 蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， NaCl 10 g， pH 7.0，热压灭菌)中28 'C下震荡培养， 震荡速率为110 rpm (转/分)，使细菌处于对数生长期。然后在3000 rpm下离心10分 钟，弃上清液。菌体用1/2浓度的液体种子萌发培养基(即种子萌发培养基成分减半， 去掉琼脂粉)洗涤，再离心收集。再将菌体用添加乙酰丁香酮(acetosyringone, As) 100 的1/2浓度的液体丛生芽诱导培养基悬浮，稀释5—20倍用于转化。
取继代后培养13-20天的丛生芽组织块为转基因受体。用农杆菌介导法进行转化， 转化后材料在暗中进行恢复培养。农杆菌感染的丛生小芽或丛生芽组织块在加有头孢霉 素(Cefotaxime ) 250 mg/1或羧节青霉素(Carb) 500 mg/1的培养基上于黑暗中培养 7-12天，抑制细菌生长。恢复培养后或抑菌培养后的丛生小芽或丛生芽组织块在加有选 择剂的培养基上连续筛选3-4代，获得转基因细胞及小芽。在筛选培养中绝大数丛生芽 组织块逐渐死亡。将存活的组织块转移到无选择剂的去掉2， 4-D的A培养基上恢复培养后产生小芽。
将小芽放在成苗培养基上照光下生长，光强2000-3000 1x，光照14-15小吋/天。 小苗长到3-4片叶时转入生根培养基中生根。培养15天左右，约40%的小苗产生新根。 对于未生根苗，切伤其基部，转移到新的生根培养基上培养，io天后大多数植株产生根 系。生根苗洗去培养基后，移栽到以蛭石为栽培介质的花盆中生长。植株在自然光照下 生长，日温22-28'C，夜温15-2rC，隔天浇灌1/2浓度的种子萌发培养基的无^l盐成 分。生长2周左右，移植苗产生发达根系，然后定植于田间。
4)转基因植株的抗性检测和选择利用
取移栽成活植株的叶片进行分子生物学检测确定转基因植株。将转基因植株套袋自 交结实。取种子播种在砂盆中，用0. 7%NaCl水溶液进行连续浇灌30天，将存活小苗移 栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代继续进行分子生物学鉴定和耐盐性 检测，并套袋自交纯合，获得了耐盐自交系。
实施例2:转T5-Z历尸/S基因创造小麦优良抗旱育种材料
1) 构建T5启动子与Z历P/5"的融合基因
采用常规的基因重组方法将T5启动子与Z迈尸i"5相连，经测序验证后重组到植物表 达载体pCUA—6ar质粒的T-DNA区。pCUA—6ar质粒为本实验室构建，携带植物选择标 记基因6ar，然后采用冻融法导入农杆菌LBA4404或AGL0中。
2) 小麦无菌苗获得
小麦优良品种的种子，用70%乙醇浸泡1-3分钟，再用O. 1%氯化汞浸泡8-12分钟， 然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子 放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水于黑暗条件(20-25°C)下1-2天。待种 子萌动(露白)后，将其放在改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚芽伸长止3-4 厘米时，剥离胚芽鞘及2-3片幼叶，露出茎尖顶端生长锥。
3) 农杆菌培养及活化
将带有双元载体(Mini-Ti质粒带有除草剂抗性基因&r和Z历/Y5"基因)的根瘤农 杆菌LBA4404在附加抗生素的LB培养基中28'C下震荡培养，震荡速率为110 r/min， 使细菌处于对数生长期。然后在3000 r/min下离心10分钟，弃上清液。菌体用1/2 MS 液体培养基洗涤，离心收集。再将菌体用添加100 mg/1乙酰丁香酮的1/2 MS液体培养 基悬浮，稀释5-20倍用于转化。
4) 小麦无菌苗转化
(1) 将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无 菌苗浸泡在菌液中，在0. 5X 105 Pa大气压下处理3-6分钟。
(2) 浸染后的芽尖用无菌滤纸吸干，萌发种子放在附加200 rag/1谷氨酰胺的改良 MS培养基上于黑暗中培养2-3天，培养温度为22-24°C 。然后将无菌苗放在散射光下培 养2天。
(3) 将照光培养后的无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，并用蛭石覆 盖植株顶部。然后让植株在自然光照下生长，日温22-28°C，夜温15-21°C，隔天浇灌 1/2改良MS培养基无机盐。5) 转化植株筛选与定植
转化植株长出3片叶后，喷洒除草剂Finale8 (Hoechst Schering AgrEvo GmbH，含 有除草剂glufosinate ammonium)水溶液，浓度为9. 6 ral-10. 8 ml Finale7L，以植株 掉液滴为宜。未转化对照植株在喷洒后5天后停止生长，15天左右死亡。转化植株在喷 洒后， 一些个体变化同对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。待存活植株 长到7-8叶时，将其定植到田间，并促进分蘖。
6) 转化植株的分子检测
抗除草剂植株经春化处理后,在起身-拔节期取叶片提取DNA，采用PCR技术检测转 化植株。PCR阳性植株进行RT-PCR检测,在获得的抗除草剂植株中，约15%左右为转基 因个体。
6.转基因植株子代分析
通过春化阶段(低温处理条件因品种而异)的植株在长日照下起身、拔节、开花结 实。转基因植株产生的种子，在浸水萌动后放冰箱(0 2°0中进行春化处理30-65天。 部分春化处理后的种子用10.8 ml Finale7L水溶液处理，观察统计抗性和敏感性个体 比例；另一部分春化处理后的种子播种在大田和砂盆，分别进行干旱胁迫处理和高盐胁 迫处理，筛选耐旱和/或耐盐转基因植株。提取抗逆植株的叶片DNA，采用PCR技术检测 外源基因，并统计外源基因在子代植株中的分离比例，获得纯系后用于小麦育种或直接 进入安全性实验和区域实验。
实施例3、转T5启动子启动的6e"基因创造棉花优良抗逆育种材料
1) T5启动子与6eM基因的融合基因及质粒构建和农杆菌培养 采用常规的基因重组方法将T5启动子与^M基因相连，经测序验证后重组到植物
表达载体pCUA质粒的T-DNA区。pCUA质粒携带植物选择标记基因sh，然后采用冻融 法导入农杆菌LBA4404或AGL0中。农杆菌培养及活化同实例2。
2) 棉花无菌苗获得
取棉花自交系或优良品种的种子，用浓硫酸脱去表面绒毛，用70%乙醇浸泡1分钟， 再用O. 1%氯化汞浸泡10-12分钟，然后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子， 以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(30-40 毫升水/250毫升三角瓶)，封口后放在黑暗条件(23-3(TC)下1-2天。待种子萌动(露 白)后，将其放在铵盐减半的改良MS培养基上于黑暗条件下萌发。待胚轴伸长至3 5 厘米时，剥去一片子叶，露出茎端生长锥。
3) 棉花无菌苗转化
(1) 将菌液涂到用解刨针刺伤的茎尖生长锥上，并用农杆菌浸湿的棉花球覆盖在 其上，然后在黑暗中培养2-3天，培养温度为24-26'C。再将无菌苗放在散射光下培养 2天。
(2) 将照光培养后的无菌苗移栽到上层蛭石下层壤土的花盆中，让植株在自然光 照下生长，日温22-28°C，夜温18-23t:，隔天浇灌1/2改良MS培养基无机盐。
4) 转化植株筛选与定植
转化植株长出3片叶后，喷洒8mg/l绿黄隆(沈阳农药厂生产，有效成分25%)水溶液，以植株掉液滴为宜。未转化的对照植株在喷洒后3天停止生长，12天左右开始死 亡。转化植株在喷洒后， 一些个体变化同对照植株相似，另一些个体有很强抗性，持续 生长。存活植株长到5叶期时，将其定植到田间。
5) 抗除草剂植株的分子生物学鉴定
抗除草剂植株长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR 阳性植株进行RT-PCR检测。在获得的抗除草剂植株中，10%以上的植株为转基因个体。
6) 转基因植株子代的分子生物学鉴定
转基因植株开花后自交或姊妹交结实。种子播种在大田或温室，在植株4-6叶期取 叶片提取DNA，采用PCR技术检测子代植株是否带有外源基因，并统计外源基因在子代 分离比例，结果表明，在20%左右的转基因株系中，外源基因在子代植株中的分离比例 符合孟德尔定律。
7) 转基因植株的抗性鉴定和利用
取纯合的转基因植株的种子,播种在花盆中，植物2叶期时进行低温处理，通过存活 率统计和生理指标测定，筛选出耐冷株系，用于生产。进行砂盆中，用0.7%NaCl水溶液 进行连续浇灌30天，将存活小苗移栽到大田，待植株长大后套袋自交结实。对其下一代 继续进行分子生物学鉴定和耐盐性检测，并套袋自交纯合，获得了耐盐自交系。该自交 系可用于配制玉米耐盐杂交种。
实施例4、转T5启动子启动的Z^"基因创造大豆耐旱育种材料
1) T5启动子与6e"基因的融合基因及质粒构建和农杆菌培养
同实例3。但离心收集的农杆菌菌体用添加100 mg/1乙酰丁香酮的1/2改良B5液 体培养基悬浮，稀释5-IO倍用于转化。
2) 大豆无菌苗获得和遗传转化
取优良品种的种子，用70%乙醇浸泡2-3分钟，用0. 1%氯化汞浸泡10-12分钟，然 后用无菌水洗涤3-5遍。灭菌期间不断晃动种子，以保证表面灭菌彻底。灭菌后种子放 在无菌三角瓶内萌发，瓶内放入少量无菌水(50-60 mL水/250 mL三角瓶)，封口后放 在黑暗条件(23-3(TC)下2-3天。待种子萌动(露白)后，将其放在改良B5培养基上 于黑暗条件下萌发。待胚轴长至3-5厘米时，剥去一片子叶并露出茎端生长锥。
转化步骤为
(1) 将菌液倒在4.5厘米直径的培养皿中，倾斜培养皿，使露出茎尖生长锥的无 菌苗顶端浸泡在菌液中，在0. 5X 105 Pa大气压下处理3-6分钟。
(2) 浸染后的苗顶用无菌滤纸吸干，把小苗根端插入改良B5培养基上于黑暗中培 养3-4天，培养温度为22-24°C。
(3) 将无菌苗移栽到铺有上层蛭石下层壤土的花盆中，顶部覆盖蛭石，自然光照 下生长，日温23-28。C，夜温20-25°C，隔天浇灌1/2改良B5培养基无机盐。
3) 转化植株筛选与定植
转化植株在长日照(13-14小时/天)下生长，长出3片叶后，喷洒1.5-2.0呢/1 (因基因型而不同)绿黄隆(沈阳农药厂生产，有效成分25%)水溶液，以植株掉液滴 为宜，未转化的对照植株在喷洒后4天停止生长，15天左右开始死亡。转化植株在喷洒后， 一些个体的变化与对照植株相似，另一些个体持续生长，变化不明显。存活植株长 到5叶期，将其定植到田间。
抗除草剂植株生长到7-8叶时，取叶片提取DNA，采用PCR技术检测外源基因。PCR 阳性植株进行RT-PCR检测。在获得的抗除草剂PCR阳性植株中，约20%的植株为转基因 个体。
4)转基因植株后代的分子生物学鉴定和抗逆性测定及利用
将转基因植株产生的种子，播种在大田或温室。植株(Tl代)3-4叶期时取叶片提 取DNA，采用PCR技术检测外源基因，并进行Southern blotting验证，同时统计外源 基因在子代植株中的分离比例。获得转基因纯合系后进行抗逆性测定，筛选抗逆株系。序列表
<110〉山东大学
〈120〉盐芥V-焦磷酸酶基因启动子序列和其缺失突变体的应用
〈141〉2009-9-1
<160〉3
〈210>1
<211>19
〈212〉DNA
〈213〉PTsVP-Pl
〈400〉1
gtggcgtcgg cgUtcttc 19
〈210>2
〈211〉19
<212>醒
〈213〉PTsVP-P2
<400>2
cttggcgacg acactctgc 19
<210〉3
〈211〉2203
〈212>DNA
〈213〉7^T7启动子序列 <400>3
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agcatccaag鄉agg卿gtcagtgttat肌aacgEtcgLCgatatcctcaccgagtttac2100
gccttcatttcatcatctcgtCg犯犯C3Cttcccttcctttctctctactctctctctc2160
tcgttatcttcggtttctgctttctctattcggagg卿gatg220权利要求
1.盐芥V-焦磷酸酶基因(TsVP1)启动子序列和其缺失突变体的应用，其特征是，从盐生植物盐芥的基因组文库中筛选出携带TsVP1启动子的克隆，截取TsVP1开放读码框5′上游的2200核苷酸序列作为全长启动子序列，以此为模板通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段T2～T7，分别将其与报告基因融合后转入拟南芥，确定了TsVP1启动子和其部分系列缺失突变体是盐胁迫诱导型启动子，其中T5启动子具有较强的根特异性；TsVP1启动子和T5启动子分别与来自大肠杆菌的betA基因相连转入烟草和玉米，确定了它们在转基因烟草和玉米中能正常行使启动功能，是盐胁迫诱导型的强启动子。
2. 如权利要求1所述的应用，其特征是，7JWV启动子来源于盐生植物盐芥的基因 组，长度为KFP/开放读码框5'上游的2200核苷酸，其序列如序列表SEQ ID NO. 3 所示，与启动子克隆方法无关。
3. 如权利要求l所述的应用，其特征是，以KFP7启动子为模板，构建出不同缺 失突变体以开发新的启动子，不受突变体产生方法的限制，新的启动子或是7SFP7启 动子中的连续片段，或是KF尸/启动子中的几个片段的组合。
4. 如权利要求l所述的应用，其特征是，7SF/V启动子和其派生的启动子被用于植 物转基因抗逆育种，其中7S^T7启动子和T5启动子是盐胁迫诱导型强启动子。
5. 如权利要求l所述的应用，其特征是，T5启动子是7iF尸7启动子的缺失突变体， 即只要7iKP/启动子靠近开放读码框的667个核苷酸组成的连续序列，具有较强的根 特异性。
6. 如权利要求1或3所述的应用，其特征是，派生启动子产生采用缺失突变体构建、 核苷酸代换、新的顺式作用元件的引入、来自于7^PT/启动子中的几个片段的不同组 合，序列中有大于300 bp的核苷酸片段与7iF」P7启动子中的片段存在90%以上相似 性的启动子都视为派生启动子。
7. 如权利要求1或5所述的应用，其特征是，r^T/启动子和T5启动子分别与抗 逆相关基因融合转入植物，可实现转基因的盐胁迫诱导型表达。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征是，转基因植物是指农作物、经济林木、牧草 或草坪草。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征是，所述农作物是玉米、小麦、棉花、大豆或 水稻。
全文摘要
本发明公开一种盐芥V-焦磷酸酶基因(TsVP1)启动子序列和其缺失突变体的应用，是从盐生植物盐芥的基因组文库中筛选出携带TsVP1启动子的克隆，截取TsVP1编码框5′上游的2200核甘酸序列为全长启动子，通过PCR扩增获得不同长度的启动子片段，然后分别与gus基因融合，重组到植物表达载体中转化拟南芥。检测转基因植株的GUS酶活性，确定了TsVP1启动子和其部分缺失突变体是盐胁迫诱导型启动子。其中T5启动子不仅序列短(667bp)，而且具有根特异性。将TsVP1启动子和T5启动子分别与来自大肠杆菌的betA基因相连，转入烟草和玉米，确定了TsVP1启动子和T5启动子在转基因烟草和玉米中能正常行使功能，是盐胁迫诱导型的强启动子，并在植物基因工程的产业化开发中有重要应用价值。
文档编号C12N15/82GK101643745SQ200910018649
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月9日 优先权日2009年9月9日
发明者孙清华, 张举仁, 李坤朋, 峰 高, 强 高 申请人:山东大学