专利名称：辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg5基因分子检测技术的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本技术发明提供从来辣椒疫霉菌的多聚半乳糖 MW Pa》g 5 ^TOtt并合, 一对特异引物，皿供检测辣椒疫霉特异性和灵敏，证 据。此外，本发明主要涉及利用该技术对辣椒病田土壤、病茎、病叶、病果中的辣椒疫霉 菌进行定性、定量分子检测和疫情发生趋势的预警，对辣椒疫病适时进行综合防控和高效 治理。
背景技术：
植物病原卵菌是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物的毁灭性 病害，如致病疫霉(尸/iy/o; /^ora z'"/eWfl"s )、辣椒疫霉(Pcfl;wz'a')、大豆疫霉(P yVie)、 寄生疫霉(P/7flraWric)、樟疫霉(Pd朋flmo/m')及冬生疫霉(PM)e附flfo)分别引起马铃 薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘的重要疫病，严重年份乃至绝产。该类病菌主要以菌 丝体或卵孢子在病残体或土壤中度过不良环境而作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或 卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，再借助雨水或气流进行传播、侵染而导致植物 病害。因此，对该类病菌的初侵源或侵染寄主早期进行适时检控，利于控制病害的发生。 传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主 要在病害爆发乃至产生明显危害时才实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综 合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。
近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与 预警，其中主要利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异引物，已针对性的开展了大豆疫霉、致 病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉的分子检测技术研究，但这些技术性研发成果仅 能对病菌活动动态进行检测与预警，但不能对病菌致病特性与发生趋势进行检测与预警。 研究标明疫霉菌-寄主互作过程中常分泌多种重要的细胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛 酸酶(,g)、果胶甲基酯酶(,辺e)、果胶裂解酶(A/)，它们主要通过降解或软化植物细胞壁 的主要成分果胶、中胶层'及果胶聚合体，而促使病菌的侵入与定植，对寄主产生寄生与致 病性。该类致病酶是均由多基因编码，其中少数关键基因是重要的致病靶基因，因此分离 鉴定这些重要致病酶的靶标基因，利用基因信息学设计并合成靶标基因的特异引物，针对 病菌不同时期的致病特性进行分子检测与预警，以便在病菌初侵染期适时釆取综合防控措 施，减少药剂使用次数与使用量，阻断病菌的扩展与蔓延，控制病害的发生与蔓延。因此， 开展重要疫霉菌致病酶类靶标基因克隆及其特异引物设计与合成，研制病菌分子检测、预 警技术及其试剂盒，对重要疫霉病的综合防控具有重要的理论与实践意义。本发明以辣椒 疫霉为参试材料，通过解析辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶基因簇成员组成，将Pdpg5界定为 乾标致病基因，设计并合成尸dpg5基因的特异引物，验证其特异性和灵敏度，借助PCR技 术对辣椒疫霉活动动态及致病特性进行定性、定量分子检测与预警。在本发明申请之前， 从世界范围内除利用辣椒疫霉rDNA/ITS序列特异引物对该病菌进行分子检测外，无任何利用重要致病酶类的靶标基因特异引物对辣椒疫霉消长动态进行分子检测与病情预警的资料
寸§ I 。
发明内容
1、 在界定辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶靶标致病基因帥《r的基础上,通过基因tr
息比对，本发明设计并合成了尸c/;^ 5基因的一对特异性引物，提供了利用该对特异引物 对辣椒疫霉消长动态及致病特性进行定性、定量分子检测的操作技术。先对所有参试种菌 进行PCR特异性扩增，验证其特异性，然后对土壤卵孢子和游动孢子进行定量分子检测， 进一步验证其灵敏度，证明了该对引物可对不同时期的辣椒疫霉进行定性、定量分子检测。 在此基础上，利用PCR检测技术对辣椒病田土壤、辣椒疫病组织(病茎、病叶、病果)疫 霉菌进行定性、定量分子检测。因此，利用该对引物可对辣椒疫霉初侵染源及其侵染过程 的各个时期病菌消长动态进行检测与预警，本技术发明的应用推广，便于选择最佳有效防
控时期，降低了病害防控成本，实施综合防控与高效治理。
本发明所提供的多聚半乳糖醛酸酶尸";pg5基因的一对特异性引物，上游引物为尸dpg5-F， 含21bp,其序列如SeqlDNo:2所示；下游引物为尸";pg5-R,含24bp，其序列如Seq ID No:3所 示，该对引物扩增目的基因片段长度为357bp。该对引物序列与JGI中的jgi/phycaf7/20609中
适宜对疫霉菌进行分子检测的引物序列比对，未发现一个与其完全相同序列的引物，因此是 一对新的辣椒疫霉分子检测与预警引物。
2、 本发明为了证明该对引物的特异性，提供了利用该对引物对若干参试种菌PCR扩增 的结果及其特异性验证技术方法。
3、 本发明为了验证该对引物的灵敏度，提供了利用该对引物定量检测土壤辣椒疫霉卵 孢子和游动孢子的技术方法。
4、 本发明提供了利用该对引物对辣椒疫病组织(病茎、病果和病叶)中辣椒疫霉进行 分子检测的技术方法，进一步证明了该对特异引物对辣椒疫霉分子检测与预警的效果。
5、 本发明提供了利用该对特异引物对病田土壤、病茎、病果、病叶中的辣椒疫霉分子 检测技术方法，利用本技术发明可适时预测辣椒疫霉病疫情发展趋势。
6、 本发明用于设计合成的特异引物的靶标基因尸ci/^ 5的宿主载体为pUC19。
具体操作步骤
1、 从辣椒疫霉菌中分离克隆尸g基因和靶标A力^ 5基因界定的具体步骤省略
因辣椒疫霉菌尸g基因分离克隆和/^//^ 5被界定为靶标基因的具体步骤已在前一个发 明专利申请中详述，故在本发明中不再加一详述，其尸c々^5基因全序列如S叫IDNo:l所示。
2、 靶标P"/^ 5基因特异引物设计与合成
(l)引物设计利用DNAMAN对辣椒疫霉等疫霉种菌，曲霉等真菌，番茄等植物，胡萝卜欧 式杆菌等细菌及其他能征集到的所有多聚半乳糖醛酸酶基因序列进行比对，设计,c//^ 5基因的特异性引物，其上游引物为,"/^ 5-F，含21bp;下游引物为,c/;^ 5-R,含24bp,扩增基 因片段长度为357bp。
(2)引物合成将设计合成的引物发给上海博尚生物公司或上海鼎安生物公司，由生物 公司合成寄回后，直接应用。
3、乾标户";^ 5基因特异性引物验证步骤
(1) 参试种菌制作与菌体收集。
(2) 参试菌体DNA提取。
(3) 靶标户c/;^ 5基因特异性引物对参试种菌DNA进行PCR扩增。
(4) 扩增结果的比较分析。
通过对所有参试种菌DNA的PCR扩增，结合扩增片段的有无情况，验证该对引物的特异 性，其具体操作技术方法在具体实施方式
中详细描述。
4、 靶标尸c/;^ 5基因特异性引物灵敏度验证步骤
(1) 辣椒疫霉菌游动孢子DNA提取。
(2) 土壤卵孢子DNA提取及纯化。
(3) 分别利用入选特异性引物进行PCR扩增。
(4) 综合比较分析PCR检测结果，检验入选引物的灵敏度。
本技术操作属常规的分子生物学技术方法，具体操作过程在后续的具体实施方式
中加以 详述。
5、 入选特异性引物对辣椒疫病组织(病茎、病果、病叶)分子检测步骤
(1) 辣椒疫病组织(发病茎组织、叶片、果实)的DNA提取。
(2) 分别利用入选特异性引物进行PCR扩增。
(3) 综合比较不同病组织PCR检测结果，确定入选引物对辣椒疫病组织的检测技术。 本技术操作过程采用的是常规分子生物学实验技术方法，具体过程在后续的具体实施方
式中加以详述。
6、 特异引物对病田土壤、病茎、病果、病叶中的辣椒疫霉分子检测步骤
为了进一步证明本发明设计合成的靶标尸c々^ 5基因特异引物对辣椒疫霉的检测效果， 本发明提供了该对特异引物对病田土壤、病茎、病果、病叶中的辣椒疫霉分子检测技术， 具体操作步骤
(1) 分别提取辣椒疫霉病病田土壤菌体、病茎、病果、病叶的总DNA。
(2) 以不同来源的DNA为模板，利用入选特异引物进行PCR扩增，对不同来源的辣椒疫 霉菌进行PCR扩增。
(3) 综合比较不同来源的辣椒疫霉PCR检测结果，正确预警辣椒疫霉消长动态和疫情发 展趋势。
综合上述检测结果，本发明所提供的辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶Pdpg 5靶标基因的一 对特异性引物能对不同时期的辣椒疫霉进行定性、定量检测与预警，为对辣椒疫霉进行适时综合防控与高效治理提供了方便易行的操作技术。
图L靶标,c//^ 5基因特异引物对不同参试种菌DNA的PCR扩赠结果示意图
图中1:标准DNA; 2:阴性对照水；3-7:辣椒疫霉；8:大豆疫霉；9:寄生疫霉；10:致 病疫霉；11:樟疫霉；12:掘氏疫霉；13:棕榈疫霉；14:热带疫霉；15:苎麻疫霉；16: 恶疫霉；17:苜蓿疫霉；18:芋疫霉；19:标准DNA; 20:隐地疫霉；21:豌豆疫霉；22: 草莓疫霉；23:大雄疫霉；24:菜豆疫霉；25:葱疫霉；26:冬生疫霉；27:瓜果腐霉； 28:水霉；29:甘薯根霉；30:立枯丝核；31:串珠镰刀菌；32:腐皮镰孢菌；33:茄链 格孢；34:青霉菌；35:淡黄曲霉。
结果显示来自靶标基因尸d;^ 5的一对特异引物对辣椒疫霉具特异的检测效果，进一步 说明尸dpg5基因是辣椒疫霉,《基因霧成员中的一个新基因。
图2.靶标&//^ 5基因特异引物PCR扩增不同浓度游动孢子DM示意图
图中1:标准DNA; 2:阴性对照水；3:阳性对照辣椒疫霉DNA; 4-15:来自不同体积的游 动孢子DNA 0. 5， 1. 0， 1. 5， 2. 0， 2. 5, 3. 0， 3. 5， 4. 0， 4. 5， 5. 0， 5. 5， 6. 0〃L ( 7个游动孢子/〃L )。
结果显示该对特异引物对不同浓度的游动孢子具明显的检测效果，而且随着游动孢子浓 度的增加，PCR扩增产物呈现逐渐增多的趋势，致使检测游动孢子的精度最低可达3.5个 /〃L。
图3.靶标户"7^ 5基因特异引物PCR扩增土壤中卵孢子DNA示意图
图中1:标准DM; 2:阴性对照水；3:阳性对照辣椒疫霉DM; 4-11:来自含不同数量的 卵孢子土壤DNA 20,10,1. 0, 0. 5, 0. 2, 0. 1， 0. 05， 0. 01个卵孢子/克土壤。DNA模板最低检测 量分别为10-5ng/;/L和0. 05个卵孢子/克土壤。
结果显示该对特异引物对土壤中的卵孢子具明显的检测效果，而且随着卵孢子数量的增 加，PCR扩增产物呈现逐渐增多的趋势，致使检测卵孢子的精度最低可达0.05个卵孢子/ 克土壤。
图2和图3检测结果，验证了该对特异引物对辣椒疫霉具很高的检测灵敏度，近而可对
辣椒疫霉进行定性、定量分子检测。
图4.靶标Pc//^ 5基因特异引物对不同辣椒疫病组织DNA PCR扩增结果示意图
图中1:标准DNA; 2-3:阴性对照水和健康辣椒组织DNA; 4:辣椒疫霉DNA阳性对照；5-7: 来自不同辣椒疫病组织的DNA:病茎、病果、病叶(分别取0. 25//L病组织DNA)。可见该对
特异引物对不同辣椒疫霉病组织中的辣椒疫霉具明显的检测效果。
图5.靶标,"/W 5基因特异引物对不同辣椒疫病材料PCR扩增结果示意图 图中1:标准DNA; 2-3:无菌水和健康辣椒组织DNA; 4:辣椒疫霉菌丝体DNA; 5:病茎组
织DNA; 6:病果组织DNA; 7:病叶组织DNA; 8:人工接种卵孢子的土壤菌体DNA; 9:含
有卵孢子的病田土壤菌体DNA (分别取O. 25^L DNA)。结果显示利用本技术发明，可对不同辣椒疫病材料进行定性、定量分子检测，应用该技 术可准确预测辣椒疫霉消长动态和疫情发展趋势，便于及时确定病害最佳防控时期，特别 是在病菌早期活动时期适时进行综合防控和治理，如根据对土壤中卵孢子检测的有无、多 少及繁殖速度,适时处理土壤，ffiff源头病齒的繁殖与蔓延,达到髙效治理的目的。
具体实施例方式
本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York: Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或Draper, J等(Blackwell科 学出版社，1988 ),郑小波(疫霉菌及其研究技术，中国农业出版社，1997 )所述的搡作技 术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。 实施l:靶标户c/》《5基因特异引物设计与合成
(1) 特异引物设计利用DNAMAN对已知的辣椒疫霉，大豆疫霉，橡胶疫霉等卵菌，曲霉、 链格孢菌等真菌，番茄、桃、柠檬等多种植物，及所能查到的所有的多聚半乳糖醛酸酶基因 进行比对，设计户c//^5的特异性引物，,c々^5-F,尸c々^5-R,扩赠片段长度357bp。尸c/^5-F 5， -ACGGGCGCTAACATCAAGATC-3， 21bp, ,c//^5-R 5， -GATATGGTTGTTCTTAGTCAGGTC-3， 24bp。
(2) 引物合成将设计合成的引物发给上海博尚生物公司或上海鼎安生物公司，由生物公 司合成寄回后，直接应用。
实施2:特异性引物的验证技术步骤与方法
1) 供试种菌及其培养制作
供试辣椒疫霉(P o /w/d )(山东)、大豆疫霉(Pso/ae)(吉林)、寄生疫霉(/^flraw'ric) (云南)、致病疫霉(P z'w/eWfl w )、樟疫霉(P d朋a/nomz' X CBS提供)、掘氏疫霉(P ^ec/w/e〃') (CBS提供)、棕榈疫霉(P /w/附ivom ) ( CBS提供)、热带疫霉(i frop/aifo ) ( CBS提供)、 苎麻疫霉toe/i證^ )(福建)、恶疫霉(P ca加画)(CBS提供)、苜蓿疫霉(陕西)、 芋疫霉(P coZocasz'fle )(广东)、隐地疫霉(f! ayptogea) (CBS)、豌豆疫霉(f! eo^rosepricfl) (云南)、草莓疫霉(^ #aga/v'fle)(山东)、大雄疫霉(P ,wegfl^e/7nfl) (ATCC)、菜豆疫霉(P /7/w化oZzO (山东)、葱疫霉;wt!')、冬生疫霉(/J /u7 emflfo )( CBS119904 )、瓜果腐霉(fy/^w ap/^"Hewwto/n )(山东)、水霉(& /7ra/egm'fl sp.)(山东)分别用V8培养基(培养基的制 作参照方中达，植病研究方法，1998)。甘薯根霉(i /iz'zo;w^6fltotos)(山东)、立枯丝核菌 (i /i&octo/H'fl soZam')(山东)、串珠镰刀菌(jFksflrZM附附om7!7"oA7ne)(山东)、腐皮镰孢菌(E so/am〕(山东)、茶链格孢M/ter膠!'" so/am')、青霉菌(Pem'dffiw/w sp.)(山东)及淡黄曲霉 (J^e/^Z^ CKA/je^)(山东)均用马铃薯培养基(PDA)培养(培养基制作参照方中达， 植病研究方法，1998)。辣椒疫霉游动孢子悬浮液和卵孢子制备及记述方法参考郑小波(1997 ) 描述的方法。
2) 菌体培养与收集
供试疫霉菌移至燕麦平板培养基上，于25'C生化培养箱内培养2-3d后，从菌落边缘切 取菌块，转至V8培养基，而其它参试真菌移至PDA培养基上，所有参试种菌均25"C震荡 培养5-7d,无菌纱布过滤，经冷冻抽干研制成粉，-2(TC保存备用。
73)参试种菌菌丝体DNA提取
采用CTAB法或改良CTAB法，提取的DNA于-20。C保存备用，并分别取( 50ng/^L) 作为模板进行PCR扩增。
4 )特异引物对参试种菌DM的PCR扩增技术方法
PCR反应体系为10xPCR缓冲液5^L，模板DNA (50ng) 2 〃L,引物尸c/pg 5-F和尸a》g 5-R 各1;iL, dNTP (2.5mmol/L) 4#L， MgCL2 (25mmol/L) 4 ^L， TaqE0.5/^L, ddH20 ( 32.5/^L )。
PCR检测程序为95。C预变性4min; 94。C变性lmin, 50°C 30s, 72。Clmin, 35个循环； 最后72。C延伸10 min。取1QuLPCR扩增产物用1.5%的TBE胶检观"用DL2000 DNA Marker 作对照。电.泳结東后，用Bio Imaging System Gene Cenius LP-400全自动凝胶成像系统观察 结果并扫描于计算机软件中保存。 实施3:特异引物灵敏度验证技术方法
1) 辣椒疫霉游动孢子DNA提取
取5(^L无菌水中加入350个游动孢子(显微镜下直接记述)，加O. 05g石英砂，在涡旋 器上剧烈震荡3min,稍离心，上清液即为游动孢子的DNA粗提液，分别取0. 5-l(^L上清 液直接作为PCR扩增模板。
2) 土壤卵孢子DM提取及纯化
参照Zhu等(Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62:316-322)报道的方法(稍微 改进)。分别取含有20, 10, 5.0, 2.0,1.0，0.05，0.01个卵孢子/lg土壤放入5mL灭菌离心管 中，加入适量石英砂，剧烈振荡lmin。然后加2mLNa3PO4缓冲液(0.12mol/L,PH8.0),于30°C 振荡15 min (160rpm/min)， 10000rpm/min离心10 min后,弃上清。向沉淀中力口入3mLDNA 提取液(100mmol/LTris-HCI， 100mmol/LEDTA， 100mmol/LNa3PO4, 20mol/LNaCI， 1%CTAB， pH 8.0)、 30;wL蛋白酶K (10mg/mL)和0.5mL溶菌酶(50mg/mL)，于37。C振荡20min (225 rpm/min)，随后加入0.4mL 20% SDS,置65。C水洛1.5h,经2-3次冷冻处理后，室温条件下 6000 rpm/min离心10min,收集上清，加入等体积酚氯仿异戊醇，12000 rpm/min离心10min。 在上清中加0.6倍体积异丙醇，4'C沉淀lh,室温条件下14000rpm/min离心15min,收集核 酸沉淀，经70%乙醇漂洗2-3次，风干后，加100//L无菌水溶解DNA备用，纯化方法采 用DNA凝胶回收纯化法。
3) 特异引物对辣椒疫霉游动孢子DNA PCR扩增技术方法 PCR反应体系、PCR检测程序及凝胶成像观察同上，省略。
4) 特异引物对土壤卵孢子DNA PCR扩增技术方法 PCR反应体系、PCR检测程序及凝胶成像观察同上，省略。
实施4:特异引物对不同病组织DNA PCR检测技术方法 l)辣椒疫病组织病茎、病叶、病果DM提取
将供试辣椒疫霉转至V8固体平板中，25'C黑暗培养2-3d后，用打空气从菌落边缘取菌 落块(2mmx2mm),创伤接种于辣椒幼苗(7-9片叶)茎基部、同一个辣椒品种的果实，同样大小的菌块微伤口接种于辣椒叶片，然后分别切取不同发病组织，参考Wang等(Nucleic Acids Research, 1993， 21: 4153-4154 )的NaOH法(稍加改进)提取病组织的DNA:分别取 一段适量的病茎、病果、病叶，1 mg病组织加入10^L0.5mol/LNaOH,充分研磨后转至1.5mL 的eppendorf离心管中，10000 rpm离心5 min,取5〃L上清液加入495〃L0.1mmol/LTris (PH 8.0)，混均后取1;/L直接用于PCR扩增，用本方法提取的健康辣椒茎、果实、叶片的混合 DNA为空白对照。
2)特异引物对不同辣椒疫病组织DNA PCR扩增技术方法
PCR反应体系、PCR检测程序及凝胶成像观察同上，省略。 实施5:特异性引物对不同辣椒疫病材料DNA检测技术
1) 不同辣椒疫霉病原材料MA提取均按上述方法进行。
2) 特异引物对不同辣椒疫病材料DNA的PCR扩增技术方法 PCR反应体系、PCR检测程序及凝胶成像观察同上，省略。序列表
<110>山东农业大学
<120>辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶？"7^ 5基因序列
<160>2
<210〉1
<211〉1086
<212>腿
<213>辣椒疫霉(Phytophthora capsici)
<220>
<221>CDS
<222>(1) ... (1086)
<400>1
atgaagctcttctccactgtcaccgcagccctcgcgctcctagccaccaccgtcaacgga60
ac3cccatg8tccgtcaggcagaagaagcctcaacctgtaccctctccggcacgtacaag120
tccggcaccgacatctcgtcctgcagcacgctcaccatcggcactctgagcgttcctgcc180
ggtgtcacgctggacctgagcaaggccaagacgggcgctaacatcaagatCtCCggt3CC240
gtcacgttcggccagaagaagtgggCGggtccgctcgtgttgcttggcggcagtaacctc300
aaggtcagcgggtccggtactcttgacggtcaggggtcttggUctggaagcaagggcag360
tcgatcactcgcccagtattcttccgtctcc柳acgtcctcagctcaactgtttctgga420
tttactattaagaacatgccgttccgUccUcagcattgtcacctgcaagg汪tacgaca480
ctgtcgggacUacgatcgactcgagcgctggc雄ggcctggccagaacacag汪cggc540
ttcgacctgactaagaacaaccatatcacgatcaccggcaacaagatctacaaccaggat600
gactgtttggcaatgcagtccagtacgaacaccgtattcagcaacaactaCtgC3gtggC660
ggtcacggUtctccatcggatcgctcggtgg纖cgctgtcaaccaaggttccacggtc720
cagggcctcacggtcaaggggtcaatagcaccaacggcctccgcatcaag780
acc"cgtggatctcaagggtcttgtgtctgatgtcacgt3caccgac3acaagctgagc840
aacgtcaagaacgccatcgtgatccactcggactacagcaagtccaagggcggatacacc900
ggtaaggccacgagcgcagtgaccatcaaggacatcaccgtctcgggtctctcaggtacg960
gcgacc￡ucctgtacg8C"cgtggcca3Ctccaaggtggtgtccaactggngttctcg1020
ggcatcactgtca柳catcC3，CgggCngtgcagcggtcaacccagcactgtcaag1080
tgctaa1086
<210>2 <211>21 <212>腿 <213>人工序列
10acgggcgcta acatcaagat c 21
<210>3
<211>24
<212>DNA
<213〉人工序列
<400>3
gacctgacU agaacaacca tatc
权利要求
1.利用辣(甜)椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg 5基因设计并合成了一对特异引物，通过PCR技术验证其特异性和灵敏度，然后对辣椒病田土壤、病茎、病叶及病果中的辣椒疫霉进行定性、定量分子检测与预警。本技术发明可对不同时期的辣椒疫霉及其致病特性进行准确检测与预警。这对特异性引物，上游引物为Pcipg 5-F，含21bp，其序列为Seq ID No2所示；下游引物为Pcipg 5-R，含24bp，其序列为Seq ID No3所示。该对特异引物扩增目的基因片段长度为357bp。
2. —种辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶A:/;^5基因分子检测技术的制备方法，其步骤如下1) 从辣椒疫霉中分离克隆尸dpg基因和靶标^c力^ 5基因界定的具体步骤省略 基因分离克隆和靶标基因界定步骤已在前一发明专利中详述，故在本发明中不再详述，其5基因全序列如Seq ID No:l所示。2) A;/;^ 5基因特异引物设计与合成(l)引物设计利用DNAMAN对辣椒疫霉等疫霉种菌，曲霉等真菌，番茄等植物，胡萝卜 欧式杆菌等细菌及其他能征集到的所有多聚半乳糖醛酸酶基因序列进行比对，设计并合成 ,c/;^ 5基因的特异性引物。2)户c/;^ 5基因特异性引物验证(1) 参试种菌制作与菌体收集；(2) 参试种菌DNA提取；(3) 特异性引物对参试种菌DNA的PCR扩增；(4) 扩增结果比较分析。3) 户"'pg 5基因特异引物灵敏度验证(1) 辣椒疫霉菌游动孢子DNA提取。(2) 土壤卵孢子DNA提取及纯化。(3) 分别进行PCR扩增。(4) 综合比较分析，检验入选引物的灵敏度。4) 入选特异引物对辣椒疫病茎、病果、病叶检测(1) 病茎、病叶、病果的DNA提取。(2) 入选特异引物对不同模板DNA进行PCR扩增。(3) 综合比较不同病组织PCR检测结果，确定入选引物对辣椒疫病组织的检测技术。5) 、入选引物对病田土壤、病茎、病果、病叶辣椒疫霉菌的分子检测(1)分别提取辣椒疫霉病田土壤菌体、病茎、病果、病叶DNA。 (2 )对不同模板的DNA进行PCR扩增，比较对不同来源辣椒疫霉菌的检测效果。 (3)综合比较入选特异引物对不同来源辣椒疫霉菌的PCR检测结果，正确预警辣椒疫 霉菌消长动态和疫情发展趋势。
全文摘要
本发明属于分子生物学领域，利用辣(甜)椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg 5基因设计并合成了一对特异引物，通过PCR对多个参试种菌进行特异性验证，然后对土壤辣椒疫霉卵孢子和游动孢子进行定量分子检测，验证其灵敏度，在此基础上，对辣椒病田土壤、病茎、病叶及病果中的辣椒疫霉菌进行定性、定量分子检测与预警。应用该技术发明可对不同时期的辣椒疫霉菌及其致病特性进行检测与预警，便于制定综合防控技术策略，确定选择最佳防控时期对辣椒疫霉菌进行综合防控和高效治理，真正从源头上控制病菌的侵染与危害，提高辣(甜)椒疫霉病综合防控的效果。
文档编号C12Q1/68GK101643782SQ200910018358
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月10日 优先权日2009年9月10日
发明者张修国 申请人:山东农业大学