一种改进的gfp表达细胞的增殖检测方法

专利名称：一种改进的gfp表达细胞的增殖检测方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法。
背景技术：
绿色荧光蛋白(GFP)是从水母体内分离获得的一种发光蛋白，吸收蓝光，发绿光，且 不需光发射辅因子。由于GFP在哺乳动物细胞稳定、荧光显微镜又容易检测，因此GFP已 是常用的标记分子，是目前分子生物学家和细胞生物学家用于目的蛋白示踪和定量的最有用 的研究工具。但对表达GFP的细胞进行常规固定(常用的固定液有70%乙醇、4%多聚甲醛、 丙酮、甲醇等)、核酸变性(甲酰胺、盐酸)、多重染色后，GFP信号明显减弱，甚至无法检 测。图像结果往往需要进行后期处理。
BrdU是用于标记增殖分裂的细胞，属于DNA结合型荧光染料，其基本原理是利用溴化脱 氧尿嘧啶(BrdU)作为胸苷类似物可以掺入到新增殖细胞合成DNA中。BrdU会随着细胞分裂 而不断被"稀释"，以至于最终完全不能检出，因而不适合做长时期的体内标记追踪。其主 要优点是抗BrdU抗体与BrdU反应后显色可即刻显现标记的情况，其缺点细胞分裂时标记强 度降低或标记丢失，增殖的细胞逐渐降低细胞BrdU标记。因此，BrdU适用于短期标记增殖 的细胞。
DAPI， 4，，6—diamidino-2—phenyl indole, dihydrochloride (DAPI)，中文名称是4， 6-联脒-2-苯基吲哚，是一种常用的显现活细胞或固定细胞DNA的荧光染料，其作用机理与 溴化乙锭等染色剂的机理类似它们与DNA双螺旋的凹槽部分可以发生相互作用，从而与DNA 的双链紧密结合。没结合DNA的DAPI荧光很弱，而一旦和DNA结合，表现出很强的荧光。 并且对细胞相对无毒，不改变细胞的超微结构。结合后产生的荧光基团的吸收峰是358nm而 散射峰是461nm，正好UV (紫外光)的激发波长正好是356nm，使得DAPI成为了一种常用的 荧光检测信号。DAPI最大的优点就是标记技术简单，而标记效率很高(起初达100%),标 记的细胞能清楚的观察到；缺点是细胞分裂将导致DAPI淬灭，以及收縮蛋白或其它蛋白染 色所造成的强背景色等将引起标记强度降低。因此DAPI也仅适于短期定量分析。

发明内容
本发明的目的是改进以往的细胞固定、核酸变性方法及处理时间，从而达到各染色结 果互不干扰，GFP颜色明亮易检的目的。
针对上述目的，本发明提供了一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法，解决了传统固定、染色方法处理后GFP颜色减弱的问题，使GFP颜色明亮，易于检测；且避免了甲酰胺、 盐酸酸化等方法步骤繁琐的缺点。
本发明是通过以下技术方案实现的
一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法对以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告蛋白的 细胞进行BrdU掺入染色和DAPI复染，然后常规防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察，拍照。 具体使用时，可以采用以下步骤
1) 向表达GFP的细胞内加入BrdU至终浓度30 u g/ml， 37'C培养条件下标记0。 5 3h (视细胞增殖能力而定)；
2) 以Hank's液配制0.1%甲醛(体积浓度)，培养条件下固定细胞10 12h;
3) Hank's液冲洗3次，每次5 min;
4) 0.2%TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用20min;
5) 用Hank's液冲洗3次，每次5 min;
6) 100U/ml DNase I (DNA酶)，室温处理5min;
7) TBS沖洗3次，每次5min;
8) 室温封闭液封闭lh;
9) 加入抗BrdU—抗，4'C湿盒中过夜；
10) TBS冲洗3次，每次5 min;
11) 加入二抗，37。C孵育30min;
12) TBS冲洗3次，每次5min;
13) 加入DAPI，室温2min;
14) TBS冲洗3次，每次5min;
15) 防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察，拍照。 所述培养条件是指5%<:02、饱和湿度、温度37'C。
所述Hank's液的pH在7.2 7.4,其中各物质的浓度为5.4mmol/L KC1， 0.3mmol/L Na2HP04， 0.4mmol/L KH2P04， 4.2腿ol/L NaHC03, 1.3腿ol/L CaCl2， 0.5mmol/L MgCl2， 0.6mmol/LMgSO4， 137腿ol/LNaCl， 5.6mmol/L D-葡萄糖。
所述TBS的pH为7.6，其中各物质的浓度为150mmol/LNaCl,20mmol/LTris.Cl。
所述封闭液为正常血清，为本领域中所常用，可以视二抗来源确定。 采用本发明的方法检测表达GFP的细胞，其GFP颜色保持鲜亮，信号强度较培养状态 下无明显改变，彻底解决了传统固定、染色方法处理后GFP颜色减弱的问题，使GFP颜色明亮，易于检测和后续多重标记，且避免了甲酰胺变性、盐酸酸化等方法步骤繁琐的缺点。 本发明方法适用于多种细胞，并可在此基础上进行多种后续标记。结果可分析以GFP为
报告蛋白的目的基因的转染率以及目的基因对细胞增殖的影响及相关抗原检测。
本发明与现有技术相比，操作简单，避免了常规固定方法和甲酰胺变性、盐酸酸化等对
GFP的影响，可以更好的保持GFP的荧光信号。本发明将BrdU掺入染色、DAPI复染与GFP
表达细胞相结合，GFP信号仍能保持到与培养条件相当强度，取得了意想不到的效果，有创造性。


图1为转染腺病毒细胞培养条件下表达GFP;
图2为常规固定、染色后所得GFP图片与本发明的方法所得GFP亮度图片的比较B为 常规固定、染色后所得GFP图片，C为本发明的方法所得GFP亮度图片。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作逬一步的说明
实施例对GFP表达细胞进行增殖检测，步骤如下
1) 向表达GFP的细胞内加入BrdU至终浓度30 H g/ml， 37"培养条件下掺入lh;
2) 以Hank's液配制0.1%甲醛(体积浓度)，培养条件下固定细胞12h;
3) Hank's液冲洗3次，每次5 min;
4) 0.2°/。TritonX-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用20min;
5) 用Hank's液冲洗3次，每次5 min;
6) 100U/mlDNase I (DNA酶)，室温处理5min;
7) TBS冲洗3次，每次5 min;
8) 正常山羊血清室温封闭lh;
9) 加入抗BrdU—抗，4。C湿盒中过夜；
10) TBS冲洗3次，每次5min;
11) 加入羊抗小鼠二抗(罗丹明标记)，37'C孵育30min;
12) TBS沖洗3次，每次5min;
13) 加入DAPI，室温2min;
14) TBS冲洗3次，每次5min;
15) 防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察，拍照。 所述培养条件是指5%<:02、饱和湿度、温度37'C。所述Hank's液的pH在7.2 7.4,其中各物质的浓度如下；5.4mmol/L KC1， 0,3mmol/L Na2HP04， 0.4mmol/L KH2P04， 4.2mmol/L NaHC03 ， 1,3隨ol/L CaCl2， O.5mmol/L MgCl2， 0.6mmol/LMgSO4, 137mmol/LNaCl， 5.6鍾ol/L D-葡萄糖。
所述TBS的pH为7.6，其中各物质的浓度为150mmol/LNaCl， 20mmol/LTris.Cl。 本实施例中表达GFP的细胞为携带GFP的兔血管外膜成纤维细胞。 显微镜观察结果如图1所示，由图可见，进行BrdU、 DAPI标记后，GFP颜色保持鲜亮， 信号强度较培养状态下无明显改变。
另外对GFP表达细胞进行常规固定、染色、封片、显微镜观察，得到GFP图片作为对 照，与经本发明的方法处理后得到的GFP图片对比(如图2所示)。由图可见，经本发明的 方法处理后得到的GFP图片中GFP颜色鲜亮，信号强度强，图像结果无需进行后期处理， 且各染色结果互不干扰。
本发明与常规方法相比，其不同点如表l所示
表l
常规方法本发明的方法
固定剂4%多聚甲醛 (配制繁琐且4'C不能超过1周)0.1%甲醛
固定时间20-40 min10-12 h
固定条件室温37 °C
常规条件培养条件
BrdU暴露1NHC1冰上lOmin 2NHC1室温20min (HC1需现用现配)甲酰胺IOO'C变性5min 冰浴冷却 (操作复杂)DNasel室温5min
GFP颜色损失保持
权利要求
1.一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法，其特征在于对以绿色荧光蛋白作为报告蛋白的细胞进行BrdU标记检测和DAPI复染，然后常规防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察，拍照。
2. 根据权利要求1所述的一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法，其特征在于具体步骤如下1) 向表达GFP的细胞内加入BrdU至终浓度30yg/ml， 37'C培养条件下掺入0, 5 3h;2) 以Hank's液配制0.1%甲醛，培养条件下固定细胞10 12h;3) Hank's液冲洗3次，每次5 min;4) 0.2。/。Triton X-100作用20 min;5) Hank's液冲洗3次，每次5 min;6) 100U/mlDNase I ，室温处理5min;7) TBS冲洗3次，每次5min;8) 室温封闭液封闭lh;9) 加入抗BrdU—抗，4'C湿盒中孵育过夜；10) TBS冲洗3次，每次5min;11) 加入二抗，37'C孵育30min;12) TBS冲洗3次，每次5min;13) 加入DAPI,室温2min;14) TBS冲洗3次，每次5min;15) 防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察，拍照。
3. 根据权利要求2所述的一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法，其特征在于所述培养及固定条件是指5%<202、饱和湿度、温度37'C。
4. 根据权利要求2所述的一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法，其特征在于所述Hank's液的pH在7.2 7.4,其中各物质的浓度为5.4mmol/LKCl， 0。3mmol/LNa2HPO4,0.4mmol/LKH2PO4， 4.2mmol/LNaHC03， 1.3mmol/LCaCl2, 0.5mmol/LMgCl2， 0.6匪ol/LMgS04， 137mmol/LNaCl， 5,6mmol/LD-葡萄糖。
5. 根据权利要求2所述的一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法，其特征在于所述TBS的pH为7.6，其中各物质的浓度为150mmol/LNaCl,20mniol/LTris'Cl。
全文摘要
本发明公开了一种改进的GFP表达细胞的增殖检测方法对以绿色荧光蛋白(GFP)作为报告蛋白的细胞进行BrdU掺入染色和DAPI复染，然后常规防荧光淬灭剂封片，荧光显微镜观察，拍照。采用本发明的方法检测表达GFP的细胞，其GFP颜色保持鲜亮，信号强度较培养状态下无明显改变，彻底解决了传统固定、染色方法处理后GFP颜色减弱的问题，使GFP颜色明亮，易于检测和后续多重标记，且避免了甲酰胺变性、盐酸酸化等方法步骤繁琐的缺点。
文档编号C12Q1/68GK101643780SQ20091001823
公开日2010年2月10日 申请日期2009年9月1日 优先权日2009年9月1日
发明者王旭平 申请人:山东大学齐鲁医院