专利名称：：一株枯草芽孢杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一株枯草芽孢杆菌及其应用，属于微生物领域。
背景技术：
：种植业每年因病虫害造成巨大的损失。病虫害的防治有多种方法，化学防治在世界农业发展史上起着重要的作用。几个世纪以来，化学农药在植物病虫害的防治中发挥了巨大作用，为农业的增产、稳产和提高品质做出了重要贡献。但是由于过量施用和滥用农药导致地力衰退和环境污染。尤其近几年来由于农药残留超标，严重影响了人们的生活质量。在当前蔬菜、水果等农作物无公害栽培中，微生物农药越来越受到重视。因为它们不仅防治病虫害的效果好，而且对环境友好、对农作物无污染，病虫对其不易产生抗药性。因此，在生物农药中，以微生物农药用途多、应用前景最为广阔。芽孢杆菌属的细菌为好氧或兼性厌氧的杆菌，广泛分布在水、空气和土壤中。芽孢杆菌在孢子状态下稳定性好，能耐氧化；耐挤压；耐高温，能长期耐60。C高温，在120。C温度下能存活20分钟；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，是饲料微生物中可100%直达大小肠的活菌。同时本品具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少抗生素药物的使用，增强免疫力的优点，因而在生物防止病虫害中起着重要作用。目前芽孢杆菌属用于防止病虫害主要有枯草芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。
发明内容本发明的目的是提供一株新的枯草芽孢杆菌，它可以用作生物肥料以及生物农药，作为生物农药可以防治植物多种病害。本发明枯草芽孢杆菌(Saa7/wsw6rifc)Bs-03是从山东省林业科学研究院实验苗圃土壤中采用土壤稀释分离法分离获得到的，已于2009年04月23日保藏于中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.3038。本发明枯草芽孢杆菌(5ac///^Bs-03CGMCCNo.3038具有以下微生物学特性菌落圆形、近圆形扩展，表面干燥，污白色或淡黄色，菌体杆状，单生或成短链，周生鞭毛，革兰氏阳性，具芽孢。本发明枯草芽孢杆菌(Bacj/hwBs-03CGMCCNo.3038的培养方法或繁殖方法(1)普通培养采用NA培养基保存；实验室液体培养采用NYBD液体培养基，NYBD配方牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g,氛化钠5g，水1000mL，pH7.3;大量发酵培养配方(重量百分数)豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉0.44%，碳酸钙0.44%,鱼粉0.47%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.03%,其余为水，pH7.5。该枯草芽孢杆菌(万a"7/船Bs-03CGMCCNo.3038可以用作生物肥料以及生物农药。其作为生物农药可以防治植物多种病害，如枯草芽孢杆菌(5fld/Z船ra6rfto)Bs-03CGMCCNo.3038通过叶面施用能够防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃等多种作物的白粉病、烂根病、霜霉病、疫病、黄萎病。直接施用于土壤或者拌种可以预防棉花、豆类禾口花生等由大丽轮枝孢KW"'〃w附da/z'ae、镰刀菌Ftfon'wwspp、曲霉属j^ergz7/usspp、链格孢属爿tema〃'"spp和丝核菌属i/^o加m'aspp所引起的根部和种子的真菌病害。枯草芽孢杆菌(5acz7/wBs-03CGMCCNo.3038还可以通过产生类似细胞分裂素、植物生长激素等物质，促进植物生长，抵抗病原菌的侵染。通过试验表明枯草芽孢杆菌(5ac〃/^ra6n'fc)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液防治棉花黄萎病效果显著，防治效果达到71.11%,且棉花生长健壮，无药害产生。图l为枯草芽孢杆菌(Sac/〃wwwMfc)Bs-03CGMCCNo.3038放大15000倍的光学显微镜照片。具体实施例方式实施例1:1、枯草芽孢杆菌(5fl"7/MW秘to)Bs-03CGMCCNo.3038的分离与纯化枯草芽孢杆菌(5ac说MjBs-03CGMCCNo.3038是从山东省林业科学研究院实验苗圃土壤中采用土壤稀释分离法分离获得。(l)土样采集从土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分呙用；(2)培养基平板制备将NA(营养琼脂)培养基和PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板，所述NA培养基配方为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g、琼脂15g，蒸馏水1000mL;所述PDA培养基配方为马铃薯(去皮切块)300g，葡萄糖20g，琼脂20g,蒸馏水1000mL。G)称取lg土样于灭菌试管中，加100mL无菌水，振荡，制成10—2土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10—7;(4)取上述稀释后的土壤悬浮液0.5mL，加到培养基平板(NA或PDA平板)上，用弯玻棒涂匀，置于培养箱26'C恒温，培养5-7天。2、菌株鉴定(1)微生物学特性菌落圆形、近圆形扩展，表面干燥，污白色或淡黄色，菌体杆状，单生或成短链，周生鞭毛，革兰氏阳性，具芽孢。(2)生化特性如表1所示。表l枯草芽孢杆菌(Bfla7fasTOWfo)Bs-03生化特性生理生化反应项目结果生理生化反应项目~~—""结果—注"+"表示生长或反应阳性；"_"表示不生长或反应因性实施例2:枯草芽孢杆菌(^"d/ZwwwWfe)Bs-03CGMCCNo.3038的发酵NB培养基(市售)配方蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L。NYBD培养基配方牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000过氧化氢酶+苯丙氨酸脱氨酶一鸟氨酸脱羧酶一赖氨酸脱羧酶一脲酶一精氨酸双水解酶一硝酸盐还原+H2S产生一口引哚产生一甲基红CM.R)试验+V.P试验+明胶液化+葡萄糖+蔗糖+乳糖+麦芽糖+维一糖阿拉伯糖木糖鼠李糖甜醇肌醇七叶灵水解淀粉水解丙二酸钠柠檬酸钠+++I+II++I++I+唐唐唐淳享唐梦萝梦薛醇g乳藻籽露梨芽半海棉甘山mL，pH7.3。大量发酵培养配方(重量百分数)为豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉0.44%，碳酸钙0.44%，鱼粉0.47%，硫酸镁0.01%,磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5。1、枯草芽孢杆菌(Bac"/附TO6rtfo)Bs-03CGMCCNo.3038菌种活化将斜面上保存的菌种接种到NA试管斜面上面，于28'C培养24h。2、枯草芽孢杆菌(Sac/〃船rato'to)Bs-03CGMCCNo.3038种子液的制备从斜面上挑三环菌接种到装有NB培养液的三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振荡培养，28°C，200r/min培养8h即可获得种子液。3、枯草芽孢杆菌(5a"/船rato'fo)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液的制备以培养液初始pH7.2，初始接种量2%，装液量50mL/500mL，将种子液接入到装有NYBD发酵培养液的500mL三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振荡培养，28°C，200r/min培养48h。4、枯草芽孢杆菌(5a"/wwwMfc)Bs-03CGMCCNo.3038发酵培养将摇床发酵的菌液接种到装有100mL培养基的200mL种子发酵罐，初始pH7.5，温度30'C，通风比1:0.8(V/V)，从菌种接种后12h菌体生长处于指数生长中期，转入2000L的发酵罐，以70%的罐装量，pH7.5，温度为3(TC，前期通风比1:0.8(V/V)，后期通风比l:1(V/V)发酵，菌落可达40亿/g。实施例3:枯草芽孢杆菌(5"c说wwwto7z;y)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液的应用为了明确枯草芽孢杆菌(Bflc;Z/itfBs-03CGMCCNo.3038发酵液对棉花黄萎病的防治增产效果，为其推广应用提供依据。我们于2008年5-6月份在东营试验基地进行此试验，现将试验结果报告如下1供试材料及方法1.1供试药剂按本发明发酵方法生产的枯草芽孢杆菌(5ac!7/wHw6"fc)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液；50%多菌灵可湿性粉剂(江苏新沂农药有限公司生产，市售)。1.2供试作物与防治对象供试作物为棉花，品种为中棉17;防治对象黄萎病1.3试验地情况试验地设在山东省东营市河口区新户乡老鸦村，该村棉花黄萎病近几年发生严重，且防治困难，试验在920平方米(1.38亩)棉花田内，土质为轻壤土，有机质含量为1.01%,pH值为7.7，所有试验小区栽培条件及管理措施一致，施药时棉花黄萎病处于发病初期。1.4试验设计及安排本试验设枯草芽孢杆菌(_Sad//R^w6ft'fc)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液IO倍，50%多菌灵可湿性粉剂可湿性粉剂600倍液及不施药清水作对照共3个处理，重复4次，共12个小区，各小区随机排列，小区面积为33.4平方米。于2008年5月29日、6月6日和13日各灌根一次，亩用药液500千克，喷药器械为工农一16型喷雾器，将喷头取下喷灌。1.5试验调查及计算方法1.5.1气象条件第1次施药(5月29日)当日少云，风力3级，最高气温为27°C，最低气温为14°C，相对湿度为85%。第2次施药(6月6日)，当日多云，风力4级，最高气温为2rC，最低气温为19°C,相对湿度为75%;第3次施药(6月13日)当日晴，风力3级，最高气温为29'C，最低气温为25'C，相对湿度为85%。1.5.2药效及安全性调查药效调査第1次施药后第7d和最后一次施药后14d进行调査。每小区采用4点取样法，每点査2株，调査全部叶片，调査发病率，记录病情级数并计算病情指数。安全性调査于第一次施药后7d和14d观察棉花的安全性，如有药害发生，详细描述药害症状并按药害程度分级标准确定药害程度。分级方法(以叶片为单位)0级无病班l级病班面积占整个叶面积的5%以下；3级病班面积占整个叶面积的6°/。-10%:5级病班面积占整个叶面积的11%-25%;7级病班面积占整个叶面积的26%-30%;9级病班面积占整个叶面积的50%以上；1.5.3调查时间和次数8施药前调査病情基数，下次施药前及末次施药后10d调査防治结果,1.5.4药效计算方法药效按式(1)、(2)计算^!^各级病叶数x相对级数值)_n病情指数=^-、田^nX^。——~xl00调査总叶数x9防治效果《)、—C幻x潛-空白对照区施药前病情指数；x100(1)(2)-空白对照区施药后病情指数；式中CKC——CK,——PTo——药剂处理后施药前病情指数；PTl一药剂处理后施药后病情指数。1.5.5对作物的直接影响观察药剂对作物有无药害，记录药害的类型和程度。此外，也要记录对作物的其他有益影响(例如促进成熟、刺激生长等)。用下列方式记录药害(a)如果药害能被测量或计算，要用绝对值表示，例如株高、结实率。(b)在其他情况下，可以按下列两种方法估计药害程度和频率(l)按照药害分级方法记录每小区的药害程度，以一、+、++、+++、++++表示。药害分级方法—:无药害+:轻度药害，不影响作物生长；++:中度药害，可复原，不会造成作物减产；:中度药害，影响作物正常生长，对作产量和质量造成一定程度的损失；:严重药害，作物生长受阻，产量和质量损失严重。(2)将药剂处理区与空白对照区比较，评价其药害百分率。同时，要准确描述作物的药害症状(矮化、褪绿、畸形等)。2结果2.1供试药剂对棉花黄萎病的防治效果表2结果显示，枯草芽孢杆菌(5ac说船to6"7&)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液及50%多菌灵可湿性粉剂对棉花黄萎病有较好的防治效果，一次用药7d防治效果均达到50%以上，其中枯草芽孢杆菌(5ac/〃wsw6rito)Bs-03CGMCCNo.3038防治效果最好。从棉花黄窭病田间试验的病情指数来看(表2)，一次用药7d，枯草芽孢杆菌(^ad//^■ywMto)Bs-03CGMCCNo.3038防治效果为71.11%，明显高于50%多菌灵可湿性粉剂的防治效果。东营13/7,2008表2各处理防治棉花黄萎病试验效果调査原始数据<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>2.2棉花安全性调查经施药7d和14d观察，各药剂处理区与对照区相比，棉花生长正常，无药害产生，说明枯草芽孢杆菌发酵液在供试浓度对棉花安全。2.3枯草芽孢杆菌发酵液对棉花增产效果表3枯草芽孢杆菌(Sflc/〃www&ft'fc)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液棉花试验结果分析表处理小区产量(籽棉kg)折亩产量(籽棉kg)比对照组增产重复I重复II重复m平均kg/亩%122.8823.1623.0823.04460.854.813.50220.5220.0320.1420.23406//注小区面积33.4m2;处理1为枯草芽孢杆菌(5ad〃仏wwto'to)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液，处理2为对照组药剂(50%多菌灵可湿性粉剂)。将表3资料进行Duncan's方差分析计算结果处理处理1处理2方差分析表:变异来源处理间处理内总变异样本数44均值23.040020.2300标准差0.11780.2099平方和15.79220.173815.9660自由度16均方15.79220.0290F值545.184显著水平0.0000Duncan多重比较(下三角为均值差，上三角为显著水平)No.12均值23.0400020.2300012.810020.0000字母标记表示结果处理均值处理123.04000处理220.230005%显著水平1%极显著水平aAbB由以上结果可知，在棉花上喷灌枯草芽孢杆菌发酵液(3a"7/ws犯&"fc)Bs-03CGMCCNo.3038，处理区比对照区每亩增产棉花54.8公斤，增产率为13.50%:效果十分明显。在PO.01水平上具有显著性差异，说明枯草芽孢杆菌发酵液的促生增产作用非常明显。3小结3.1从病情指数和防治效果来看，枯草芽孢杆菌(Bacz7/附甜M&)Bs-03CGMCCNo.3038对棉花黄萎病具有较好的防治效果，在一次施药后7<1可达70%以上，明显好于对照药剂，差异显著。3.2从棉花增产效果看，枯草芽孢杆菌(5aa7/z^raZ7rifo)Bs-03CGMCCNo.3038对棉花具有明显的促生增产效果，一次施药后增产率为13.50%。1权利要求1、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Bs-03CGMCCNo.3038。2、权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Baczmwra6"&)Bs-03CGMCCNo.3038的分离与纯化方法(1)土样采集从山东省林业科学研究院实验苗圃土壤表层到15cm处取样200g，一个地点采几个样本，混合过粗筛，取25g作分离用；(2)培养基平板制备将NA培养基和PDA培养基融化，分别倒入灭菌培养皿，冷却，制成NA和PDA平板，所述NA培养基配方为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl5g，琼脂15g，蒸馏水1000mL;所述PDA培养基配方为去皮切块的马铃薯300g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL;(3)称取lg土样于灭菌试管中，加100mL无菌水，振荡，制成10'2土壤悬浮液，静置5min，按10倍梯度稀释到10'7;(4)取上述稀释后的土壤悬浮液0.5mL，加到培养基NA或PDA平板上，用弯玻棒涂匀，置于培养箱26'C恒温，培养5-7天。3、权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Sac!7Z"sraMfe)Bs-03CGMCCNo.3038的发酵方法1)枯草芽孢杆菌(Sa"7/^TOMto)Bs-03CGMCCNo.3038菌种活化将斜面上保存的菌种接种到NA试管斜面上面，于28'C培养24h，所述NA培养基配方为蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaC15g，琼脂15g，蒸馏水1000mL;2)枯草芽孢杆菌(5fl"'〃wwwto'fc)Bs-03CGMCCNo.3038种子液的制备从斜面上挑三环菌接种到装有NB培养液的三角瓶中，置于恒温振荡培养箱中，振荡培养，28°C，200r/min培养8h即可获得种子液，所述的NB培养基配方为蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，蒸馏水1L;3)枯草芽孢杆菌(5fl"7towto'&)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液的制备以培养液初始pH7.2，初始接种量2%，装液量50mL/500mL，将种子液接入到装有NYBD发酵培养液的500mL三角瓶中，置于恒温振荡培养箱屮，振荡培养，28°C，200r/min培养48h，所述的NYBD培养基配方为牛肉浸膏8g，酵母浸膏5g，葡萄糖10g，氯化钠5g，水1000mL，pH7.3;4)枯草芽孢杆菌(5a"'〃w;y;ra&/7fc)Bs-03CGMCCNo.3038发酵培养将摇床发酵的菌液接种到装有100mL培养基的200mL种子发酵罐，初始pH7.5，温度3(TC，通风体积比1:0.8，从菌种接种后12h菌体生长处于指数生长中期，转入2000L的发酵罐，以70%的罐装量，pH7.5，温度为3(TC，前期通风体积比为l:0.8，后期通风体积比为l:l发酵，所述大量发酵培养配方为豆粉1.8%，玉米粉1.6%，淀粉0.44°/。，碳酸钙0.44%,鱼粉0.47%，硫酸镁0.01%，磷酸二氢钾0.03%，其余为水，pH7.5,所述的百分数为重量百分数。4、枯草芽孢杆菌。w〃^raWfc)Bs-03CGMCCNo.3038在防治作物的白粉病、烂根病、霜霉病、疫病或黄萎病方面的应用。5、如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌(万a"7/wBs-03CGMCCNo.3038在防治棉花黄萎病方面的应用。6、枯草芽孢杆菌(5ad〃wra^/fe)Bs-03CGMCCNo.3038在棉花促生增产力面的应用。全文摘要本发明公开了一株枯草芽孢杆菌及其应用。该枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Bs-03CGMCCNo.3038。它可以用作生物肥料以及生物农药，作为生物农药可以防治植物多种病害。本发明通过试验表明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)Bs-03CGMCCNo.3038发酵液防治棉花黄萎病效果显著，且棉花生长健壮，无药害产生。文档编号C12N1/20GK101643710SQ20091001809公开日2010年2月10日申请日期2009年8月25日优先权日2009年8月25日发明者刘幸红,峰周,张淑静,牛赡光,王清海,郑述乾申请人:山东汇丰源农业科技发展有限公司