专利名称：一种迟缓爱德华氏菌重组亚单位疫苗及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌 (Edwardsiella tarda)重组亚单位疫苗及其制备和应用。
背景技术：
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种革兰氏阴性病原菌，具广谱宿主范 围，包括人、动物和鱼类等。在我国，迟缓爱德华氏菌是多种养殖鱼类(大菱鲆、牙鲆和鳗 鱼等)的重要病原，其所诱发的爱德华氏菌病每年给水产养殖业造成巨大的经济损失。目 前迟缓爱德华氏菌病的防治主要依赖于使用抗生素和疫苗，后者只局限于小部分国家/地 区。由于抗生素众所周知的危害，其使用逐渐收到限制。与抗生素相反，疫苗被公认是综合 效应最好的病害预防措施之一。常见的疫苗包括灭活疫苗、亚单位疫苗以及核酸疫苗等。就 迟缓爱德华氏菌而言，商业化的疫苗只有灭活疫苗。较之于灭活疫苗，基于蛋白质的重组亚 单位疫苗具有免疫特异性强以及重复性较好等优点。然而目前虽有几例迟缓爱德华氏菌重 组亚单位疫苗抗原报道，其中保护效应(相对存活率)达到70%以上者只有一例(日本科 学研究者报道)。因而，具高保护效应的重组亚单位疫苗尚有待研发。
发明内容
本发明目的在于提供一种迟缓爱德华氏菌疫苗及其制备和应用方法。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种免疫保护性重组亚单位疫苗，具序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列。所述的重组亚单位疫苗的制备1)质粒pETXV21的构建将质粒pET28用Ndel/Xhol酶切，回收5. 3kb片段；以迟 缓爱德华氏菌TXl为模板，用引物XVF和XVR进行PCR扩增，产物纯化后用Ndel/Xhol酶切， 回收1. 4kb片段，将其与上述5. 3kb片段连接，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含卡那霉素 的LB固体培养基上培养，并筛选转化子提取质粒，即为质粒PETXV21 ；2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化将质粒PETXV21转化大肠杆菌BL21 (DE3)，得转 化子BL21/pETXV21 ；将BL21/pETXV21于含有Kn的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的 培养液加入新鲜的LB液体培养基中，于37°C培养至0D_为0. 5，加入终浓度为ImM的IPTG 并于37°C继续培养4-5h，然后在离心后菌液中加入裂解液，在室温摇动1-2小时；将菌液离 心，回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所编码的重 组亚单位疫苗蛋白。将上述所得的重组亚单位疫苗蛋白与菌株B187于PBS中混合，所得疫苗混合液对 迟缓爱德华氏菌具免疫保护作用。将所述疫苗混合液腹腔注射牙鲆，21天后加强免疫一次，即可使牙鲆对迟缓爱德 华氏菌侵染具抵抗作用。本发明具有如下优点
1.高保护率。本发明的重组亚单位疫苗XV21对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率 达 72%。2.应用简单，无需商业化佐剂。
图1 :His Trap HP Columns回收产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果(泳道2)。 泳道1，分子量标准。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而 非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相 应试剂盒。2.质粒、DNA连接液转化进入大肠杆菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“北京，纽英伦生物技术有限公司”；4. SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹皆按Sambrook and Russell :Molecular Cloning :A Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)进行。实施例1疫苗XV21由序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所示。疫苗XV21的制备方法1)质粒pETXV21的构建将质粒pET28(购于美国Novagen)用Ndel/Xhol酶切，回收5. 3kb片段。以迟缓 爱德华氏菌TX1(保存于CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2330，保藏证明已于20080509于申 请案200810016124. 3迟缓爱德华氏菌疫苗抗原及其制备方法中提交)为模板，用引物XVF (5’ -GCGCATATGCAATACACCAAATTGCGTT-3’，划线碱基为 NdeI 位点)和 XVR (5’-CTCGAGCACCC GGTTATACTCCT-3，，划线碱基为XhoI位点)按下列条件进行PCR :94V 60s预变性模板DNA， 然后 94°C 40s, 53°C 60s, 72°C 60s，5 个循环后改为 94°C 40s,61°C 60s, 72°C 60s，25 个循环 后再在72°C延伸反应7-lOmin。PCR产物纯化后用Ndel/Xhol酶切，回收1. 4kb片段，与上 述5.3kb片段连接，连接液转化大肠杆菌DH5ci后在含卡那霉素(Kn，50ug/ml)的LB固体 培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pETXV21 ；所述LB固体培养基组成成分按重量百分比计1. 0%蛋白胨，0. 5%酵母粉，1. 0% 氯化钠，琼脂1. 5 %，96 %蒸馏水；2)疫苗抗原XV21的诱导表达和纯化将上述步骤1)的质粒pETXV21转化大肠杆菌BL21 (DE3)(购自于“天根生化科技 有限公司”，北京)，在含有Kn(50ug/ml)的LB固体培养基上培养18-24小时，挑取一个菌落，将其命名为BL21/pETXV21。将BL21/pETXV21于含有Kn(50ug/ml)的LB液体培养基中 过夜培养；取Iml过夜后的培养液将其加入IOOml新鲜的含有Kn(50ug/ml)的LB液体培 养基中，于37°C下转速200rpm摇动培养至OD6tltl为0. 6，加入终浓度为ImM的isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside，37°C继续以转速 160rpm 摇动培养 4_5h，而后离心(5000g， 4°C，IOmin)，收集菌液，加入 5ml 裂解液(IOmM NaH2PO4, IOmM Tris, 8M 尿素，pH 8. 0)，在室 温于摇床上缓慢摇动1-2小时，直至菌悬液变澄清为止。将菌液离心(10000g，30min, 4°C )， 回收上清。将上清用His Trap HP Columns(购于GE Healthcare)回收，将回收产物进行 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺浓度为12% )，发现只有一种蛋白(图1)，其分子量 与疫苗抗原蛋白XV21的分子量吻合；由于XV21上带有His标签，故进一步用His抗体(购 于“天根生化科技(北京)有限公司”)进行免疫印迹检测，发现回收的蛋白能与His抗体 特异性结合，说明其带有His标签。这些结果表明所回收得到的蛋白即为具序列表SEQ ID Nol中的碱基序列的保护性疫苗抗原蛋白XV21。序列表SEQ ID NolATGCAATACACCAAATTGCGTCTGATGGTTGGTGGGCTGGCGCTGGCCATGGTCGGTACCAGCGTGCAT TCTGAAACGCTACAGCCCGATCCGGCCTGGCAGGAGGGCAAGCTGCCGAACGGTTTTTCTTGGCAGATCCTGGCGAC GCCGCAGCGTCCATCCGATCGTATTGAGCTACGTATGATCGTCAACACCGGCTCGCTGTCGGAGTCTCCTCAGCAGG TGGGGTATGCCCACCTGCTGCCGCGCCTGGCTCTGGCGCAGGGCAAGGGGCTTGACGCGACCGCCCTGCAGTCGTTT TGGCAGCAGGCAATCGATCCCGTGCGTCCGATGCCGGCGGCGATCACCTCGTATGATTACACCAGCTATAACCTGAG CCTGCCCAATAACCGCCCCGATCTGATGAAGGATGCCCTGCGCTGGCTGGCCAATACCGCCGGCGATCTGCAGGTGA ATGCCGAGACGGTCGGTGAGGCGCTGAAAGGCAGCGACAGCCGCGTGATGGCGCTGCCCGGCGAAGCCGGCGATCCC TGGTGGCGCTACCGTCTGAAGGGCTCCAACCTGCTGGGCCATGAGCCTGGACGAACGGCGGCGGTTCCGCTGGCGCC GGCGCAGCTGAAGGCCTTTTATCATCAGTGGTATACCCCCGATGCGATAACGCTGTACGTGGTCGGCAACGTGGATG CCCGGGCGCTGAGCGAACAGATCAATCAGACCTTCGGCCCCCTGAGCGGCAAGCGGGAGACGCCGGCCACGGTGCCG GCGCTGCCGGCGCTGGCCGCGGCGCCGGTGAGCCTGATCGCCGATGGCGCCAAGCAGGATATTCTGTCGCTGGTCTG GGATACGCCGTGGCAGCCGATCCGTGACTCTCAGATGCTGCTGCGCTATTGGCGTAGCGACTTGGCGCGCGAGGCGC TGTTCTGGCATCTACAGCAGGTGCTGGCCAACAGCGCGCTGAAGGGCAGCGTGAACCTGAGCTTTAACTGCCAGGTG CAGTATCAGCGCTCGCAGTGCGCGATCCATTTAGAGACGGCTCAGGCGTCATTGAGCAAGACGCTGGCGTTTATCGC CGATGAGATGTCCGCGCTGCGCGATGATGGGATTACCCAGCCGGAGTTTGACACCCTGCTGGGGCAGAAGAACGATC AGCTGAGTCACCTGTTCGCCACCTATGCGCGAACCAATACCGACATCCTGATGAGTCAACGCCTGCGCTCACAGCAA AGCGGCGTGGTGGACATCGCTCCGGAGGCGTATCAGAAGCTGCGCCAGACGTTCCTGAGCGCGCTGACGCTGGACGA TATTAACCAAGAGCTGCATATCATGCTGTCGCGGGAGCCCGCCGTGGTGCTGCGTCAGCCGCGCGGTGAGGCCGAGG AGAACGTGGGCCGCCTGCTGGAGGAGTATAACCGGGTG(a)序列特征 长度1416bp 类型碱基序列 链型双链 拓扑结构线性(b)分子类型双链DNA(c)假设否
(d)反义否(e)最初来源迟缓爱德华氏菌TXl(f)特异性名称XV21实施例2重组亚单位疫苗XV21的免疫应用步骤1)疫苗混合液的制备。将菌株B187(保存于CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 2331，保藏证明已于20080229 于申请案200810014711. 9 —种交叉保护性疫苗抗原其制备方法和应用中提交)于LB培养 基中于30°C培养至OD6tltl为0. 8，然后离心(5000g，4°C ) IOmin0收集菌体，将其悬浮于PBS 中至终浓度为2xl08cfu/ml，即为B187-PBS。而后在每毫升B187-PBS混合液中加入0. 2mg 上述实施例1步骤2纯化的疫苗抗原XV21 ；所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl,0. 02 % KCl,0. 358 % Na2HPO4. 12Η20，0· 024% NaH2PO4,其余为水。步骤2)重组亚单位疫苗XV21的免疫应用。将60条牙鲆(每条重约IOg)随机分 为2组，每组30条。将这2组分别命名为A和B组。将A组的每条鱼分别腹腔注射IOOul 上述步骤1)的疫苗混合液。将B组(对照组)的每条鱼分别腹腔注射IOOul上述步骤1) 的B187-PBS。21天后将A组的每条鱼分别腹腔注射IOOul疫苗混合液；将B组的每条鱼分 别腹腔注射IOOul PBS。步骤3)迟缓爱德华氏菌悬液的制备。在LB培养基中培养迟缓爱德华氏菌TXl 至OD6tltl为0.6，然后离心(5000g，4°C )10min。收集菌体，将其悬浮于PBS中至终浓度为 5xl07cfu/mlo步骤4)重组亚单位疫苗XV21针对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效应检测。在步骤 2)第一次免疫注射后的第34天，用上述步骤3)的迟缓爱德华氏菌悬液腹腔注射步骤2)的 两组鱼，每条鱼的注射量为lOOul。在以后的14天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。 14天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，7条；B组，25条。利用下列公式计算相对存活率 (RPS)RPS = 100x(l-免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)由此得出重组亚单位疫苗XV21针对迟缓爱德华氏菌的免疫保护效率(以RPS计) 为72%。该结果表明，按上述方法所纯化和应用的XV21是一种高效的保护性抗原，能够显 著提高牙鲆对迟缓爱德华氏菌的感染能力。疫苗SEQUENCE LISTING<110>中国科学院海洋研究所<120> 一种迟缓爱德华氏菌重组亚单位疫苗及其应用<130><160>2<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1416
1651701750100]CCCtggtggCgCtacCgtCtgaagggctccaacCtgCtgggccatgag5760101]ProTrpTrpArgTyrArgLeuLysGlySerAsnLeuLeuGlyHisGlu0102]1801851900103]cctggacgaacggcggcggttCCgCtggcgCCggcgcagctgaaggcc6240104]ProGlyArgThrAlaAlaValProLeuAlaProAlaGlnLeuLysAla0105]1952002050106]ttttatcatcagtggtataccCCCgatgcgataacgCtgtacgtggtc6720107]PheTyrHisGlnTrpTyrThrProAspAlalieThrLeuTyrValVal0108]2102152200109]ggcaacgtggatgccegggcgCtgagegaacagateaatcagaccttc7200110]GlyAsnValAspAlaArgAlaLeuSerGluGlnlieAsnGlnThrPhe0111]2252302352400112]ggcCCCCtgageggcaagegggagacgCCggccacggtgCCggcgctg7680113]GlyProLeuSerGlyLysArgGluThrProAlaThrValProAlaLeu0114]2452502550115]CCggcgCtggccgcggcgCCggtgageCtgategccgatggcgccaag8160116]ProAlaLeuAlaAlaAlaProValSerLeulieAlaAspGlyAlaLys0117]2602652700118]caggatattCtgtcgCtggtctgggatacgCCgtggcagCCgateCgt8640119]GlnAsplieLeuSerLeuValTrpAspThrProTrpGlnProlieArg0120]2752802850121]gactctcagatgCtgCtgCgCtattggCgtagegacttggcgCgCgag9120122]AspSerGlnMetLeuLeuArgTyrTrpArgSerAspLeuAlaArgGlu0123]2902953000124]gcgCtgttctggcatctacagcaggtgCtggccaacagegcgctgaag9600125]AlaLeuPheTrpHisLeuGlnGlnValLeuAlaAsnSerAlaLeuLys0126]3053103153200127]ggcagegtgaacCtgagetttaactgccaggtgcagtat cag cgc tcg10080128]GlySerVal Asn Leu Ser Phe Asn Cys Gln Val Gln Tyr Gln Arg Ser0129]3253303350130]cagtgcgcgatecatttagagacggetcaggcgteattg age aag acg10560131]GlnCysAla lie His Leu Glu Thr Ala Gln Ala Ser Leu Ser Lys Thr0132]3403453500133]Ctggcgtttategccgatgag atg tccgcgCtgCgCgat gat ggg att11040134]LeuAlaPhelie Ala Asp Glu Met Ser Ala Leu Arg Asp Asp Glylie0135]3553603650136]acccagCCggagtttgacaccCtgCtggggcagaagaac gat cag ctg11520137]ThrGlnPro Glu Phe Asp Thr Leu Leu Gly Gln Lys Asn Asp Gln Leu0138]3703753800139]agtcacCtgttcgccacctatgcgcgaacc￡1￡ acc^ac ate ctg atg0140]SerHisLeuPheAlaThrTyrAla Arg Thr Asn Thr AsplieLeu Met0141]3853903954000142]agtcaaCgCCtgCgCteacagcaaageggcgtggtg^ac ate get ccg0143]SerGlnArgLeuArgSerGlnGln Ser Gly Val Val AsplieAla Pro0144]4054104150145]gaggcgtatcagaagCtgCgCcagacgttcctg age^cg ctg acg ctg0146]GluAlaTyrGlnLysLeuArgGlnThrPheLeuSerAlaLeuThr Leu0147]4204254300148]gacgatattaaccaagagCtgcatateatgctgtcg"gg gag ccc gcc0149]AspAsplieAsnGlnGluLeuHislie Met Leu Ser Arg Glu Pro Ala0150]4354404450151]gtggtgCtgCgtcagCCgCgCggtgaggccgaggagaac gtg ggc cgc0152]ValValLeuArgGlnProArgGlyGluAlaGluGluAsnValGly Arg0153]4504554600154]CtgCtggaggagtataac egg gtg0155]LeuLeu Glu Glu Tyr AsnArgVal0156]4654700157]<210>20158]<211>4720159]<212>PRT0160]<213>迟缓爱德华氏菌TXl0161]<400>20162]MetGlnTyrThrLysLeuArgLeuMetValGlyGlyLeuAlaLeu Ala0163]1510150164]MetValGlyThrSerValHisSerGluThrLeuGlnProAspPro Ala0165]2025300166]TrpGlnGluGlyLysLeuProAsnGlyPheSerTrpGlnlieLeu Ala0167]3540450168]ThrProGlnArgProSerAspArglieGluLeuArgMetlieVal Asn0169]5055600170]ThrGlySerLeuSerGluSerProGlnGlnValGlyTyrAlaHis Leu0171]657075800172]LeuProArgLeuAlaLeuAlaGlnGlyLysGlyLeuAspAlaThr Ala0173]8590950174]LeuGlnSerPheTrpGlnGlnAlalieAspProValArgProMet Pro0175]1001051100176]AlaAlalieThrSerTyrAspTyrThrSerTyrAsnLeuSerLeu Pro0177]1151201250178]AsnAsnArgProAspLeuMetLysAspAlaLeuArgTrpLeuAlaAsn0179]1301351400180]ThrAlaGlyAspLeuGlnValAsnAlaGluThrValGlyGluAlaLeu0181]1451501551600182]LysGlySerAspSerArgValMetAlaLeuProGlyGluAlaGlyAsp0183]1651701750184]ProTrpTrpArgTyrArgLeuLysGlySerAsnLeuLeuGlyHisGlu0185]1801851900186]ProGlyArgThrAlaAlaValProLeuAlaProAlaGlnLeuLysAla0187]1952002050188]PheTyrHisGlnTrpTyrThrProAspAlalieThrLeuTyrValVal0189]2102152200190]GlyAsnValAspAlaArgAlaLeuSerGluGlnlieAsnGlnThrPhe0191]2252302352400192]GlyProLeuSerGlyLysArgGluThrProAlaThrValProAlaLeu0193]2452502550194]ProAlaLeuAlaAlaAlaProValSerLeulieAlaAspGlyAlaLys0195]2602652700196]GlnAsplieLeuSerLeuValTrpAspThrProTrpGlnProlieArg0197]2752802850198]AspSerGlnMetLeuLeuArgTyrTrpArgSerAspLeuAlaArgGlu0199]2902953000200]AlaLeuPheTrpHisLeuGlnGlnValLeuAlaAsnSerAlaLeuLys0201]3053103153200202]GlySerValAsnLeuSerPheAsnCysGlnValGlnTyrGlnArgSer0203]3253303350204]GlnCysAlalieHisLeuGluThrAlaGlnAlaSerLeuSerLysThr0205]3403453500206]LeuAlaPhelieAlaAspGluMetSerAlaLeuArgAspAspGlylie0207]3553603650208]ThrGlnProGluPheAspThrLeuLeuGlyGlnLysAsnAspGlnLeu0209]3703753800210]SerHisLeuPheAlaThrTyrAlaArgThrAsnThrAsplieLeuMet0211]3853903954000212]SerGlnArgLeuArgSerGlnGlnSerGlyValValAsplieAlaPro0213]4054104150214]GluAlaTyrGlnLysLeuArgGlnThrPheLeuSerAlaLeuThrLeu0215]420425430
AspAsplie Asn Gln Glu Leu HislieMetLeuSer Arg GluPro
435 440445
ValValLeu Arg Gln Pro Arg GlyGluAlaGluGlu Asn ValGly
450455460
LeuLeuGlu Glu Tyr Asn Arg Val
465470
权利要求
一种免疫保护性重组亚单位疫苗，其特征在于具序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。
2.—种权利要求1所述的重组亚单位疫苗的制备，其特征在于1)质粒pETXV21的构建将质粒pET28用Ndel/Xhol酶切，回收5.3kb片段；以迟缓爱 德华氏菌TXl为模板，用引物XVF和XVR进行PCR扩增，产物纯化后用Ndel/Xhol酶切，回 收1. 4kb片段，将其与上述5. 3kb片段连接，连接液转化大肠杆菌DH5 α后在含卡那霉素的 LB固体培养基上培养，并筛选转化子提取质粒，即为质粒PETXV21 ；2)疫苗蛋白的诱导表达和纯化将质粒PETXV21转化大肠杆菌BL21(DE3)，得转化子 BL21/pETXV21 ；将BL21/pETXV21于含有Kn的LB液体培养基中过夜培养；取过夜后的培养 液加入新鲜的LB液体培养基中，于37°C培养至OD6tltl为0. 5，加入终浓度为ImM的IPTG并于 37°C继续培养4-5h，然后在离心后菌液中加入裂解液，在室温摇动1-2小时；将菌液离心， 回收上清；将上清液用凝胶柱回收，即得序列表SEQ ID No. 1中的碱基序列所编码的重组亚 单位疫苗蛋白。
3.一种按权利要求1所述的重组亚单位疫苗的应用，其特征在于将上述所得的重组 亚单位疫苗蛋白与菌株B187于PBS中混合，所得疫苗混合液对迟缓爱德华氏菌具免疫保护 作用。
4.按权利要求1所述的重组亚单位疫苗的应用，其特征在于将所述疫苗混合液腹腔 注射牙鲆，21天后加强免疫一次，即可使牙鲆对迟缓爱德华氏菌侵染具抵抗作用。
全文摘要
本发明涉及分子生物学及免疫学领域，具体的说是一种迟缓爱德华氏菌重组亚单位疫苗及其制备和应用方法。所述疫苗具序列表SEQ ID No.1中的碱基序列。其制备方法构建疫苗抗原表达质粒pETXV21，将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，诱导表达后回收重组蛋白，将其与菌株B187混合后溶于PBS，即为对迟缓爱德华氏菌具免疫保护作用的疫苗混合液。将疫苗混合液腹腔注射鱼类，即可达到免疫保护目的。
文档编号C12R1/19GK101991844SQ20091001795
公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月21日 优先权日2009年8月21日
发明者孙黎, 焦绪栋 申请人:中国科学院海洋研究所