专利名称：麸质蛋白单克隆抗体的生产及其细胞株的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及麸朊蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其用途，属于食品的生物检测
技术领域。
背景技术：
据FA0(1995)报告，90%以上的食品过敏是由蛋、奶、鱼、甲壳类、花生、大豆、坚果类及小麦8类常见的过敏食物引起。麸质蛋白是谷物特别是小麦的主要过敏原，引起最常见的病症是乳糜泻——由于对麸质(面筋)不能耐受所致的慢性小肠吸收不良综合症。症状有顽固的腹泻、体重下降、贫血、乏力、手足抽搐等。麸朊是引起乳糜泻的主要原因。麸质蛋白主要存在于麦制品中，如面粉、饼干、饲料、含麦添加剂等，不过市场上有无麸小麦，专为乳糜泻患者或其他特殊需要，当以区分。 麸朊(gliadin)，也称醇溶蛋白，不溶于水及无水乙醇，但溶于70X 80X乙醇。麸朊这类蛋白主要存在于植物种子中，如玉米醇溶蛋白、麦醇溶蛋白等，在成熟小麦种子中，醇溶蛋白约占贮藏蛋白总量的40%，是组成面筋的重要蛋白质。分为四种亚型，a-，|3-， y-和"-醇溶蛋白，分别占醇溶蛋白总量的25%、30%、30%和15%。
检测过敏原麦醇溶蛋白的方法有ELISA、放射过敏原吸附实验、对流免疫电泳法、组胺释放试验等。ELISA检测灵敏度高、特异性和重复性好，但分析时间较长、商品化程度低。放射过敏原吸附实验灵敏度高、准确性好，但是对人体血清具有依赖性，而人IgE抗体占血清比重小，抗体特异性也不确定，且特异结合能力不同，因此难标准化。对流免疫电泳法操作简便、快速，但分辨力低、精确度不及ELISA。组胺释放试验灵敏度和特异性较高，但灵敏度与食品是否新鲜十分相关，组胺测定必须在抽血后24h之内完成，造成应用的局限性。根据各种方法的优缺点，综合选择ELISA检测卵清蛋白。 目前，市面上已有醇溶蛋白检测试剂盒，但大都是国外生产，价格高、运输周期长。我们研制的醇溶蛋白ELISA检测试剂盒，以自制的杂交瘤细胞株分泌的抗醇溶蛋白单克隆抗体包板，采用双抗夹心法，可以定性或定量检测醇溶蛋白。检测灵敏度高、特异性好，价格低于国外，开创了国内生产醇溶蛋白检测试剂盒的先例。
发明的内容 本发明要解决的技术问题是提供一株麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其分泌的单克隆抗体。
本发明要解决的另一个技术问题是提供麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其
分泌的单克隆抗体在医学检验领域的用途。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏编号为CCTCC-C200944。 —种由杂交瘤细胞株CCTCC-C200944分泌的单克隆抗体。 麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株用于制备Gliadin单克隆抗体的用途。 —种由杂交瘤细胞株CCTCC- 分泌的单克隆抗体用于制备检测Gliadin过敏原的试剂的用途。 麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株2D8，于2009年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学，保藏编号为CCTCC-C200944，建议的分类命名为杂交瘤细胞。 我们采用上述杂交瘤细胞制备了麸朊蛋白单抗。该单抗，可用于通过Elisa和免疫印记的方法检测样品中的Gliadin过敏原的含量。 本发明的优点是1)染色体稳定，分泌IgG2a型抗体；2)分泌抗体效价高，直接培养上清可达到l : IO万；3)小鼠腹水可达到lmg/mL;效价可达到1 : 100万。可以用protein G纯化；4)分泌抗体可以用于Elisa和免疫印迹(westernblot)实验(1 : 1000)。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本发明公开内容所作为的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
图1为单克隆抗体染色体分析结果。
具体实施例方式实施例1 :制备杂交瘤细胞 材料和来源 抗原麸质蛋白(gliadin， Sigma) 动物6-8周龄ABLB/c鼠(中国医学科学院实验动物所) 骨髓瘤细胞系SP2/0(中国科学院典型培养物保存委员会细胞库) 完全和不完全佐剂(SIGMA公司) RPMI-1640基础培养基、完全RPMI-1640培养基、HT培养基、HAT培养基(以上试剂均购自Gibico公司)
方法
免疫动物 采用搅拌混合法，将等体积的抗原溶液和佐剂均匀混合。 初次免疫每只鼠打4针(腋下腹股沟淋巴结丰富处)每针0.2mL，用完全福氏佐剂；21天后第二次免疫剂量针数同上但用不完全福氏佐剂；14天后第三次免疫剂量针数同上但不加佐剂；10天后加强免疫( 一般为融合前3天)50 ii g im\iv ;三天后取脾采血。 饲养细胞的分离 未免疫的BALB/c小鼠，摘眼球放血。分离血清作为抗体检测时的阴性对照血清。小鼠拉颈处死后浸泡于75%酒精中5min，于解剖台板上固定后剪开腹部皮肤后撕开暴露出腹膜，用酒精棉球反复搽拭后，小心在腹膜剪开一小口 ，小心用习惯吹入5mL的不完全培养基，收集腹冲液；后用5mL不完全培养基反复冲洗，两次腹冲液合并收于离心管中，1000r/min离心10min，弃上清。加HAT培养至5mL将沉淀的细胞重悬并混匀，作细胞计数，然后根据细胞计数结果，补加HAT培养基，使细胞浓度为2X107mL。将细胞悬液加入到4块96孔板中，每孔100 y L(约两滴)，然后置37°C 5% C02的培养箱中培养。
免疫脾细胞的制备将免疫的BALB/c小鼠，摘眼球放血。分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清。小鼠拉颈处死后浸泡于75X酒精中5min，于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤，可看到脾脏，换眼科剪镊，在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜，取出脾脏置于已盛有lOmL不完全培养基的平皿中，轻轻洗涤，并细心剥去周围结缔组织。将脾脏移入另一个盛有lOmL不完全培养基的平皿中，用注射器内芯在200目的铜网内挤压研磨脾脏，使脾细胞浸入平皿中的不完全培养基。用吸管吹打数次，制成单细胞悬液。为除去脾细胞悬液中的大团块，可用100目钢铜网过滤。收获脾细胞悬液，1000r/min离心10min，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10mL不完全培养基混匀，取上述悬液计数。通常每只小鼠可得1 X 108-2.5X 108个脾细胞。
骨髓瘤细胞系 骨髓瘤细胞生长快通常以l : IO传代，(37t:，5XC02孵箱，用含15XFBS的完全RPMI-1640培养基(Gibico公司)，融合前，使大多数细胞处于对数生长期，细胞形态均一，细胞汇合度适中(大约10-80% )，收获骨髓瘤细胞，1000r/min离心10min，用不完全培养基离心洗涤1-2次，然后将细胞重悬于10mL不完全培养基混匀，取上述悬液计数。
细胞融合 将脾细胞与骨髓瘤细胞SP/0按4 : l混合于一支50mL离心管中，补加不完全培养基至30mL。充分混匀；1000r/min离心5-10min，将上清尽量吸净；在手掌上轻击融合管底，使沉淀细胞松散均匀；用lmL吸管在30秒内加预热至37。C的50% PEG(pH = 8. 0) lmL，沿管壁边加边轻轻滴加；然后立即在60秒内将细胞全部吸入吸管中，静止30秒，然后在30秒内将细胞吹入离心管中，用吸管在5min内加30mL预热至37°C的不完全培养基；1000r/min离心10min，弃去上清后加入40mLHAT培养液；分装96孔细胞培养板；7-10天后用HT培养基换出HAT培养基；(第14天后可用普通完全培养基)；经常观察杂交瘤细胞生长情况，待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测。抗体检测的方法为Elisa法，以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照，以免疫鼠血清作为阳性血清，进行Elisa常规操作。
克隆培养杂交瘤细胞 植被待克隆的杂交瘤细胞悬液，用含15%血清的HT培养基稀释至每毫升含2. 5、15和50个细胞3种不同的稀释度；按每毫升加入5X 104_1 X 105细胞比例，在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入铺好饲养细胞的细胞培养板中；每种杂交瘤细胞分装96孔板一块，每个稀释度32孔，每孔量为0. lmL，每孔杂交瘤细胞数分别为O. 5、3和10 ;37°C、7. 5% C02湿润培养7-10天，出现肉眼可见的克隆即可检测抗体；早倒置显微镜下观察，标出只有单个克隆生长孔，去上清作抗体检测；取康图检测阳性孔德细胞夸大培养，并冻存。
选择Elisa阳性值高的克隆，细胞活力强底面积覆盖> 1/4放大到24孔板当细胞量大于1/2底面积进行亚克隆化，选取10-15个克隆亚克隆2-3个，亚克隆化后14天选取细胞状态良好的测定Elisa对其阳性值高的在进行扩增选取5-10个亚克隆2-3个；同法再进行亚克隆，共三次，20代。
杂交瘤细胞培养 用10%的完全培养基培养细胞，371:、5%0)2，隔一天换一次液；细胞大而透亮，大小均一为佳。 实施例2 :Elisa法筛选杂交瘤细胞
主要试剂
包被液碳酸盐缓冲液pH = 9. 6， NaHC03 2. 93g ;加蒸馏水至lOOOrnL。冲洗液和稀释液:T :PBST pH = 7. 4 :NaCl 8. 0g ;KH2P04 0. 2g ;NaHP04 12H202. 9g ;
KC1 0. 2g ;Tween 0. 5mL加蒸馏水至lOOOmL。 封闭液1% BSA(lg/100mL购置SIGMA公司)4.显色液TMB，每lmLTMB加入3 ii L 2mg/mL的抗氧化剂NaS203. 5H20 A液0. 2M Na2HP04 (28 . 4g/L) 25. 7mL 0. 1M拧檬酸(19. 2g/L) 24. 3mL H202 0. 1 % ;加蒸馏水50mL B液TMB3. 90g 柠檬酸10. 52g EDTA 1. 86g 甘油2000mL DMSO 300mL，加热熔解后加蒸馏水至lOOOOmL. 5.终止液(2M H2S04):蒸馏水178. 3mL，逐滴加入浓硫酸(98% )21. 7mL。
方法 包板浓度5 ii g/孔，4t:过夜，甩板洗涤3-6次，拍干；
封闭1% BSA每孔100iiL，37。C，1小时; —抗取每孔培养上清100iiL加入酶标板中，37。C l小时，洗板3次，2min/次，拍干。 二抗加入HRP标记的羊抗鼠IgG稀释比是l : 3000(SIGMA公司)，每孔100iiL，37°C 1小时，洗板3次，2min/次，拍干。 显色先加A液50 ii L/孔；再加B液50 ii L/孔。避光15min。
终止50 ii L/孔2M H2S04
波长450nm记录分析。
三.结果 在融合后用Elisa左效价测试融合后大约11天左右新生的杂交瘤细胞达底面积的1/10-1/4，在培养上清中可以检测到。 细胞株的选择需要考虑上清中的抗体的量受多因素的影响、杂交瘤细胞的数量、杂交瘤细胞的分泌抗体的能力、杂交瘤细胞的生长状态、残余脾细胞、上清液的量等等因素。因此细胞株的选择不能单看效价值得高低，要综合各方面因素来选择。本实验选择2D8细胞株扩增与冻存，并于2009年6月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址武汉大学，保藏编号为CCTCC-C200944，建议的分类命名为杂交瘤细胞。
实施例3 :动物体内制备单克隆抗体
材料和来源 小鼠成年BALB/c小鼠，年龄> 15周，(中国医学科学院实验动物所)
腹腔处理前体重分别是1号30. Og， 2号29. lg
用液体石蜡处理后体重分别是31. 2g， 2号30. 6g
细胞株CCTCC-C200944。 培养基选择10%的胎牛血清完全培养基，(Glbico)
方法 选择生长状态好的SP2/0细胞进行扩增培养，细胞生长密度不宜过大，最好不超
底面积的80%。大约每只小鼠需8瓶(25cm培养瓶)细胞，每瓶约含5X 106细胞。 腹腔处理小鼠腹腔内注射高压过的液体石蜡每只0. 7mL，处理后10天至2个月
都可用。 注射细胞收集对数生长期的杂交瘤细胞，离心洗涤1-2次重悬浮生理盐水中，调整好浓度(浓度为1 X 107-2X 107mL)，每只老鼠腹腔内注射0. 8mL。 接种后观察接种后第l-5天，两只小鼠无明显不适，体重略微增加(分别郑家0. 7g和0. 8g)从第6天开始腹部明显膨隆，体重1天之内徒增0. 9g和1. lg。之后必须在一周内老鼠体重下降时抽取腹水(3-5mL)，腹水3000rpm5min室温离心收集细胞注入腹腔已处理好的老鼠体内可以加快产生腹水的时间，约在注射后第3天可见腹部膨隆。
腹水的处理3000rpm室温离心收集细胞，在4t: 12000r/min， 15min除去上层油质和下层细胞成分和其它的沉淀物，收集上清，测定抗体效价，分装，_701:冻存备用，或冻干保存。经测定，小鼠腹水可达到0.6-lmg/mL;效价可达到1 : 360万。
纯化方法将Hitrip protein G安装到蛋白纯化仪上，流速为速度lmL/min，先用lOmL去离子水平衡，再用50mL平衡缓冲液(50m M Tris-Cl， pH = 8. 0)平衡亲和柱，取硫酸氨沉淀后的腹水用上样环上样5mL，再用平衡缓冲液平衡至基线跑平，再用10mL的洗脱液(0. 1M甘氨酸pH二 5.0)洗脱，；收集穿过峰和洗脱峰，洗脱峰用中和液(1M Tris-Cl pH=8. 0)迅速将洗脱液的pH调至7. 2左右。对收集到的各管进行SDS-PAGE凝胶电泳分析纯度及浓度差异，选择浓度和纯度高的。用超滤管浓縮，10000rpm，4t:，20min。(抗体的保存添加终浓度为0. 1%叠氮钠和1%的BSA于_701:长期保存。)
实施例4 :体外法获得单克隆抗体 —、选择经过三次亚克隆化的2D8细胞株进行体外培养，首先用含10%完全培养基培养细胞。2D8细胞株生长活跃，能够耐受此过程，但需每日换液，稳定培养5代后液氮冻存。 二 .纯化利用蛋白G亲和层析法。将Hitrip protein G安装到蛋白纯化仪上，流速为速度lmL/min，先用10mL去离子水平衡，再用50mL平衡缓冲液(50mM Tris_Cl，pH =8. 0)平衡亲和柱，取硫酸氨沉淀后的腹水用上样环上样5mL，再用平衡缓冲液平衡至基线跑平，再用10mL的洗脱液(0. 1M甘氨酸pH二 5.0)洗脱，；收集穿过峰和洗脱峰，洗脱峰用中和液(1M Tris-Cl pH = 8. 0)迅速将洗脱液的pH调至7. 2左右。对收集到的各管进行SDS-PAGE凝胶电泳分析纯度及浓度差异，选择浓度和纯度高的。用超滤管浓縮，10000rpm，4°C ， 20min。(抗体的保存添加终浓度为0. 1 %叠氮钠和1 %的BSA于-7(TC长期保存。)
实施例6 :抗体特性的鉴定
杂交瘤细胞的染色体分析
方法 在加秋水仙素前48-36h将杂交瘤细胞传代。在培养瓶中加入秋水仙素(100 y g/mL，除菌，_201:保存)，使最终浓度为0. l-0.4yg/mL(若改用秋水仙胺则最终浓度为0. 02-0. 05ii g/mL);继续培养4-6小时，然后吹打细胞，移入离心管中，1000r/min 10min，弃上清。加入已预热到37t:的0.075mol/L KCL溶液5mL，将沉淀细胞悬浮并混匀，37。C水域15-20min。向悬液中加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸3 : 1混合)lmL，混匀，然后 1000r/minlOmin，弃去上清液本步骤的目的是将细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘 连成团款。加入固定液5mL，将细胞悬浮并混匀，室温静止20-30min，然后1000r/minlOmin， 弃去上清液；重复作操作一次；其后加5mL固定液，将细胞悬浮并混匀，封上管口，置4t:过 夜。取出离心管，1000r/min 5min，轻轻吸取上清液，根据细胞压积多少而留下0. 5-lmL固 定液，将细胞悬浮并混均后，吸取细胞悬液1-2滴，滴在刚从冰水中取出的载波片上，用口 吹散，并在火焰上通过数次，使细胞平铺于载波片上自然干燥。用新配制的10^Giemsa染 液染色10-20min，然后用自来水吸取染液，自然干燥。 镜检选择染色体分散好，无重叠，无失散的细胞惊醒观察分析。每份标本应计数 100个完整的中期核细胞，并注意观察是否有标志染色体。
结果染色体稳定，见图1 。
实施例7 :单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定
— 材料 1.包被液碳酸盐缓冲液pH = 9. 6， Na2C03 1. 59g ;NaHC03 2. 93g ;甲蒸馏水至 lOOOmL. 2.冲洗液和稀释液:T :PBST pH = 7. 4 :NaCl 8. Og ;KH2P04 0. 2g ;NaHP0412H20 2. 9g ;KCl 0. 2g ;Tween 0. 5mL加蒸馏水至lOOOmL。
3.封闭液1% BSA(Biochrom AG公司)4.显色液TMB，每lmLTMB加入3 ii L 2mg/mL的抗氧化剂NaS203. 5H20 A液0. 2M Na2HP04 (28 . 4g/L) 25. 7mL 0. 1M拧檬酸(19. 2g/L) 24. 3mL H202 0. 1 % ;加蒸馏水50mL B液TMB3. 90g 拧檬酸IO. 52g EDTA 1.86g 甘油2000mL DMSO 300mL，加热熔解后加蒸馏水至lOOOOmL. 5.终止液(2M H2S04):蒸馏水178. 3mL，逐滴加入浓硫酸(98% )21. 7mL。 二方法( — ) 1.包板浓度50 ii g/mL， 4。C过夜，甩板洗涤3_6次，拍干； 2.封闭1% BSA(Biochrom AG公司)于37。C，封闭1小时； 3. 一抗取每孔培养上清100iiL加入酶标板中，37。C l小时，洗板3次，2min/次，拍干。 4.抗体亚型无HRP标记的羊抗鼠抗体亚型稀释比是1 : 6000 (SIGMA公司)， 37°C 1小时，洗板3次，2min/次，拍干。 4. 二抗HRP标记的羊抗鼠IgG稀释比是l : 3000 (SIGMA公司)，37°C l小时，洗 板3次，2min/次，拍干。 5.显色先加A液50/孔；再加B液50/孔，37t: 10min。
6.终止50 ii L/孔2M H2S04 7.波长450nm记录分析。 1.结果单克隆抗体为IgG2a型抗体。 (二)抗体特异性检测 1.方法采用常规的WesternBlot印迹方法(免疫印迹法)测定抗体纯度，一抗 为Gliadin单抗(腹水纯化后的)，二抗为羊抗鼠IgG/HRP (中杉金桥生物技术有限公司)， ECL试剂盒(普利莱基因技术有限公司) 2.结果与LRP16多抗结果比较特异性强，几乎没有特异性反应性带形成。(三)抗体效价测定 1.方法常规ELISA法 2.试剂同ELISA法筛选杂交瘤细胞 3.结果指甲培养的上清可达到1 : 20万；小鼠腹水可达到0. 6-lmg/mL ;效价可
达到i : ioo万至i : 360万。 上述LRP16单抗适合于westernblot与免疫组化研究使用，结果显示该抗体特异 性高，背景干净。
权利要求
麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株CCTCC-C200944一种由杂交瘤细胞株CCTCC-C200944分泌的单克隆抗体。麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株用于制备Gliadin单克隆抗体的用途。麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株用于制备检测Gliadin过敏原的试剂的用途。一种由杂交瘤细胞株CCTCC-C200944分泌的单克隆抗体用于制备检测Gliadin过敏原的试剂的用途。
全文摘要
本发明公开了一种麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株及其用途，属于医学生物技术领域。麸朊蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株CCTCC-C200944。本发明的优点是1)染色体稳定，分泌IgG2a型抗体；2)分泌抗体效价高，直接培养的上清可达到1∶10万；3)小鼠腹水中抗体含量可达到1mg/mL；效价可达到1∶100万，可以用protein G纯化；4)分泌抗体可以用于免疫印迹(westernblot)实验(1∶1000)。
文档编号C12P21/08GK101698832SQ200910017430
公开日2010年4月28日 申请日期2009年7月30日 优先权日2009年7月30日
发明者林超, 梁成珠, 秦倩茹, 赵明, 陈颖, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心;中国检验检疫科学研究院;青岛宝麦德生物医药科技有限公司