专利名称：微生物的高效培养分选方法和培养装置的制作方法
敝物的i^fc^舰旅和^^g
駄领域
本发明掛共了一种敫生物的高效i^^^方法和ig^fi，以获^^生物的鄉咅养. 背景狱
自然环境中包含着大量未能获得纯培养的敝麵中。1认为目前能被分离、線和鉴定的敝 物种类仅占自然蹄在量的5%左右。绝大多謝Ml物不能被目前的纯培^^:戶;fi歸， 为*^#微 生物(unculturablemicroorganism),如海洋^^顿9%以上的种^*被士歸。m±2003^IU，鄉菌域 的53个门(按照环境16S rDNA序列划分)中，只有27个门中含有巳被i歸的微生物，而另外的26个门仅 知道其16SrDNA序列。在已線的细菌中，iX^现5个门，即麟菌门、鹏菌门、翻菌门、^^菌门 和 菌门中的一些种类會,产生生物活性物质，而这5个门中已ig^和发表的种类占所有已ig^和发表 的细薪中类的95%。据统计(iS2008年7月)，目前仅有约8500种细菌被:^§#和1^^^:表。因此，开l新 盼海消t^微歸技术，尽可能多的得到m^物纯i歸，然后筛选天然，是非常必要的。
敏去的十几年间，许多研究^M3i^t环辦品的16S rDNA克隆测j^l5确定自然鄉生物的多样性。 海洋、土壤、淡水、动植物術卩&,等自然环境中者|5 丰富的 物。Ji^卜，肖们还用宏基因组 学(Metagenomics)的方絲获^i咅养微生物的基因资源，极^#石展了人们^#^物多样性的认识， 并且推动了对自然界中f^物资源的开^ffi。然而，已有的S^K术并没有摆脱^fe物未被培养所带 来的弊崙，因为这些方齒又仅能获取一定的微生劍言息，但却无S^得足够量时lt^物细胞，从而也就 无&^面了解tt^物细胞的生命g以及m^物之间的互作规律。因此，要)^#4物的生理特14^^^深 入了解，赫要了解基因组中^S因^i^物的^i射谢S，必须获f^Ml物纯i歸。
同样，研織明土壤、銜K、辦直物体^^种环境下戶膽的绝大多数附ll^顿中类没有被i線出来， 舰切需要粒能鹏高效分离蹄而获fWtl物单克隆，特别是鹏辦麻中胁法。
自然环境中，^ini物通常与很多不同种属的其他^^物共同生长。为了充^Kim^Ht^物的特性，
必M^徵敖生物的纯培养。传统的平板涂布法是实验室微生物分离it^方法，虽然也能获得一定量的微 生物菌株，fi^6时费力且获得的微生物多样性很低。其**原因概括有以下方面
1) 经典i^方法阻碍了^k物之间的交流
自然环境中很多m^物者驟集生长，它们之间有共生、互生、寄生、赚等多种s^^f、，许多微
生物的生长都魏围环境敝物怖射;^以及其它生长因子的影响，离开原生态环境则难以生长。实验 ^典^^J往往破坏了^fe物之间的这种共生拔态，^^物之间的信息交流被阻断，生长必需的信号 針和生长因WS。
2) ig^f牛与原生态环境的差别
自然界中i^物可利用的营^t/质匮乏，多数处于"寡营养"拔态，而常规实^^14鄉§#基的 营微鹏繊高于敝物生长的自然職。常搬屯培养方^m种认识不充分，高鹏的营繊质可 能比^S^^那^fe^iM^M高浓度营^^质有繊能力的微生物，fi^j"那輕^g较漫的微生物可能有抑制乍用，对鹏鮏綱共营养成分丰富的蹄基反而会成为阻碍其复苏^fi^因素， 甚至会出I鹏4她卩速死亡(Substrate accelerated death)王嫁。
3) 氧做办迫引繊胞损伤
当自然环境中的微生物突然转入人为环境时，一^]f Jf^giS能力较3贼生长较决的m^物很决
形成卿艮可见的克隆，S^:长决的^^t^产生大M:氧化物、自由凝n超氧化物，S^ti质的产生 l数P^S^能力體或生长较漫附^fe物细胞穀踬伤，从而3^J^能生长。
4) 生機慢的敝辦媳视
在平板:@#基上， 一个離中细胞的数目至少为105个才倉調卿歐见察到，而那^^^Ig^侵、其 生^ii不到高密度的细薪中类，在培养基iffl肉眼是看不到離的，从而导m^^fe物的生长^l跌 觉，彭见为"碑歸，，。
5) 活的非可i歸(viable but nonculturable state, VBNC) ^bt态细菌的雜 细菌的VBNC状态，是指，细菌处于不良环境劍牛下，其^h细胞常縮小^^形，用常挪^#
常规餅下蹄时不能使其繁殖，但它们臓具有微活性。
针对S^fe物不能被線的原因，很多研究者提出了一蝶高^fe物可培养性6^J^法，如向培 养基中力口入微生物相互作用的信号好(如鹏高丝氨酸内酯、c鮮^AT缚)简单i魁對以1t^物间的喜 女f^流，满足tt^物生长繁殖的需泉在i^^基中添加)^ft14^分具有,能力的物质，如MIWft、超 氧化物樹機(S0D)和过氧媳麟，斷氐优势薪Wti射所产生的过氧化物、自由辭卩一^M勿J^对
其他敝物细胞的毒割乍用；鹏 ^繊# 至驢，斷氐少数几禾帷^mi物对主要雜的寡
营养m^物的竞f^T扰，而4姓体寡营养m^物可:t錄性大娥高，即^#土^￡(Dilutionculture); 将常规M物歸基进橘释，使营賴效农度斷氐，增加可歸微生物的M^。虽然不同禾號提高 了微生物的可i緣性，ffi^它们只慰寸传统i^S形式上的M， 4M不倉鹏免传鄉^^去本身的弊崙， 如微生物之间的交流、i鎌斜牛的巨媳别、m^物活的非可i^lt态不能l^顶，以及生钐爱漫的微 生辦惚视錄
自然餅下 物所处的寡营养斜牛及其生存环境的驗性，使敝物御糊一种方法M^St錄 出来。所以现代1t^物i識中，提出了自燃^#^去和近自然剝牛:^#^的 :，并出现了一^if的:t歸 方法，如扩t5^i^fe这种方法樹以了1[^物生长的自然环趟。Kaeberlein等设计了一种培^g名 为扩散盒(diffusion chamber)。该扩散盒由一^h5f艰的不镞冈垫圈和两侧，的0.1 nn^虑膜纟贼。 将海洋1[4 品加^^闭的扩1^中，齒對^^样点环境斜牛的^^缸中进@^。扩t^的膜可使 化学物m盒内和环^间进行，，《S^H胞却不能自由移动。尽管用这种方法没有i歸出新的m^ 物种类，(fi^在扩t^中培养一周后却得至lJ;W^各异的皿。获得的菌株在AI合成的固体^^基 中不能生长，f践在其他微生物的雜下却倉膨成麟。这种歸方法倉^^gii^拟^^物所处的 自然环境，由于化学物质可以自由穿过薄膜，可^^证^:tJ^落间作用的,，提高了^^物的可@# 性。
鹏^i和體，鹏一定禾M^h模拟了自然蹄，提高了敝物的可赚性，但臓无法避免 获取膽簡勿鄉歸所需的熟员步骤，如敝鹏離糊陬和划线纯化等。
发明内容
本发明的目的是ii^一幹微生物的i^^^^^方法和if^S，以^B艮已有M的不足。 本发明麟了一禾种鄉自然斜柳敝鹏^g。 i^S包括用B隹^t^物生长離盼鹏咅 ^!、其内^M^t有多个i^^纖，下搁fei:有相应个数的层析柱，其间凭借^ 1,在體上设 有控制ii^^il的^^^帝職，腿析柱的出口端覆以25m^孔径的雕昌，并经由體接Ai^液收 。本发明il^的^gffl于微生物高效士^^，方法中~~^埋^^物的近自^^#这一步骤中。
本发明中微生物^&培养維方法的基本工艺如下1) 1t^物的采集和繊；2) ^!物的包埋； 3)包埋微生物的近自然餅培泰4)长有单克隆麟的^f叻口富蹄。详细具体的实顺案如下
1) 敝物的采集和鄉
細常规敝物样品采集方賊餅辦品，并l繊^MS少为106个/ml的敝tftffl雅埋。
2) 敝物的包埋
将±^歉鄉导到时#^物样品 说^^行包埋，以实5j^t单个微生tia行包埋。
微生物包埋的具体工艺如下
a) 用生 7乂配制无菌天然高聚,埋材料溶液(如1%至5%盼海 ^溶液，或1%至5%的低凝固 点琼月離溶液，或O. 5%至5%的结冷胶溶液)；
b) 将 后的'#^細[]入包埋材料溶液中，_@^入^^物的量为包埋材料所形成^ *的
1/10~1/100，并混合均匀得到敝物和聚恤溶瓶 C)将J^tt^物和聚^tr溶液按小于i: 5比例加入含司細0的石蜡油虚直物油中，IP^均匀，用 麟L化法，制备成包含粒径均一微商的乳瓶
d)細相应的固化方法，将乳液中的微滴固化成麟，用无菌^7k洗涤微球，赶将油完全洗去，
得到包埋有单个敝物的微球。
3) 将战包埋有单个敝顿敖球(包埋微生物)进瓶自然娜歸，線的具体工艺是
a) 将上一步骤中包埋有单个tt^物的微^A^析柱中，层析柱出口端覆以25^K離昌，防止微 球冲出，且能使长出微球的i^物随i歸翻咄层析法
b) 将层析ti&j(A^S箱中，^Ai^^^f瓦中的无菌寡营^^^基^析，口^mA;
c) ffiig生长M^T培^m赶包埋有单个敝物的微球内有单克隆形成，然后进行下j。
4) 长有单克隆微球的她和加富培养
翻Al^^就细胞仪維的方法将上1骤中;fel^导到的长有单克隆的微球維出来，进一 步加富歸，获得爐微生物克隆。
±^包埋有单个微生斷微球的近自然劍牛培养是在本发明专门设计辦莫拟自然劍牛的微生辦§^
置中来进行的。
本方法倉^高效的培养和^t微生物，为获徵敖生物纯i^m寺别是m^物新种Jti共了if^fe并且
大量 了传统方激取微生物纯培养所需的工作量和劳动力。将单克隆,^M96孑鹏鹏默 力歸变得更加容易，并为获微生辦屯織后下游的研繊共了方便，如对获f魏蹄的敝物腳A 测序，确定期中属；研究m^物生理和基因功能；研究m^物的^i射^t)^。
图i本发明的高Sfc^，:^法^^呈图。
6图2本发明的^K自然劍牛妳微生物^^a。
其中1-^^^#筋2-i^^afc 3-嫩；4-體；5-^^S帝螺；6-层析法7-下搁板；
如图2，本发明包括用于维謝t^物生长離盼^St^tl、其内 板3上有多个:)^#超瓶2， 下搁板7上有相应个数的层析柱6，其间凭借作为输徴§#基的1^的體4翻，在體4上设有控 制培养基的箭遞的潦鹏审徵5，腿析柱6的出口端覆以25 的縦昌8，并经由體接AJt液雌 瓶9。本发明Jli共的^gffl于tt^物高效:t歸^^方法中^^埋1t^物的近自然i^l^这一步骤。
本发明中微生物高敏^#^^方法的基本工艺如下:1)微生物的^^f口繊:2)^^物的包埋:3)包 埋m^物的近自然斜弁歸4)长有单克隆 的^^和加富土歸。详细具体的 ^案如下
1) 微生物的采集和鄉
在自然环境，绝大多1^#^物都生长^*营养的环境中，所以m^物的4t離少，必需将环境样品 的敝物进敏银获得浓輕少为106个/ml飾鮏物翻于包埋。
微生物的鹏翻离心和滤鹏激目结合的方法。鹏环境样品直接用滤MM媳时，很容易将
滤膜堵塞直接用离心的方法，获得的样品中杂质^i^高，影响包埋。用离心的方S5fe将样品鹏， 然后再用滤ra—步^M粗滤，去除样品中的杂质，再进一步用离心^t膜的效去鄉，蔬获得杂崩 舰鹏较高的菌体，雜不仅育號高包埋的鹏率也提高了、鹏的效糊織。
2) 微生物的包埋
将战繊寻到的鹏腦口口翻麟L化法伟^W进行包埋。
用麟L化跑埋敝物可用的包埋材料广泛，如海^Ml，低凝固点琼月識，结冷胶，卡繊等。
s^然高肝材料来源广泛，具有简单可控的^^性育猁良好的生物相容性。材料胶 形成的网格
结构可以作为物鹏障，对生物体起劍雜作用；材料所具有的一定的网粉L径，可以允许氧气、营养 物和f^ff^勿的出入，以及微生物间小信号肝的交换，雜就可以保iBH胞在包埋基质中自由生长； 另外，材料所具有的t/tM性能鄉蹄'Jf魏生长微生物的生长。
麟L化法制織球的过驗将一定比例的分散相和驗相混合均匀，抽滤，使混^ia孔径均 一 ，鄉另H则形戯L化微滴，液滴扁表面剥离后形離径均一的乳液。麟到的乳鹏一
步固化，形j^立径在30 70lc^间的单分散性微球。
本效去是将单个时1M1物经行包埋，并ffl3lg帝e^物和制^W的数量，使其比例小于等于l: 10，
保证绝大多,微生辦皮单^h&埋，且一个微球中含有两个或两个以上的菌体的几對及低。
敝物包埋的具体工艺如下
a) 配制无菌天然高聚ltS埋材料溶液，如海M^I溶液，低凝固点琼月^g溶液，结冷胶溶瓶
b) 将繊后的^fe働队包埋材料溶液中，保働n入m^物的量为包埋材料所形成微^fi的
1/10~1/100 (比如500微升生^^料溶^1以制^￥均粒径为60 的 约108个，这样加入 100微升l(f个/ml的菌液，即可使#^物和,的比，1: 10)，混合均匀得至(lt^物和聚合 物溶液；
c) 将±^#4物和聚^#溶液按小于1: 5比例加入飼激0的石蜡油^i物油中，^P^均匀，用 麟L化法，鹏成包含粒径均一微商的乳瓶d)将形成的乳^ffl相应的固化方法，将乳液中微滴固化成1W，用无菌船]<^^^ ， SS将
油完全洗去，得到包埋有单个微生物时麟。
3) 包埋有单个微生^ (包埋敝物)的近自然餅線 自然IWfe物生长的环境一般^^营养的，fflM^^fe物自然原位生长环境6^對以，可以aih优势
菌株的生长，M^3寸其4也^^的生^:抑制，使衞专统ig^:S^下不倉^:长的菌株得以生长。
包埋微生tJ^對以自然剝牛附Ml物i^^g中迸衍^。丰熟乂的原位生长环^^指在i^i程
中，尽t^敝物细胞被對虫包埋，但魏自环境的所微包埋的细胞鹏,歸，飽一定禾號 上模拟了自然环境，而且由于TO的孔45駄，仿射^I和一些其他好(如信号^T)可以互相鄉，
保证不同1t^物之间信号的交流包埋tMl物是在一个开放的、遊對卜充营养的系统中，而不是在一个
封闭的系统中，樹以了大多数自然开放环境；培养中的寡营^^牛模拟了原位^^态环境。
敝物培养的具体工艺是-
a) 将上一步骤中包埋有微生物的^^A层析柱中，层析柱出口驢以25m^離昌，防止^^冲 出，且能使长出tt球Wl^fe物随培^^f出层析柱；
b) 将层析根认鹏歸箱中，親歸繊的灭菌寡营养線基(如天繊K、絲、土驗 提液)腦斤概口WA;
c) ffisi:生长鹏下歸綱，赶包埋有单个敝物的微球内有单克隆形成，然后进行下1 实验。
4) 长有单克隆微球的^f叻口富培养 这一步的目的是舰出上一步骤中@##到的长有单克隆时微球，进一步加富i歸，使其长出微球
获得大量微生物鄉鎌。左lt^物的包埋步骤中，Miffl5带ME物和制翻敛球的M，使其比例小拷 于l- 10,从而保证了绝大多数敝辦皮单怖埋，力口富i^^后获得的是一株微生物的单克隆。
可以翻AX娜鹏细胞仪m AX繊可,免荧光她等步骤，保证了微生物的活性， 臓斜瞎戯细胞仪維效斜及高，缺点是荧5^fe会对敝物活性不利。 AX她辦如下
a) 将近自然斜牛3##后的微 #至103~104个/1111，使吸取1舰的^#液时，其中仅含一^:有 单克隆的微球；用封敞将Jd^稀释谳瞎iJ96孑版中；
b) 96孑版中力B入100 200微升的加富it^基，使单克mS"^生长，获得^ffi^fe物鄉嫌。
弒细胞仪鄉鋼口下
a) 用LIVE/DEAEH^搶中的SYT0"9^fe将长有克隆^m^经行^jS,用'赋细鹏^4行維，将 长有克隆飾敖球^^(J96孔板中；
b) 96孑版中加入100 200微升的加富Jf^基，使单克ma"^生长，获得媳的^^l^fet錄。 说的加富歸基是指用于培养^ 物的特定土歸基，如海洋细駒用2216E鹏7歸線基，
陆^ffl05J用R2A:tl^凝口胰蛋白膨^^基，鹏^I用高氏l号i^^基。 鄉例l
以低凝固点琼月iH为材料配制无菌包埋材料溶液，包埋海7jC样品为例详细说明本方法的具体步骤。 1)簡勿的采集和,
a)采集青岛近海海7K聰的样品后，首知嫩,冊数，获得糊始鹏为2.7乂105个/1111;b) 用媳辩且滤^7K样进fima去除样品中狡大的固^^驟拉；
c) 取4004 Hffi滤过的7K样10000rpm离心iB^菌体，用10^f的灭菌海7jCfif ^浮，用5 的滤 麟腿，去除微駄的麟繊生繊(如纤德鞭独等)；
d) 进"^以鹏Orpm离心鹏菌体，倒掉iJl海水后，用400微的灭菌海^t悬浮菌体； 这# 后获得菌鹏为2. 7X Kf个/nd的菌液。
2) 敝物的包埋
a) 用生Sin卜7K配带脓度为战低凝固点琼月醣(凝固点27 29°C)溶液，115T顿30胸
b) 取100微升的^li后菌液，力虚顿0微升的船疑固点潮^^液中，充分混匀，37。C孵育(保证 琼月^PR嫩)。(500微州氐凝固点琼月|^溶 以制^^均粒径为60 附微球约108个， 雜加入訓微升108个/1111的菌液，即可使IM:物和微球的比働i: 10);
c) 将混合均匀的混^处溶働口A20t^W司激0的石蜡油中混合，微片刻后，将其倒A^L
寸4^S中，掛滤，使溶 ^孔径均—m懇，^raHi形戯L化微滴，从而形成包糊 一粒径微滴的乳浊瓶
d) 将,啲乳浊體于冰浴中15倂中，固鄉j^l定的微球。离心iMt球，并用灭菌海水充 分离心洗涤，将石蜡油完全te，获得粒径在30 70m^间的包埋有海^^i物的单分散微 球。
3) 包埋海^fe物的近自然餅土薪 包埋海洋微生t^模拟模拟海洋环境劍牛的微生鄉"g^S中进衍"^。 M的原位生长环境是指:
在:llf^a程中，尽t^海洋微生物细胞被判虫包埋，(S^自海洋环境的所有被包埋附敝物者降一 起i^，保证不同微生物之间信号的交流，在一定S^i:樹以了m^物生长的原位环境；包埋海# 物是在一个开放的、纖卜充海水作为培养基的系统中，模拟了海洋开放环場海拟咅养魏自微生物 生长的原位环境也模拟自然环境。 敝物蹄的具体工艺是
a) 将包埋有海洋微生物的微^A层析柱中，层析柱出口端覆以25^*嫩昌，防止i^冲出，且 能使长出微球阶海消^1物随^$# #出层析法
b) 将层析tt^ASSi^^箱中，^Ait^^f瓦的灭菌海水膽析丰斑口^MA，做为海^^fe物 生长所需的赚基;
c) 在16。C下^^t^5周，定H^样观^W内微生物的生长状况，微球内有单克隆S^形鹏， 进行雠。
4) 长有单克隆離微球的 ^ 加富蹄
a) 用LIVE/DEAD^!j盒中的SYT0"9^fe将长有克隆的^^经行^jS，用 赋细胞t^S行，，将 长有克隆W1^^I恢 版中；
b) 96孔板中力口入150微升盼海7爐八^:§#基，使单克離一步生长，获得膽的微生t^fii歸。 織例2
以海M^为材料配制无菌包埋材I^^液，包Si:壤样品为例详细说明本方法的具体步骤。 1)敝物的采集和繊a) 称艰4g环，品土^g泡^2004^灭菌的生afe7K中，充分震荡Wf吏泥样中的微生物分，lJ StK中；
b) 用繊且滤对識鹏斑滤，去除样品中駄的土翻粒；
c) 10000rpm离心粗滤过盼Sii液M菌体，用10，的灭菌4SS7Kafhi:浮，用5 的滤^& 虑，去除较小颗f4^质；
d) 以10000rpm离心iB^菌体，倒掉上清后，用200 的，生3^水悬浮菌体。 获得土壤M物的浓度约为10'个/ml 。
2) 微生物的包埋
a) 用生鹏爐带脓度为3%的海藻働溶液，115。C灭菌30舰
b) 取100微升的繊后菌液，力瞎U500微升的海il^r溶液中，充分混匀(500微升海Wfl溶W 以制 均粒径为60 繊球约108个，雜加入腦微升ltf个織菌液，即可使敝物和微 球的比值为l: 100);
c) 将混合均匀的混^r溶働nA20^ma 08%司齠0的植物油中，^^均匀后倒AJHL4I^S 中，鹏，使溶M31孔径均一,懇！鄉另HP!膨戯L化微滴，纖表面剥离后形礎立
径均一的乳浊液；
d) 孕L浊液(含海Wft微滴的石蜡油)经B的氯化韩溶液固tt2小时后，形礙急定的微球。离心收 求，用生鹏K充分离雄涤，赶将油完全絲，获得包埋有土Wfe物^m
3) 包肚壤微生物的近自然餅培养
包埋MWWi:鹏境餅的:l^l中进根歸。模拟的土鹏位生长环境是提在i^i程
中，尽11^土壤微生物细胞被與虫鹏，但絲自土断境的所有被包埋的1t4物者降一超歸，保
证不同微生物之间信号的交流，在一定禾SM細了敝物生长的原位職包肚壤M物是在一个 开放的、遊斜卜紅^SJi液作为培养基的系统中，^K了土壤开放环場土^m提液取自m^物生长
的原位环境也樹以自然环境。
鹏勿培养的具体工艺是
a) 将鹏的包埋有土麟生物的^^A层析柱中，层析柱出口端覆以25lt^滤膜，防止微球冲 出，且能4吏长出^t球6^t^物随ii^t出层析柱；
b) 将层析啦j(A,咅鎌中，,歸魏的灭菌土聽提^AM析腿口^MA，做为土壤
敝物生顿需的培养基；
c) 在28。C下鄉離周，定舰样观^W内敝物的生长状况，麟内有单克隆離形鹏， 进行維。
4) 长有单克隆離微球的AI鄉叻瞎蹄
a) 将近自然餅歸后的微^^至l()4个/ml，娜取10微升的繊液时，含有齡鹏但其 中仅含一^^有单克隆的 ;用拥嫩将±^##働瞎股6孔板中；
b) 96 版中加入150微升的R2A:t&^基，使单克Hai生长，获得^M微生鹏i歸。 鄉例3
以结冷胶为材料配制无菌，材丰4^液，以包埋fifeK样品为例详细说明本^t去的具体步骤。 1)微生物的采集和繊
10a) 采激勤JC湖环境样品后，首规微生繊冊数，获得娜嫌度为104个/ml;
b) 用滤iKfflM^Jc样进fffMbm去除样品中较大的固体颗粒；
c) 取50(X ffl滤过的水样10000卬m离心,菌体，用10，的灭菌湖水Mlfti:浮，用5 的滤 臌fijt，去除術只^:的^mil生动物(如纤M、鞭^A等)；
d) 进一步以10000rpm离心i!5^菌体，倒掉J^水后，用100微升的灭菌海水悬浮菌体； 这^^后获ff^嫩度为5X 107个/譜敝物菌液。
2) 敝物的鹏
a) 用含O. 0涨氯化f丐的蒸馏水配第M为m结冷胶溶液，115。Cg^菌30^H中；
b) 取100微升盼^^f后菌液，力口到500微升的结冷胶溶液中，充分混匀，37T孵育(保证结冷胶不 繊)。(500微升结冷胶溶M"以制^F均粒径为60m^Wm^约108个，,加入100微升5X 107个/ml的菌液，即可使 物和 的比11^1: 50);
c) 将混合均匀的混^tr溶働nA204fhtao5免司激o的石蜡油中混合，,片刻后，将其倒AM 乳^^fi中，抽滤，使溶M31孔径均一的微孑鹏，娜另Hi形戯L化徽商，从而形成包含
均一粒径微滴的乳浊液；
d) 将收穀啲乳浊體于冰浴中15倂中，固化形礙急定的微球。离心if^W，并用灭菌湖7X充
分离樣涤，将石蜡油完全絲，获得粒径在3(h70^t间的包埋有駄敝物的单分散麟。
3) 包埋銜JC敝物的近自然餅線 包埋銜乂m^tl^莫拟^7K湖环境剝牛的i歸，中进份^。 ^的原^^长环^^指在i^
过程中，尽t^、淑x敝物细胞被與虫包埋， ^*自环境的所裕皮包埋的^^物 —超歸，保
证不同微生物之间信号的交流，在一定禾ijgi:微了微生物生长的原位环場包埋淑微生物是在一个 开放的、遊斜卜充^7K作为培养基的系统中，丰對以了^;K湖开放环場銜Ki咅养魏自1t^物生长的原
位环鴻也模拟自然环境。
簡妙歸的具体工艺是
a) 将包埋有^7W^fe物的微球^A层析柱中，层析柱出口端覆以25g[^離昌，防止微球冲出，且 能使长出微球的敝物随:t^^f出层析法
b) 将层析根^A鹏薪箱中，，薪勘瓦的灭菌湖7jC腦斤腿口^A，働敏物生长 所需的培养基；
c) 在28T:下遊彭歸5周，定MSi样观^W内m^物的生长状况，鹏内有单克隆 :形鹏，
4) 长有单克隆麟微球的AI娜助噹麟
a) 将近自然餅歸后繊繊释至5X103个/ml，使吸取l嫩升的離液时，含有5叶W，但 其中仅含一^:有单克隆的 ;用扫啦将J^^^働瞎IJ96孑版中；
b) 96孑版中加入150微升的R2A培养基，使单克,1生长，获得大量^^辦屯i識。
权利要求
1、一种微生物的高效培养装置，其特征在于包括用于维持微生物生长温度的温控培养箱(1)、其内的搁板(3)上有多个培养基瓶(2)，下搁板(7)上有相应个数的层析柱(6)，其间凭借作为输送培养基的管道的软管(4)连通，在软管(4)上设有控制培养基流速的流速控制器(5)，且层析柱(6)的出口端覆以25微米的筛绢(8)，并经由软管(4)接入废液收集瓶(9)上。
2、微生物的高效培养分选方法，其基本工艺如下1) 微生物的采集和浓縮运用离心和滤膜过滤相结合的方法将采于自然环 境的微生物浓縮后，获得浓度至少为10e个/ml的微生物用于包埋；2) 微生物的包埋将上述浓縮得到的微生物样品采用膜乳化法制备微球， 以实现对单个微生物进行包埋；3) 包埋微生物的近自然条件培养将上述微球包埋的单个微生物在模拟微 生物原位生长环境的培养装置中进行培养，得到长有单克隆的微球；4) 长有单克隆微球的分选和加富培养采用人工分选或流式细胞仪分选出上一步骤中培养得到的长有单克隆的微球，并进一步加富培养以获得大 量微生物纯培养。
3、如权利要求2所述的微生物的高效培养分选方法，其特征在于微生物包埋的具体工艺步骤如下a) 用生理盐水配制无菌天然高聚糖包埋材料溶液一一1%至5%的海藻 酸钠溶液或1%至5%的低凝固点琼脂糖溶液或0.5%至5%的结冷胶溶液；b) 将浓縮后的微生物加入上述包埋材料溶液中，且加入微生物的量为 包埋材料所形成微球数量的1/10 1/100，混合均匀，得到微生物和聚合物 混合溶液；c) 将微生物和聚合物混合溶液按小于1: 5比例加入含司盘80的石蜡油 或植物油中，搅拌均匀，再用膜乳化法制备成包含粒径均一微滴的乳液；d) 再采用相应的固化方法，将上述乳液中的微滴固化成微球，用无菌 盐水洗涤微球，直至将石蜡油或植物油中的油完全洗去，即得到包埋有单 个微生物的微球。
4、 如权利要求2所述的微生物的高效培养分选方法，其特征在于微球包埋的单个微生物近自然条件培养的具体工艺步骤是a) 将得到的包埋有单个微生物的微球装入层析柱；b) 将层析柱放入温控箱中，培养基瓶内装入的无菌寡营养培养基从层 析柱进口端通入，出口端覆以25微米滤膜以防止微球流出，并使长出微球的微生物随培养液排除层析柱；c) 在近自然寡营养条件培养直至包埋有单个微生物的微球内有单克隆形成。
5、 如权利要求2所述的微生物的高效分选方法，其特征在于所述的长有单克隆微球的人工分选方法a) 将近自然条件培养后的微球稀释至103~104个/巾1，使吸取10微升的 稀释液时，其中仅含一个长有单菌落的微球，用排枪将上述稀释液加到96孔 板中；b) 96孔板中加入100 200微升的加富培养基，使单克隆进一步生长， 获得大量微生物纯培养。
6、 如权利要求2所述的微生物的高效分选方法，其特征在于所述的长有单克隆微球的流式细胞仪分选方法如下-a) 用LIVE/DEAD试剂盒中的SYTO-9染料将长有菌落的微球经行染色 后，用流式细胞仪进行分选，将长有单克隆的微球分选到96孔板中；
全文摘要
本发明涉及一种微生物的高效培养分选方法和培养装置。其特征是它包括温控培养箱，其内的上搁板有多个培养基瓶，下搁板上有相应个数的层析柱，其间有软管连通，在软管上设有流速控制器，且层析柱的出口端覆以25μm筛绢，并经由软管接入废液收集瓶。高效培养分选方法如下1)微生物的采集和浓缩；2)微生物的包埋；3)包埋微生物的近自然条件培养；4)长有单克隆微球的分选和加富培养。本方法能够高效的培养和分选微生物，为获得微生物纯培养特别是微生物新种提供了新途径，并大大减少了传统方法获取微生物纯培养的工作量，为微生物的16rDNA测序，确定其种属以及研究微生物的基因功能和代谢产物等下游研究奠定基础。
文档编号C12M1/00GK101629136SQ20091001748
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月6日 优先权日2009年8月6日
发明者冀世奇, 刘晨光, 张晓华, 张秀明, 天 肖, 苑 赵 申请人:中国海洋大学