专利名称：辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶Pcpme 1基因、蛋白的制备方法及其应用的制作方法
辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶Pc;rae l基因、蛋白的制备方法及其应用
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶基 因分离及其编码的蛋白制备方法。此外，本发明还涉及该基因编码的果胶甲基酯酶对辣椒 寄主的破坏作用。
背景技术：
植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌多种重要的细胞壁降解酶或致病酶，其中果胶甲 基酯酶(PME)是植物病原卵菌分泌的一种重要致病酶，产生于病原菌识别、定殖及与寄主互
做过程中，通过降解或软化细胞壁的果胶、中胶层及其果胶聚合体，促使病原菌侵入与定 植。因此，植物病原卵菌在侵染寄主过程中所分泌的果胶甲基酯酶是一类重要的致病因子。 果胶甲基酯酶(PME, E.C. 3. 1. 1. ll)是由细菌、真菌、卵菌和高等植物分泌的一种重要 的酸性酯酶，属水解酶，它能促进果胶的脱酯化作用，主要是从果胶的半乳糖醛酸聚糖主 链上脱去甲基，从而释放酸性果胶与甲醇，果胶甲基酯酶的作用贯穿于植物细胞新陈代谢 的全过程。研究表明植物病原卵菌能产生一系列的果胶降解酶，其中一种可能的降解途径 是通过果胶甲基酯酶的去甲基化把植物细胞壁果胶降解为多聚半乳糖醛酸和甲醇，多聚半 乳糖醛酸再被多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶降解，其中多聚半乳糖醛酸酶通过水解作用 切割糖苷键，而果胶裂解酶则通过P-消除作用将多聚半乳糖醛酸降解为寡聚半乳糖醛酸， 最终使细胞壁果胶有效的降解。此外，植物细胞壁的果胶酯化程度很高，很难直接被多聚 半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶降解，只有当果胶裂解酶对细胞壁果胶去酯化而形成酸性果胶 后，多聚半乳糖醛酸酶和果胶裂解酶才能有效的发挥其降解细胞壁的作用，这进一步说明 果胶甲基酯酶是一种重要的植物细胞壁降解酶。若干研究结果证明果胶甲基酯酶在植物病
原菌的致病机制中发挥着重要的作用。植物病原细菌果胶甲基酯酶基因克隆和耙标i因功
能特性资料积累较丰富，而植物病原真菌果胶甲基酯酶基因克隆及功能特性也有一些资料 积累，但现在还没有植物病原卵菌果胶甲基酯酶基因克隆及功能研究的资料信息。
在世界范围内，植物病原卵菌易导致多种植物的病害，给农业生产造成了严重损失， 基于果胶甲基酯酶是多种植物病原菌的重要致病酶，深入开展重要卵菌辣椒疫霉菌 (尸Aj^^射力o" ca/w/c/)果胶甲基酯酶基因分离及靶标基因编码的蛋白制作和功能分析 具重要的实践意义，可以实现对于植物病原卵菌易导致多种植物的病害的防治和研究。在 现有的技术中，没有公开或发表过辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶靶标基因在病菌-寄主互作过程 的作用。 .
发明内容
基于上述的原因，本发明提供了 l个克隆自辣椒疫霉的果胶甲基酯酶基因Pcpnier及其 蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染寄主
3及导致辣椒疫病病程发生的过程，并立足于细胞化学技术证明了该基因编码的蛋白质具有 破坏叶片组织细胞及其细胞壁结构的性能，使受害部位产生明显的症状。因此，该基因是 编码辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制病菌分 子检测技术提供充分的技术储备。
本发明所提供的果胶甲基酯酶基因，其基因序列如Seq ID No:l所示；其蛋白质氨基 酸序列为SEQ ID N0:2所示。
该基因有1038个碱基，编码一种含有345个氨基酸的蛋白质，分子量为37. 7kDa,信 号肽含有20个氨基酸(为SEQ IDN0:2序列中1-20的氨基酸)，有8个的N-糖基化位点(分 别为SEQ ID NO: 2序列中的51-53.， 61—63, 96—98.174—176， 232-234， 252-254, 290—292， 332-334号氨基酸)，无内含子。
该果胶甲基酯酶基因与JGI中的jgi/phycaf7/20609中，所有Pme基因氨基酸序列比 对，发现l个pme基因与Pcpmel基因氨基酸同源性高达99. 13%，其他结构完全相同，因此 可以确认该基因属于辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶基因。
其具体的分离制备方法为
1、 分离克隆基因具体步骤
A: 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA,用QIAEXII GEL Extraction Kit试剂构建基因 组DNA文库，将大小为1. 5Kb-3. OKb的DNA片段连接于载体PUC19，转化大肠杆菌DH5 a ， PCR鉴定文库质量；
B:根据已报道的植物、细菌、真菌的果胶甲基酯酶基因保守序列，设计简并引物Nasp (其序列如Seq ID No: 3所示)和Nsp (其序列如Seq ID No: 4所示)，利用Pooling-PCR技 术筛选辣椒疫霉DNA文库(参见plant journal, 2000, 23: 687-695),阳性克隆测序获得基因 全长。
2、 制备蛋白质的具体步骤
A:尸c;M e 1基因酵母表达载体构建，目的基因克隆至表达载体pPIC9K中； B:将上述重组表达载体线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，酵母转化子甲醇利 用表型平板筛选；
C:酵母转化子培养和果胶甲基酯酶甲醇诱导表达，表达产物生物学活性检测、SDS-PAGE 分析，果胶甲基酯酶纯化，即可得到与目的基因表达的蛋白质。
本发明所用的载体和宿住菌均为常见，pUC19为,c/wel基因宿主载体，DH5oc为宿主细 胞，pPIC9K为l基因表达载体，(戶/c力/3 /7aWoWs) GS115为该基因的表达宿主菌。
通过这种方法克隆所得的基因及按照其编码的蛋白质，可以为研究该类病毒的在辣椒 疫病株内转录表达水平和在辣椒疫病株内翻译表达水平而提供有效的依据，其具体的检测 方式如下
在辣椒疫病株内转录表达水平的检测
A:将用于克隆,c/^el基因的强致病辣椒疫霉菌接种辣椒叶片； B:发病辣椒叶片总RNA提取及cDNA合成；C:反转录cDNA第一条链合成；
D: RT-PCR检测；
E: DIG-DNA探针制备；
F: RNA转移、固定及分子杂交检测。
本技术操作釆用了常规基因转录表达检测方法，具体操作过程在后续的具体实施方式
中加以详述。
在辣椒疫病株内翻译表达水平检测步骤A:将用于克隆户c;^el基因的强致病辣椒疫霉菌接种辣椒叶片；B:提取上述病叶中的粗蛋白；
C:利用获得的,c/旭e l基因表达纯化的蛋白制备特异抗血清；
D:将B步中制得的粗蛋白转N C膜后，利用上述的特异抗血清进行Western Blot分析(实验中采用HRP标记的羊抗兔为二抗)。
本技术操作釆用了常规基因翻译表达检测方法，具体过程在后续的具体实施方式
中加以详述。
同时为了验证本发明所提供的尸c/7迈el基因编码的果胶甲基酯酶具有降解细胞壁的作用，发明人还提供了该基因编码的致病蛋白接种辣椒叶片的方法和降解细胞壁的电镜观察制作技术，具体操作步骤
A: Pc/w;el基因表达纯化蛋白接种健康辣椒叶片；
B:取接种表达纯化蛋白的辣椒叶片并呈现明显症状的部位样品固定及脱水处理；C:然后进行浸透、包埋及切片染色；D:电镜观察。
致病蛋白接种方法是借鉴同类研究成熟的操作技术，电镜观察制作技术为常规技术操作，具体过程在后续的具体实施方式
中加以详述。通过该技术进一步证明了在辣椒疫霉菌与辣椒寄主互作过程中，该基因编码的蛋白质具明显降的破坏辣椒叶片和降解细胞壁的性能。本技术为探索其它细胞壁降解酶基因簇成员致病功能特性研究提供有价值的借鉴。
综上所述，本发明提供了 l个克隆自辣椒疫霉的果胶甲基酯酶基因Pcpmel及其蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，并立足于细胞化学技术证明了该基因编码的蛋白质具有破坏叶片组织细胞及其细胞壁结构的性能，使受害部位产生明显的症状。因此，该基因是编码辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制病菌分子检测技术提供充分的技术储备。
图1. ,c/M/el基因重组表达载体示意图
图中Amp, Kana分别为氨节抗性和卡那抗性，5'A0X1为启动子，3'A0X1为转录终止子，His6是组氨酸脱氢酶基因筛选标记，EcoR I和Not I为双酶切位点，,c/w el为目的基因，SalI为线性化位点；图2./^/7忍el基因表达获得的纯化蛋白结果
图中M:标准蛋白；1为,c/股el基因在毕赤酵母GS115中的表达结果；2为Pcpme 1基因表达蛋白纯化结果；3为空载体pPIC9K表达结果，2所示的蛋白带表明获得了该基因表达的纯化蛋白，由于氨基酸序列中存在有8个N-糖基化位点，因此导致其实际分子量大于预测分子量；
图3. ,c/ /z el基因在辣椒疫病叶内转录表达水平的RT-PCR检测结果A:辣椒疫霉菌接种辣椒叶片后的ld、 3d、 5d、 7d病叶cDNA检测结果；CK+为辣椒疫霉菌的cDNA检测结果；CK-为健康辣椒叶片的d)NA检测结果；B:辣椒寄主持家基因P-actin的扩增结果；C: CK-为辣椒疫霉均接种辣椒叶片后的ld， 3d， 5d， 7d病叶RNA的检测结果；CK+为辣椒疫霉菌的RNA扩增结果。图A所示的RT-PCR检测图带亮度逐渐增强，说明接种辣椒疫霉菌的辣椒叶片Ud-7d)随着叶片发病程度的增强，该基因在辣椒病叶内的转录表达水平逐渐增强；
图4.戶c/wel基因在辣椒疫病叶内转录表达水平的Northern Blot检测结果A: 1， 3, 5， 7为辣椒疫霉菌接种辣椒叶片7d后，每间隔Id辣椒病叶的RNA检测结果；CK+为辣椒疫霉菌的RNA检测结果(阳性对照)；CK-为健康辣椒叶片的RNA检测结果(阴性对照)；B:病株和健康辣椒叶片的RNA质量检测结果。图A所示由,ciM el基因制备的探针与接种辣椒疫霉菌的病叶(Id-7d) RNA杂交信号强度逐渐增强，说明接种辣椒疫霉菌的叶片(ld-7d)随着辣椒叶片发病程度的增强，该基因在辣椒病叶内的转录表达水平逐渐增强，综合RT-PCR和Northern Blot检测结果表明，辣椒疫霉菌侵染辣椒叶片而引起叶片发病的过程中，在病菌接种叶片的7d期间，该基因转录表达水平逐渐增强；
图5.Pc/M7el基因在辣椒疫病叶片内翻译表达水平的Western Blot检测结果1, 2, 3, 4为辣椒疫霉菌接种辣椒叶片的7d内，每间隔Id尸c/M el基因在病叶内的翻译表达水平检测结果；CK-为健康叶片粗蛋白的检测结果；CK+为参试辣椒疫霉菌粗蛋白的检测结果， '
结果显示辣椒疫霉菌侵染辣椒叶片而引起叶片发病的过程中，该基因翻译表达水平逐渐增强；
图6. A^/z/el基因表达纯化蛋白对辣椒叶片细胞壁降解电镜观察结果A:/^/M el基因表达纯化蛋白对辣椒叶片细胞壁的降解效果，剑头所示；B:表达纯化蛋白钝化后对辣椒叶片细胞壁无破坏作用，剑头所示(阳性对照)；C:无菌水对辣椒叶片细胞壁无任何破坏作用，剑头所示(阴性对照)；结果显示该基因表达获得的蛋白对辣椒叶片细胞壁具明显的降解效果，由此推断该蛋白是一种具有降解细胞壁性能的蛋白，或在一定程度上是一种病程相关蛋白。
具体实施例方式
本发明所提供的实施例，均按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York:
6Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 ),或Draper， J等(Blackwell科学出版社， 1988 )所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件。 实施例l (参试辣椒疫霉菌基因组DNA文库构建)
选取强致病且具高PMEs活性的辣椒疫霉菌株为参试材料，构建基因组DNA文库，具体步骤 如下
(1) 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因组高质量DNA;
(2) 基因组DNA超声打断，将基因组DM打断后，电泳检测获得的l. 5Kb-3. OKb大小DNA片段， 采用QIAEXII GEL Extraction Kit试剂盒回收纯化；
(3) 基因组文库鉴定，适宜大小的DNA片段连接载体后，转化大肠杆菌DH5cc,取20mL菌 液涂含A即，X-gal和IPTG的LB平板，蓝白斑筛选；
(4) 随机挑取了96个克隆进行菌落PCR鉴定和测序分析，确保96个克隆中插入所需大小DNA 片段达80%以上。
实施列2 (基因克隆及测序)
根据已报道的果胶甲基酯酶基因序列设计简并引物(其序列如Seq IDNo:3所示)和Nsp (其序列如Seq ID No:4所示)，利用Pooling-PCR方法筛选基因组文库，快速分离获得目的基因
家族的多个基因成员
1. 96个克隆总质粒DNA提取(碱裂解法)
(1) 将含有质粒的大肠杆菌接种于含有抗生素LB的培养基96深孔板中，37'C,220rpm震荡， 至对数生长后期。
(2) 将培养的菌液移至80mL离心管中，4°C， 8000rpm，离心15min，弃上清。
(3) 将离心得到的菌体于每管5mL溶液I [50mM Tris-HCl ( pH8. 0 ), 10mMEDTA ( pH8. 0 )] 中重新悬浮于摇床缓慢摇动至10min,然后加O. 5mL的溶菌酶(浓度为10mg/mL),静置10min。
(4) 加10mL溶液n
混勾，室温下放置IO min。
(5) 每管中加7. 5mL冷冻溶液ni [5MKAC60mL,冰醋酸ll. 5raL， H2028. 5mL],充分混匀， 于冰块表面放置IO min,并震荡混匀3次。
(6) 4°C, 10000rpm离心10 min，重复离心至大分子DNA沉淀全部清除为止。
(7) 取上清，力口O. 6倍体积的异丙醇，混合后室温下放置IO min,然后室温下10000rpm, 离心15 min,取沉淀用70%乙醇洗两次，倒置离心管干燥。
(8) DNA回溶于3mL加内，将溶解后的提取物移至50mL的离心管中，加等体积冷冻5mol/L LiCl,混合后置于冰块2-5 min后,4。C， 10000rpm，离心IO min (沉淀大分子RNA )。
(9) 将上清移至于干净离心管(30-50mL离心管)，力口O. 6倍体积的异丙醇，混合均勻，室 温下沉淀10分钟，10000 rpm,离心10min。
(10) 倒掉上清，倒置离心管，除去残余的上清，用70%乙醇洗2次，倒置离心管干燥几分钟。(ll)沉淀溶于lmLTE或水中，于-2(TC下保存待用。
2. 16个克隆总质粒DNA提取 步骤同上，各种溶液用量均为前述的1/6。
3. 单克隆质粒DM提取
(1) 将含有质粒的大肠杆菌接种于含有适量抗生素的LB培养基中，37°C, 220-250rpm震
荡，培养至对数生长期。
(2) 取lml菌液至1. 5ml的离心管中，8000rpm离心lmin后，去上清，收集菌体。
(3) 加入200iuL预冷的溶液I,震荡悬浮菌体。
(4) 加入400)jL溶液I1,颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。
(5) 加入300iaL预冷的溶液ni，颠倒混句液体，置冰块表面5min， 1M00rpm离心5min,上
清转入另一离心管中。
(6) 加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀，12000rpm离心5min。
(7) 上层水相转入另一离心管中，加入等体积异丙醇，混勾后室温放置10min， 12000rpm 离心10min,去上清。
(8) 沉淀用7(W乙醇洗2次，倒置干燥。
(9) 回溶于30jaL TE(含20(ag的RNA酶)中，取5iaL电泳检测，其余-20。C保存备用。
4. Pool ing-PCR筛选基因组文库
采用96深孔板(2.2mL)培养单克隆，将每一深孔板所培养的克隆作为一个Super Pool， 再将此Super Pool分为6个Matrix Pool，提取Super Pool质粒，以基因组DNA作为阳性对照， 水作为阴性对照。
PCR反应程序为95°C 4 min; 94°C 1 min, 55°C 30 s, 72°C 1 min,共35个循环；最 后72。C延伸10 min。
反应体系为ddH20 ( 32. 5 n L ), 10 x buffer (5 nL)， MgCL2 ( 4 ja L ), d證(4 u L ), p710(l yL)， p1150r (1 jliL), DNA(2 m L), TaqE ( 0. 5 ju L )。
取10jnL反应产物电泳，确定含有目标基因单克隆，进行测序。借助NCBI中的BLAST程序 对获得基因全长进行同源序列比较，确定目的基因。根据基因全长序列推测获得相应氨基酸 序列，预测所得蛋白质分子量约为37.7kDa。
实施列3 (基因表达与蛋白纯化)
1. ,c/朋e l基因成熟肽序列分离
U)根据已获得的尸cp/z/el基因全长DNA序列，以参试辣椒疫霉菌的RM为摸板进行RT-PCR 扩增，获得其cDNA全长。
(2)根据其cDNA全长，设计表达引物，去除信号肽序列和3'、 5'非编码区序列，并在 上游引物 (/^卿el-GSP1:其序列如Seq ID No: 5所示)引入fc" I酶切位点和组氨酸标签,下游引物(户c;M;el-GSP2:其序列如Seq ID No: 6所示)引入;VW/酶切位点，扩增产物含尸c;M7e
l基因编码的成熟蛋白序列。
反应体系为50 )iL:扩增尸c/M el基因全长获得cDNA模板(2 n L), 10 x buf f er (5 y L )，
d證(4 iaL),戶c拜l-GSPl (1 iaL), ,c拜l-GSP2 (1 ju L ), TaqE ( 0. 5 n L )， ddH20 ( 32. 5")。
PCR反应程序为94°C 4 min; 94°C 1 min, 62。C 30 s, 72°C 1 min,共35个循环；最 后72。C延伸10 min。
取10jnL反应产物进行iy。琼脂糖凝胶电泳，送上海博亚生物有限公司测序，获得尸cp/z;e 1 基因表达序列，然后目的基因回收连接与pGEM-T Easy Vector,转化大肠杆菌DH5 a ,蓝白斑 筛选、质粒DNA酶切鉴定，筛选阳性克隆质粒pGEM-T/Pc/w e 1。
2.凡77/z e l基因毕赤酵母表达
2.1酵母表达载体的构建
(1) fcovn和AWI双酶切pGEM-T/ ,c，e l质粒，回收插入片断。
(2) 与同样双酶切的酵母表达质粒pPIC9K连接，转化大肠杆菌DH5 oc 。
(3) 转化后的加5a经Amp抗性筛选，获得菌落经37t:摇床过夜后提取质粒。
(4) 重组质粒pPIC9K/Pc/7/z/e l酶切及测序鉴定。 2. 2重组表达载体线性化
用&cl限制性内切酶(位于5， J^l区域)进行线性化酶切，以获得GS115His+Mut+表型 转化子，反应体系为
(1) 取质粒pPIC9K/,c;Mel 10 (a L (10-20 jli g)，加入5 ju L 10X H buf fer后，再加入.Sac I 3 iuL。
(2) 加(1朋20 22 iuL,总体积为40 pL (空载体pPIC9K线性化反应体系相同)。 (3)37'C反应4 h后，取少量反应液电泳检测酶切效果。
(4)完成后，将线性化载体DNA电泳，用UNIQ-IO柱式DNA胶回收试剂盒回收并纯化目的片 断，-20'C保存以备转化。 2. 3酵母转化
2.3.1毕赤酵母GS115感受态细胞制备
(1) 接种毕赤酵母GS115于3mLYPD液体培养基，30。C振荡培养过夜，然后取lmL于50mL YPD 液体培养基，30°0，振荡培养16-18小时，006 。= 1.3-1.5, 4'C、 1500g离心5分钟。
(2) 用50mL冰冷无菌水重悬细胞，然后用25mL冰冷无菌水重悬细胞，同上离心。
(3) 再用5mL冰冷的lM山梨醇重悬细胞，同上离心。
(4) 同上离心，用O. 5 mL冰冷lM山梨醇重悬细胞，终体积大为1.5mL，制备感受态细胞， 用于转化。
2.3.2重组表达载体pPIC9K/户c/M e l转化感受态细胞(1) 取80ML酵母感受态细胞与5-20)Lig线性化重组表达载体(溶于5-lOyL TE )(空载体 做对照)。
(2) 将样品加入预冷的0. 2cm电转杯，冰洛5 fflin后电转。
(3) 加入lmL lmol/L冰冷山梨醇于电转杯，后转至一个新离心管中。
(4) 将转化后的酵母菌于3(TC放置l-2h。
(5) 取200-600]uL菌液涂于MD平板上，3(TC倒置培养2-3天，检测转化子后，进行Mut7Muts 表型筛选。
2. 3. 3酵母转化子筛选与鉴定
2. 3. 3. 1酵母转化子甲醇利用表型平板筛选
(1) 酵母转化子对应接种于MD和MM平板。
(2) 3(TC培养2-4d后，测定菌落大小及数量计数。
(3) 入选均能在MD和画平板正常生长的酵母转化子，然后用PCR鉴定阳性克隆。 2.3.3.2酵母转化子基因组DNA提取
(1) 取酵母细胞,12000rpm/l分钟离心，吸除上清。
(2) 加入600 m l山梨醇buffer,加入大约50pl Lyticase，充分混匀，3(TC/30分钟，离 心4000rpm IO分钟，弃上清，破除酵母细胞壁。
(3) 加入200(j l缓冲液重悬沉淀，充分混匀。
(4) 加入20ju 1蛋白酶K溶液，混匀。
(5) 加入220ial GB缓冲液，充分混匀，7(TC放置10分钟，离心除去管盖内壁水珠。
(6) 加入220 m1无水乙醇，充分混勾，离心除去管盖内壁水珠。
(7) 再加入一个吸附柱于CB2中，离心12000rpm 30秒，倒掉废液，然后将吸附柱放入收集 管中。
(8) 向吸附柱中分别加入500ia 1、 700)al缓冲液GD,分别离心12000rpm 30秒，倒掉废液， 均将吸附柱CB2放入收集管中。
(9) 离心12000rpm 2分钟，倒掉废液，置于室温数分钟晾干。
(10) 将吸附柱转入新离心管中，滴加50-200 nl洗脱缓冲液TE,室温放置2-5分钟，离心 12000rpm 2分钟，收集至离心管中。
2.3. 3.3 pPIC9K Jftil通用引物鉴定 反应体系5(^L:
(1) 加入jftn通用引物5， Jftfl:l/iL,3' MZ 1: 1〃L。；
(2) 加入10xPCR Buffer (Mg2+free) 5 〃L。
(3) 加入MgCh (25騰1/L) 4 ^L。
(4) dNTP混合(2. 5mmol/Leach) 4 ^L。
(5) 重组酵母基因组DNA 5 ^L。 ，(6) Tap聚合酶(5U/〃L) 0. 5 ^L。
(7) ddH20 29. 5 ;iL。
扩增反应条件95°C 4分钟；94°C l分钟，54°C30秒，72°C l分钟，35个循环；72°C 10 分钟，取10 /iL PCR产物检测。
2. 3. 3. 4户c;w e l基因特异性引物鉴定 反应体系
(1) 加尸c/w e l基因特异引物户c/M/e1-GSP1 (20〃mol/L)和尸c/M el-GSP2 (20〃mol/L)各l ^L。
(2) 加10xPCR Buffer (Mg2+free) 5斗。
(3) 力口MgCl2 (25mmol/L) 4 ^L。
(4) 加dNTP混合(2. 5mmol/Leach) 4 ^L。
(5) 加重组酵母基因组DNA 5 //L。
(6) 加Tap聚合酶(5U///L) 0.5 ,。
(7) 加ddH20 29. 5 〃L。
扩增反应条件94。C 4分钟；94°C l分钟，62'C30秒，72。C l分钟，35个循环；72'C1分 钟，取样l. (W琼脂糖电泳检测。
2. 3. 3. 5外源基因多拷贝转化子筛选
(1) 制备适量YPD培养基，加入适当体积的100mg/mLG418贮备液，混匀铺制平板，制备含 不同浓度的G418 ( Omg/mL, 0. 25mg/mL, 0. 5mg/mL, 1.00mg/mL, 2.00mg/mL， 4.G0mg/mL) 的YPD平板。
(2) 吸取2mL无菌水至每个含有His+转化子的MD平板，用无菌涂布器刮取菌落，将菌体重悬 于灭菌水中。
(3) 菌悬液合后，转至50mL无菌离心管中，涡漩振荡5-10秒，分光光度计测定细胞浓度。
(4) 分别取1 xl()S个菌体细胞涂于已制备的含不同G418浓度的YPD平板。
(5) 3(TC培养2-5天后，挑取对G418最高浓度具抗性的菌落于YPD平板划线纯化，作为果 胶甲基酯酶诱导表达待选菌株。
2.4酵母转化子培养和果胶甲基酯酶诱导表达
(1) 挑取对G418具最高抗性水平的阳性菌落，接种于含25mL BMGY培养基的2S0mL摇瓶中， 28-3(TC振荡培养(250-300rpm) 16-18小时,至生长对数期，转化pPIC9K空载体的GS115菌株
为对照。
(2) 3000g离心5 min回收酵母细胞，弃上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中， OD,值达l. 0。
(3) 将培养液置于500ml摇瓶中，28-3(TC的摇床震荡培养。
(4) 间隔24小时补加100。/。甲醇至终浓度0. 5%,持续诱导。
(5) 间隔24小时取样一次，至168小时，每次取诱导培养液lmL于l. 5mL离心管中，最大转速离心2-3 min,取上清液和细胞沉淀均冻存于-7(TC。
(6)表达产物SDS-PAGE分析，然后利用DNS法测定诱导表达的果胶甲基酯酶活性。 2. 5果胶甲基酯酶融合蛋白纯化 2.5.1蛋白样品的制备
(1) 收集诱导表达的酵母转化子培养物，离心6000rpm/30min,弃沉淀，取上清。
(2) 将上清液按照6(W的饱和度加入(NH4)2S04沉淀的果胶甲基酯酶，离心8000rpm/30min, 收集沉淀。
(3) 沉淀用8ml Native Binding Buffer重新悬浮后，透析过夜弃除盐离子，透析产物即 待纯化的蛋'白样品。
2. 5.2纯化步骤
2. 5. 2. 1 Ni-NTA凝胶纯化柱准备
(1) 吸取l. 5ml凝胶树脂加入至10ml凝胶纯化Ni-NTA柱中，轻微离心使树脂沉淀至柱子底
部，流尽清液。
(2) 加入6ml双蒸水，重新悬浮树脂。
(3) 轻微离心使树脂沉淀至柱子底部，流尽清液。
(4) 加入6ml Native Binding Buffer,重新悬浮树脂。
(5) 连续重复步骤3三次。
(6) 连续重复步骤4-5三次。 2.5.2.2果胶甲基酯酶纯化
(1) 取可溶性蛋白8ml加入至Ni-NTA柱中。
(2) 轻柔搅拌使树脂在蛋白液中悬浮，吸附30-60分钟，去掉上清。
(3) 用8ml Native Wash Buffer冲洗,使树脂沉淀至柱子底部，去掉上清。
(4) 重复步骤4三次。
(5) 用8—12 ml Native Elution Buffer洗脱蛋白。
(6) 重复步骤5 —次，收集洗脱样品，取l ml洗脱液进行SDS-PAGE分析。
(7) 将洗脱液用双蒸水透析，去盐离子，获得纯的融合蛋白，SDS-PAGE分析后，按照上述 方法测定纯蛋白活性。
实施列4 (尸c/7巡el基因于辣椒疫病株内转录水平表达的RT-PCR和Northern Blot检测)
1.参试强致病辣椒疫霉菌接种辣椒叶片
(1) 参试辣椒疫霉菌于0MA基质上培养7天。
(2) 利用Petri溶液诱导产生孢子囊，4'C处理30分钟诱导产生游动孢子，配制成适宜孢子 悬浮液浓度至l x 107ml
(3) 悬滴法接种辣椒健康叶片，观察病害症状。
122. 辣椒病叶总RNA提取与cDNA合成
(1) 接种l、 3、 5、 7天的辣椒病叶经DEPC水处理后，分别取O. lg样品经液氮研磨，移入lml Trizol溶液室温静置5min。
(2) 加入0. 2mL氯仿，充分混合混匀，4'C下12000rpm/min离心15min,吸取上清，重复一 至多次。
(3) 吸取上清，每lml Trizol加入O. 25倍异丙醇和0. 25倍RNA沉淀剂，充分混匀，室温放 置IO min, 4'C下12000rpm/min离心10 min。
(4) 收集RNA沉淀，用75%乙醇洗涤2次，重复离心。
(5) 吸尽残存乙醇，或使残余乙醇挥发。
(6) 加50-100ju 1 DEPC处理的水，将RNA溶液贮存于-7(TC保存备用。
3. 反转录合成cDNA第一链
(1) 取l-2(jg总RNA,加入ddH20至9. 5pL, 75。C变性5分钟，冰洛5分钟，稍微离心。
(2) 加10X扩增缓冲液2ML。
(3) 加10mmol/L dNTP混合液2juL。
(4) 加25mmol线Cl2 4pL。
(5) 加引物01igo-dT 1 pL。
(6) 加RNA酶抑制剂O. 5pL。
(7) 加反转录酶M-MLV lpL。
(8) 加反应总体系20jiL。
(9) 反应液混合后，室温放置10分钟，42。C温洛60分钟，85t:水洛放置10分钟。
(10) 加入180iaLddH2O混匀，稍微离心，-2(TC下保存，阴性对照3个分别是①加入第一 链d)M反应所需的所有试剂，不加模板RNA;②加除反转录酶外的所有试剂；③加除引物外的
所有试剂。
4. RT-PCR
反应体系(1)加双蒸水32.5 iaL, 10xbuffer5 nL， MgCL2 4 (iL, d證4 nL,引物 1RTFP (其序列如Seq IDNo: 7所示)1 1RTRP (其序列如Seq ID No: 8所示)1 |u L， c腿2 ja L, TaqE 0. 5 ja L。
扩增条件94'C预变性5分钟，4'C变性1分钟，55'C退火1分钟，72'C延伸30秒，30个循 环；72。C延伸10分钟，取IO PCR产物iy。琼脂糖凝胶电泳检测。
p-actin参比体系同上，引物为(3-actinF (其序列如Seq ID No: 9所示)；actinR (其序列如Seq ID No: IO所示)。(3 -actin扩增条件94'C预变性4分钟；94'C变性1分钟，62 。C退火l分钟，72。C延伸30秒，30个循环，72。C延伸10分钟，经1°/。琼脂糖凝胶电泳分析。
5. Northern Blot
5.1辣椒病叶总RNA提取方法同上
135. 2 DIG-DNA探针标记制备
(1) 在一离心管中加入l jug RT-PCR扩增产物于灭菌的蒸水中至终体积16 nL。
(2) 沸水洛10分钟，迅速置于冰洛冷却，变性DNA。
(3) 充分摇匀DIG-High Prime,力口4 m L于变性DNA溶液中，混合并短暂离心.
(4) 37。C温洛l小时或过夜。
(5) 力口2jjL 0.2M edta(pH8. 0)或65'c温洛10分钟以终止反应。 5.3 RNA转移与固定
5. 3. l凝胶制备
(1) 取O. 72g琼脂糖溶于56. 7ml的M0PS中，'加热融解后冷却至60。C左右，加入37%甲醛溶液 3. 3 ml于制胶盒中，冷却。
(2) 取30pL RNA加入等体积的上样缓冲液中混匀。
(3) 65。c温育15分钟后，立即放入冰洛中冷却，离心5秒钟。
(4) 加样前，将凝胶预电泳5分钟，随后将样品加至凝胶加样孔。
(5) 将凝胶浸入1X甲醛凝胶电泳缓冲液中，3-4v/cm电压电泳。
(6) 电泳后取出凝胶，用DEPC处理水淋洗数次，每次3分钟。
(7) 将凝胶在20xSSC中浸泡两次，每次15min,除去凝胶中的曱醛。
(8) 将尼龙膜在20xSSC中浸泡30min。 '
(9) 利用虹吸式转膜法转膜过夜。
(10) 转膜后，用2XSSC于室温下泡膜5-10分钟，夹十两层滤纸间晾干，然后8(TC下烤2小 时或紫外照射5分钟固定RNA。
5. 3.2分子杂交
(1) 预热适当体积的DIG Easy Hyb (10 mL/10 cn^膜)至68'C ，在杂交管中轻轻摇动预杂交 30分钟。
(2) 煮沸地高辛一标记DNA探针5分钟，快速冰/水洛冷却，使之变性(大约25 ng/ mL DIG Easy I-Iyb)。
(3) 加变性地高辛标记DNA探针至预热的DIG Easy Hyb (3. 5 mL/100 cii^膜)中，充分混匀并 避免产生泡沫。
(4) 倒掉预杂交液，把探针/杂交混合液加至膜上，于杂交炉中68'c温育4小时或过夜，并 温和摇动。
5. 3. 3免疫学检测
(1) 分别用2 X SSC和O. 5 X SSC洗膜，每次5分钟后，在清洗缓冲液中冲洗尼龙膜l-5分钟。
(2) 在100 mL封闭溶液中温育30分钟。
(3) 在20 mL抗体溶液中温育30分钟。
(4) 在100 mL漂洗缓冲液中洗lS分钟。(5) 在20 mL检测缓冲液中平衡2-5分钟。
(6) 膜上滴加显影液，15-25。C温育5分钟后，37'C温育湿膜10分钟。
(7) X光片于5-25 。C显影15-25分钟。
实施列5 CPc/;巡el基因在辣椒疫病株内翻译水平Western Blot检测)
1、 辣椒疫病叶总RNA提取方法同上
2、 户c;^e l基因表达蛋白特异抗血清制备
(1) 将制备的戶ciM e l基因表达纯蛋白稀释到lmg/mL,制成抗原液。
(2) 取适量纯蛋白液按1:1比例加入弗氏不完全佐剂进行乳化，乳化45 min左右，制备约 含有5 00jWg/mL表达产物的抗原油乳剂。
(3) 取l只健康家兔用乳化的,c/M/el基因表达蛋白进行免疫，连续免疫3次，每次免疫间隔 时间为l周，l周后进行第4次免疫，两周后取血。
(4) 将血样放置于4'C冰柜，过夜沉淀，然后吸取适量血清。
(5) 利用琼脂扩散方法检测制备的血清效价和专化性。
3、 Western Blot
3.1 SDS-PAGE电泳分析同上； 3.2电转移步骤
(1) 切取与凝胶大小一致的硝酸纤维素膜(NC膜)于甲醇中浸泡30min,至膜半透明。
(2) 滤纸和海绵浸泡于电转缓冲液PBST (100mL的PBS缓冲液中加入Tween-20 50ul混合均 匀)中至使用。
(3) 采用电转液(25mM Tris PH8. 0， 192mM甘氨酸，20%的甲醇)进行转化。
(4) 转化过程，先用100V电压150mA电流转移1-2h,然后用100V电压240mA电流转化30min。
(5) SDS-PAGE电泳后，将凝胶置于双蒸水中清洗2次。
(6) 按照海绵垫，滤纸，凝胶，NC膜，滤纸，海绵垫的顺序，将凝胶固定于电转移仪上， 加入l. 5L电转缓冲液。
(7) 按照凝胶为负极，NC膜为阳极的顺序电泳，电转反应在4'C下进行。 3.2融合蛋白与一抗结合步骤
(1) 取NC膜浸泡在15ml阻断缓冲液(于PBST缓冲液中加入脱脂奶粉，加入比例为w/v =5: 100),然后水平缓慢振荡l-2h。
(2) 用25ml PBST缓冲液洗脱表面封闭液3次，每次洗脱5min。
(3) 将膜转至含一抗的溶液中， 一抗配置参照其效价，按照1:1000比例与阻断缓冲液均匀 混合，然后水平缓慢振荡2-3h。
(4) 用20ral电转缓冲液洗脱NC膜，每次5min。 3. 3二抗结合与显色(1) 含有一抗的NC膜转至二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)溶液中(二抗溶液用阻断缓冲液按 照1:200比例稀释)，室温缓慢摇动2-3h。
(2) 用电转缓冲液20ml洗脱3-4次，每次5rain,并将膜转移至黑暗处。
(3) 按照北京希凯公司提供的DAB显色试剂盒进行显色操作，将膜转至其中，黑暗条件下 显色5-20min。
(4) 待蛋白条带显色清晰时，用20ml (1犯20终止反应，然后用数码相机或凝胶成像系统照相。
实施列6 (户cp巡e l基因表达的致病蛋白对辣椒叶片组织细胞毒害和细胞壁降解)
1、 ,c/7y^l基因表达的致病蛋白接种辣椒叶片操作
(1) 将户c/柳e l基因表达的致病蛋白稀释至浓度为700 ^g/mL。
(2) 利用针刺法，将适宜浓度的致病蛋白接种于4-6叶期的辣椒叶片。
(3) 采用同样接种方法，将辣椒疫霉菌游动孢子悬浮液(浓度为lx105)、 700 ^g/mL的纯 化蛋白、无菌水接种于同时期的健康辣椒叶片。
结果表达纯化蛋白对辣椒叶片具明显的破坏作用，导致接种叶片部位组织坏死皱缩，而 经钝化后的蛋白与无菌水一致，对辣椒叶片几乎无任何破坏作用。
2、 致病蛋白对辣椒叶片毒害症状及降解细胞壁透射电镜观察 2. 1症状观察
(1) 接种致病蛋白辣椒叶片症状观察。
(2) 接种游动孢子辣椒叶片症状观察。
(3) 阳性、阴性对照辣椒叶片症状观察，综合比较户c/旭e l基因表达蛋白对辣椒叶片的破
坏作用。
2.2透射电镜观察
(1) 取样和固定蛋白接种辣椒叶片后1-7天，间隔24h取样一次，所取小块样品放入2. 5%
戊二醛溶液中，抽气，确保细胞迅速固定。
(2) 脱水步骤7(W丙酮15min—8(W丙酮14min—9(W丙酮15min—100%丙酮2 x 10min,确保
包埋介质完全渗入细胞内，将细胞内水分全部驱除；
(3) 浸透和包埋步骤将脱水处理的材料于环氧树脂和十二垸基琥珀酸酐浸透ld后"在多 孔橡胶包埋模板中处理，然后于45'C烤箱内处理12h,再于6(TC烤箱内处理36h使树脂聚合硬 化，形成包埋块。
(4) 切片及染色
① 修块将包埋块夹于夹持器中，解剖镜下将组织置于45度角度，除去包埋剂，并修成 推体形。
② 半薄切片定位利用超薄切片机将处理材料切制成厚度为l-10nm的切片，然后用小毛 刷移置于载玻片上，加温使切片展平，待干燥后，用甲苯胺蓝染色，然后光学显微镜观察定③ 超薄切片用自动切片机将切片切制后，放置于载网膜上。
④ 染色用醋酸铀对超薄切片染色。 (5)电镜观察、照相
① 观察将制作完备的超薄切片于3万倍的透射电镜下观察细胞壁的降解;
② 照相选择细胞壁得到降解明显的进行照相取材，其结果如图6所示。<110>山东农业大学
〈120〉辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶Pcpme l基因、蛋白的制备方法及其应用
<160>10
<210〉1
<211>1038
<212>DNA
<213〉辣椒疫霉 (Phytophthora capsici ) <220>
<221>sig-peptide
<222>(1)..'(60)
<221〉CDS
<222>(1)...(1038)
<400〉1
atg cgc gtc ttc get ctt cct etc gta gtg etc gcc acg ttt ate tea 48 MET Arg Val Phe Ala Leu Pro Leu Val Val Leu Ala Thr Phe lie Ser 15 10 15
age tea gtc gga tac get tgc acc gga ccc aac act cga act cag ccc 96 Ser Ser Val Gly Tyr Ala Cys Thr Gly Pro Asn Thr Arg Thr Gin Pro
20 25 30
cca ccc gga gcc ate gtc gtc gac gcc act gga get tac age gga agt 144 Pro Pro Gly Ala lie Val Val Asp Ala Thr Gly Ala Tyr Ser Gly Ser
35 40 45
tac cgt aat gta teg gaa gca att gcg aat gtg ccc aac acg acg gag 192 Tyr Arg Asn Val Ser Glu Ala lie Ala Asn Val Pro Asn Thr Thr Glu
50 55 60
cag cac act gtc ttc eta ttc cct ggt gtg tac cgt gag cag gtg etc 240 Gin His Thr Val Phe Leu Phe Pro Gly Val Tyr Arg Glu Gin Val Leu 65 70 75 80
att tec aag ttg sac ggt ccg ttg gtg etc cag ggc tac acg tgt aac 288 lie Ser Lys Leu Asn Gly Pro Leu Val Leu Gin Gly Tyr Thr Cys Asn
85 90 95
acg aca teg tac get tec aac gag gtg act ate act cag gcc aag get 336 Thr Thr Ser Tyr Ala Ser Asn Glu Val Thr lie Thr Gin Ala Lys Ala 100 105 110Gin Arg
agt acgSer Thr130ate gcclie Ala145
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ggc gccGly Ala
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528
576
624
672
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768
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864
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tac aag gag ttc aac aac cga ggc 912
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get cccAla Pro
tgg tttTrp Phe
Asn Thr Ala Asn Val Phe Tyr Lys Glu Phe Asn Asn Arg Gly
295 300
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Ala Ala Thr Asp Lys Arg Val Ser Phe Ser
310 315
gtg cct ate acg gaa ate etc ggt ggc aac
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gac 960Asp320
gag 1008Glu
1038
<210>2
<211〉345
<212>PRT
<213>辣椒疫霉 (Phytophthora capsici )<220>
<221> SIGNAL<222>(1)...(20)
<400>2
Met Arg Val Phe Ala Leu Pro Leu Val
1 5Ser Ser Val Gly Tyr Ala Cys Thr
Gly20Ala
Val Leu Ala Thr Phe lie Ser
10 15Pro Asn Thr Arg Thr Glu Pro
lie Val Val
Pro Pro Gly35
Asn Val Ser Glu
Gly25
Ala Thr Gly Ala
Tyr Arg50
Gin His Thr Val Phe
65
lie Ser Lys Leu
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lie Ala Asn Val
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Phe Pro Gly Val
Thr30
Tyr Ser Gly Ser45
Asn Thr Thr Glu
Leu70
Gly Pro Leu Val
Pro60
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Tyr100lie
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Ala Ser Asn Glu
lie Thr Gin Ala110
Gin Arg Asp lie Pro Pro Glu lie Thr Ser Gly Arg Asn Asp Leu Thr
Val105Thr
Leu90Thr
Tyr75
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Cys95Lys
Leu
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Gly
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lie225Phe
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Ser
Ala210Thr
Asn290Gly
115Leu
Tyr195Trp
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Gly275Asn
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Tyr Gin
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Pro260Asp
Pro Val Pro
Trp Phe Val
Asp340
<210>3
<211>27
<212〉DNA
<213>人工序列
<220〉
Gly165Thr
Arg245Trp
lie325Thr
Gly150Asn
Thr135Gin
120Asn
lie
Asn TyrVal Tyr AlaAla Gly Ala
Phe Glu Ser
Ala Asn Gly
Arg230Val
Cys215Val
Phe
Arg Pro
Thr Ala Asn
Ala Ala Thr
Asp310Thr
Val295Lys
Val200Asp
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Gly
Asn185Asp
Gly
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Pro280Phe
Thr Tyr lxu
Lys
Phe170Lys
Asp155Tyr
lie Glu Thr
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Ser265Glu
Ser250Arg
Ser235Gly
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Glu lie Leu
Gly330
Phe315Gly
Trp345
Leu140Gly
125Tyr
Phe Val Phe
Val220Pro
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Gly205Gly
Val Val
Gly Trp GinTyr Lys Glu
Phe300Ser
Gly
Trp
Leu285Asn
Asn Leu Asn
Gin Ala Val
Ala Cys AsnGly Arg Glu
Leu190Thr
Ser Phe
Ser
Gin270Trp
Phe175Phe
Ala160Thr
Ala
Ala
LysGlu Gly AlaTy
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Asn335
Val240Tyr
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Asp320Glu
21<223> n二c或t<222>(5)<220〉
<221>misc_feature<223> n:a或g<222>(9)
<220〉 、
〈221〉misc一feature
<223> n-a或c
<222>(11)
<400>3
tcgantttnt nttcggtacc aaggccg 27
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc—feature<223> n-g或t<222>(4)<220>
<221>misc—feature<223> r^a或c<222>(13,16)<400〉4
ccanggacgg ccnagntagg egg 23
<210>5
<211>64
<212>腿
<213〉人工序列
<400〉5gcctgaattc caccaccacc accaccacga cgacgacgac aagtacgctt gcaccggacc 60ewe 64
<210>6
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列 '<400>6
ctctgcggcc gcctaccaaa ggtaagtggt g' 31
<210〉7
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccctggtgtg Uccgtg 17
<210>8
<211>20
<212>腿
<213>人工序列
<400>8
tgttaccttc aatgatggtg 20
<210〉9
<211>22
<212〉DNA
<213>人工序列
<400>9
ctgggacgac atggagaaga tc 22
<210〉10<211>21<212>廳<213>人工序列 <400>10
cgctccgtca ggatcttcat c 2权利要求
1.一种辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶Pcpme 1，其特征在于该基因所编码的蛋白质具有导致辣椒叶片产生皱缩和坏死，并使叶片受害部位的细胞壁得到明显的降解，其基因序列如SeqID No1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO2所示。
2. —种辣椒疫霉菌果胶甲基酯酶户c/M7e 1基因分离克隆及其蛋白质的制备方法，其步骤如下1) P"/z/el基因分离克隆的具体步骤A:采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA,用QIAEXII GEL Extraction Kit试剂建议构建基因组DNA文库，将大小为1, 5Kb-3. 0Kb的DNA片段连接于载体PUC19，转化大肠杆菌DH5a, PCR鉴定文库质量。B:根据已报道的植物、细菌、真菌的果胶甲基酯酶基因保守序列，设计简并引物Nasp(其序列如Seq ID No: 3所示)和Nsp (其序列如Seq ID No: 4所示)，利用Pooling-PCR技术筛选DNA文库，阳性克隆测序获得基因全长序列。2)制备蛋白质的具体步骤A:尸c/w;e l基因酵母表达载体构建，目的基因克隆至表达载体pPIC9K中。B:将上述重组表达载体线性化后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，酵母转化子甲醇利用表型平板筛选。C:酵母转化子的培养和果胶甲基酯酶的甲醇诱导表达，表达产物生物学活性检测、SDS-PAGE分析，果胶甲基酯酶纯化。
3. —种由户c/Mel基因编码的蛋白质，应用于对接种辣椒叶片破坏和叶片受害部位细胞壁的降解效果检测。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，特别提供了1个克隆自辣椒疫霉的果胶甲基酯酶基因Pcpme l及其蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，并立足于细胞化学技术证明了该基因编码的蛋白质具有破坏叶片组织细胞及其细胞壁结构的性能，使受害部位产生明显的症状。因此，该基因是编码辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制病菌分子检测技术提供充分的技术储备。
文档编号C12R1/645GK101671684SQ20091001799
公开日2010年3月17日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者张修国 申请人:山东农业大学