专利名称：辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶Pcipg5基因、蛋白制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因的分离及其编码的蛋白质制备方法。此外，本发明还涉及该基因编码的多聚半乳糖醛酸酶对辣椒寄主的破坏和细胞壁的降解作用。
背景技术：
植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌多种重要的细胞壁降解酶或致病酶，其中多聚半乳糖醛酸酶(PG: EC 3. 2. 1. 15)是多种植物病原卵菌分泌的一种重要致病酶，该类酶通过降解寄主植物细胞壁的果胶、中胶层而破坏寄主防御体系，近而增强病菌对寄主的亲合力，因此该类酶是一种重要的致病因子。研究表明多聚半乳糖醛酸酶是一种细胞壁结合蛋白酶，可催化果胶分子中oc- (1，4)-聚半乳糖醛酸裂解，降解细胞壁的果胶，导致细胞壁软化，利于病原菌的各种侵染结构、及其分泌的各种致病酶或致病毒素顺利侵染寄主组织细胞而导致寄主的病程发展。PG分为内切型(endo-)和外切型(exo-)两种，均由多基因编码，植物病原卵菌PG基因簇成员间所编码的多聚半乳糖醛酸酶的性能存在差异，该类酶降解寄主细胞壁的性能常由单个或几个关键户g基因协同作用。因此，探索植物病原卵菌与寄主互作过程中分泌的PG对寄主植物的致病作用，立足于致病靶标/^基因及其编码的蛋白质功能特性研究，具重要的理论和实验意义。
在世界范围内，植物病原卵菌易导致多种植物的病害，给农业生产造成了严重的损失。资料表明PG是多种植物病原卵菌的重要致病因子，辣椒疫霉病是一种重要的卵菌病害，能导致多种植物发生严重病害，深入开展辣椒疫霉菌(尸/^o/^^oracfl;^d)多聚半乳糖醛酸酶基因分离及靶标基因编码的蛋白制作和功能分析具重要的实践意义，可以实现对于植物病原卵菌所导致的多种植物病害的防治与研究。在本发明申请之前，从世界范围内除本研究小组已报道了辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶化/j^ 2基因的致病功能机制研究外，还未见辣椒疫霉菌其它关键&基因分离及其编码的蛋白质制作和功能研究资料信息。
发明内容
基于上述的原因，1个克隆自辣椒疫霉菌的多聚半乳糖醛酸酶基因,c//^ 5及其编码的蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染寄主及导致辣椒疫病病程发生的过程，并立足于植物病理学和细胞化学技术证明了该基因编码的蛋白质具有导致辣椒叶片产生皱縮、坏死和破坏细胞壁的性能。因此，该基因是辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制辣椒疫霉病菌分子检测技术提供充分的技术储备。
本发明所提供的多聚半乳糖醛酸酶基因，其基因序列如Seq ID No:l所示；其蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。该基因开放阅读框架有1086个碱基，编码一种含有361个氨基酸的蛋白质，分子量为37kDa,有1个信号肽切割位点氨基酸残基(为SEQ ID NO: 2序列中的1-20的氨基酸)，1个N-糖基化位点(位于SEQ ID NO: 2序列中的252-254号氨 基酸)，无内含子。
该多聚半乳糖醛酸酶基因与JGI中的jgi/phycaf7/20609中的所有Pg基因氨基酸序列 比对，发现l个Pg基因与Pcipg5基因氨基酸同源性最高达82.279/。，没有一个与其完全相
同的基因，因此该基因是一个新的多聚半乳糖醛酸酶基因。 其具体的分离制备方法为
1、 分离克隆基因具体步骤
A:采用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA,用QIAEXII GEL Extraction Kit试剂构建基因组 DNA文库，将大小为1.5Kb-3. OKb的DNA片段连接于载体PUC19，转化大肠杆菌DH5 a ， PCR 鉴定文库质量。
B:根据已报道的植物、细菌、真菌的多聚半乳糖醛酸酶基因保守序列，设计简并引物 P710 (其序列如Seq ID No: 3所示)和P1150R (其序列如Seq ID No: 4所示)，利用 Pooling-PCR技术篩选DNA文库(参见plant journal, 2000， 23: 687-695),阳性克隆测序 获得基因全长。
2、 制备蛋白质的具体步骤
A:A力^ 5基因酵母表达载体构建，目的基因克隆至表达载体pPIC9K中。 B:将上述重组表达载体线性化，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，酵母转化子平醇利 用表型平板筛选。
C:酵母转化子培养和多聚半乳糖醛酸酶甲醇诱导表达，表达产物生物学活性检测、 SDS-PAGE分析，多聚半乳糖醛酸酶纯化。
本发明所用的载体和宿住菌均常见，PUC19为尸c力^ 5基因宿主载体，DH5a为宿主细 胞，pPIC9K为尸c//^ 5基因表达载体，(户/c力/a ^"or") GS115为该基因的表达宿主菌。 通过这种方法克隆所得的基因及按照其编码的蛋白质，可以为研究该类病毒的在辣椒 疫病株内转录表达水平和在辣椒疫病株内翻译表达水平而提供有效的依据，其具体的检测 方式如下
在辣椒疫病株内转录表达水平的检测 A:将用于克隆,c/;^ 5基因的强致病辣椒疫霉菌接种辣椒叶片。 B:发病辣椒叶片总RNA提取及cDNA合成。 C:反转录cDNA第一条链合成。 D: RT-PCR检测。 E:DIG-DNA探针制备。 F:MA转移、固定及分子杂交检测。 本技术操作釆用了常规基因转录表达检测方法，具体操作过程在后续的具体实施方式
中加以详述。
在辣椒疫病株内翻译表达水平检测步骤A:将用于克隆户c//^ 5基因的强致病辣椒疫霉菌接种辣椒叶片； B:提取上述病叶中的粗蛋白；
C:利用获得的,c/;^ 5基因表达纯化的蛋白制备特异抗血清；
D:将B步中制得的粗蛋白转NC膜后，利用上述的特异抗血清进行Western Blot分析 (实验中釆用HRP标记的羊抗兔为二抗)。
本技术操作采用了常规基因翻译表达检测方法，具体过程在后续的具体实施方式
中加 以详述。
同时为了进一步验证本发明所提供的户c//^ 5基因编码的多聚半乳糖醛酸酶具有破坏 辣椒叶片和降解细胞壁的作用，本发明提供了该基因编码的蛋白质接种辣椒叶片的方法和
降解细胞壁的电镜观察制作技术，具体操作步骤 A:,c//^ 5基因表达纯化蛋白接种健康辣椒叶片。
B:取接种表达纯化蛋白并呈现明显症状的辣椒叶片样品固定及脱水处理。 C:然后进行浸透、包埋及切片染色。 D:电镜观察。
致病蛋白接种方法是借鉴同类研究成熟的操作技术，电镜观察制作属常规操作技术， 具体操作在后续的具体实施方式
中加以详述。通过该技术进一步证明了在辣椒疫霉菌与辣 椒寄主互作过程中，该基因编码的蛋白质具明显降的破坏辣椒叶片和降解细胞壁的性能。 本技术为探索其它细胞壁降解酶基因簇成员致病功能特性研究提供有价值的借鉴。
综上所述，本发明提供了 1个克隆自辣椒疫霉菌的多聚半乳糖醛酸酶基因,c々^ 5及 其蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉侵染寄 主及导致辣椒疫病病程发生的过程，并立足于细胞化学技术证明了该基因编码的蛋白质具 有破坏叶片组织细胞及其细胞壁结构的性能，使受害部位产生明显的症状。因此，该基因 是编码辣椒疫霉果胶甲基酯酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制病菌 分子检测技术提供充分的技术储备。
图l.,c/j^ 5基因表达载体示意图
图中A即，Kana分别为氨节抗性和卡那抗性，5'A0X1为启动子，3'A0X1为转录终止子，His6 是组氨酸脱氢酶基因筛选标记，EcoR I和Not I为双酶切位点，户cZ/^5为目的基因，Stul为 线性化位点；
图2.,c/;^ 5基因表达纯化蛋白结果
图中M:标准蛋白；l为空载体pPIC9K表达结果；2为户c/;^5基因在毕赤酵母GS115中的表 达结果；3为A/;^5基因表达蛋白纯化结果，3图示的蛋白带表明获得了该基因表达纯化的蛋 白；
图3.户c/;^ 5基因在辣椒疫病叶内转录表达水平的RT-PCR检测结果
A:l, 3, 5, 7为参试辣椒疫霉菌接种辣椒叶片后的7d内每间隔ld病叶cDNA检测结果；CK+为辣椒疫霉菌的cDNA检测结果；CK-为健康辣椒叶片的cDNA检测结果;B:辣椒寄主PicUn基 因的扩增结果;C:CK-为健康辣椒叶片的RNA扩增结果；1, 3, 5, 7为接种7d后每间隔ld辣椒病 叶的RM扩增结果；CK+为参试辣椒疫霉菌的RNA扩增结果。图A所示的RT-PCR检测图带亮度逐 渐增强，说明接种辣椒疫霉菌的辣椒叶片(ld-7d)随着叶片发病程度的增强，该基因在辣椒 病叶内的转录表达水平逐渐增强；
图4.,c/'/7《5基因在辣椒疫病叶内转录表达水平的Northern Blot检测结果 A:l、 3、 5、 7为辣椒疫霉菌接种辣椒叶片7d内每间隔ld病叶RNA的检测结果；CK+为参试 辣椒疫霉菌的RNA检测结果(阳性对照)；CK-为健康辣椒叶片的RNA检测结果(阴性对照)；B: 病叶和健康叶片的RNA质量检测结果；图A所示由A//《5基因制备的探针与接种辣椒疫霉菌的 病叶(ld-7d) RNA杂交信号强度逐渐增强，说明在接种辣椒疫霉菌的7d内，随着发病程度的
加重，该基因在辣椒病叶内的转录表达水平逐渐增强；
综合RT-PCR和Nor thern B1 ot检测结果表明，辣椒疫霉菌侵染辣椒叶片而引起叶片发病的
过程中，在病菌接种辣椒叶片的7d内，该基因转录表达水平逐渐增强；
图5.,c力^ 5基因在辣椒疫病叶片内翻译表达水平的Western Blot检测结果
ld、 3d、 5d、 7d为辣椒疫霉菌接种辣椒叶片7d，每间隔ld户c/;^5基因在病叶内的翻译表
达水平检测结果；CK-为健康叶片粗蛋白的检测结果；CK+为辣椒疫霉菌粗蛋白的检测结果； 结果显示辣椒疫霉菌侵染辣椒叶片而引起发病的过程中，该基因翻译表达水平逐渐增强； 图6. A/;7《5基因表达纯化蛋白对辣椒叶片细胞壁降解电镜观察结果 A:Pcipg5基因表达纯化蛋白对辣椒叶片细胞壁的降解效果，剑头所示；B:表达纯化蛋白
钝化后对辣椒叶片细胞壁无破坏作用，剑头所示(阳性对照)；C:无菌水对辣椒叶片细胞壁无
任何破坏作用，剑头所示(阴性对照)。结果显示该基因表达获得的蛋白对辣椒叶片细胞壁具
明显的降解效果，由此推断该基因编码的蛋白是一种具降解细胞壁性能的蛋白，或在一定程
度上是一种病程相关蛋白；
具体实施例方式
本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(New York: Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)，或Draper， J等(Blackwell科学 出版社，1988 )所述的操作技术规程，或按制造厂商的建议实验条件。 实施例l (参试辣椒疫霉菌基因组DNA文库构建)
选取强致病且具高PGs活性的辣椒疫霉菌株为参试材料，构建基因组DNA文库，具体步骤 如下
(1) 采用CTAB法提取辣椒疫霉菌基因组高质量DNA。
(2) 基因组DNA超声波打断,电泳检测获得的l. 5Kb-3. OKb的DNA片段，采用Q画II GEL Extraction Kit试剂盒回收纯化。
(3) 基因组文库鉴定，适宜大小的DM片段连接载体后，转化大肠杆菌DH5a,取20yL菌(4)随机挑取了96个克隆进行菌落PCR鉴定和测序分析，确保96个克隆中插入了所需大小 的DM片段成功率达80。/。以上。 实施例2 (基因克隆及测序)
根据已报道的多聚半乳糖醛酸酶基因序列设计简并引物P710 (其序列如Seq ID No: 3所示) 和P1150R (其序列如Seq ID No: 4所示),利用Pooling-PCR方法筛选基因组文库，快速分离获
得目的基因家族的多个基因成员。
1. 96个克隆总质粒DNA提取(碱裂解法)
(1) 将含有质粒的大肠杆菌接种于含有抗生素LB的培养基96深孔板中，37'C, 220rpm
震荡，至对数生长后期。
(2) 将培养的菌液移至80mL离心管中，4"C， 8000rpm离心15min，弃上清。
(3 )将离心获得的菌体于盛有5mL溶液I [50mM Tris-HCl ( pH8. 0 )， 10mM EDTA ( pH8. 0 )] 的离心管中重新悬浮，于摇床缓慢摇动10min，然后加O. 5mL的溶菌酶(浓度为10mg/mL),静 置10min。
(4) 加10mL溶液n
混勻，室温下放置IO min。
(5) 每管中加7. 5mL冷冻溶液I15MKAC60mL,冰醋酸ll. 5mL, H2028. 5mL〗，充分混勻， 于冰块表面放置IO min,并震荡混匀3次。
(6) 4°C, 10000rpm离心10 min,重复离心至大分子DNA沉淀至全部清除为止。
(7) 取上清，加O. 6倍体积的异丙醇，混合后室温下放置10min,然后室温下，10000rpm 离心15 min,取沉淀用7(W的乙醇洗两次，倒置离心管干燥。
(8) DNA溶于3mLTE内，将溶解后的提取物移至50mL的离心管中，加等体积冷冻的5mol/L LiCl，混合后置于冰块2-5min后，4'C, 10000rpm离心10 min (沉淀大分子RNA )。
(9) 将上清移至于30-50mL的干净离心管中，加O. 6倍体积的异丙醇，混合均匀，室温下 沉淀10min, 10000rpm离心10min。
(10) 倒掉上清，倒置离心管，除去残余的上清，用70y。的乙醇洗2次，倒置离心管干燥 几分钟。
(11) 沉淀溶于lmLTE或水中，-20。C下保存待用。
2. 16个克隆总质粒DNA提取
步骤同上，各种溶液用量均为前述的1/6。
3. 单克隆质粒DNA提取
(1) 将含有质粒的大肠杆菌接种于含有适量抗生素的LB培养基中，37°C, 220-250rpm
震荡，培养至对数生长期。
(2) 取lml菌液至l. 5ml的离心管中，8000rpm离心lmin,去上清，收集菌体。
(3) 加入200 pL预冷的溶液I，震荡悬浮菌体。(4) 加入400 niL溶液I1,颠倒离心管数次混匀，12000rpm离心5min。
(5) 加入300juL预冷的溶液in，颠倒混勾液体，置冰块表面5min, 12000rpm离心5min,
上清转入另一只离心管中。
(6) 加入等体积苯酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀，12000rpm离心5min。
(7) 上层水相转入另一只离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后室温放置IO min， 12000rpm离心10min，去上清。
(8) 沉淀用70y。乙醇洗2次，倒置干燥。
(9) 回溶于30uL TE(含20iug的RM酶)中，取5/jL电泳检测后，置于-20'C保存。 4. Pool ing-PCR筛选基因组文库
采用96深孔板(2.2mL)培养单克隆，将每一深孔板所培养的克隆作为一个Super Pool, 再将此Super Pool分为6个Matrix Pool,提取Super Pool质粒，以基因组DNA作为阳性对照， 水作为阴性对照。
PCR反应程序为95°C 4 min; 94°C 1 min, 55°C 30 s, 72°C 1 min,共35个循环；最 后72'C延伸10 min。
反应体系为ddH20 ( 32.5 ju L ), 10 x buf f er ( 5 y L )， MgCL2 ( 4 n L ), dNTP ( 4 ju L ), P710(1mL), P1150R (1 m L) ， DNA(2jjL), TaqE ( 0. 5 ja L )。
取10)JL反应产物电泳，确定含有目基因单克隆，送上海博亚生物有限公司测序。借助NCBI 中的BLAST程序对获得基因全长进行同源序列比较，确定目的基因。根据基因全长序列推测相 应的氨基酸序列，推算目的基因编码的蛋白质分子量，约为37kDa。 实施列3 (基因表达与蛋白纯化)
l.A//^ 5基因成熟肽序列分离
(1 )根据已获得的尸c7/^5基因全长DNA序列，以参试辣椒疫霉菌的RNA为模板进行RT-PCR 扩增，获得其cDNA全长。
(2)根据其cDNA全长，设计表达引物，去除信号肽序列和3'、 5'非编码区序列，并在 上游引物(Pcipg 5F:其序列如Seq ID No:5所示，
EcoRI酶切位点，下游引物(Pcipg 5R:其序列如Seq ID No: 6所示
5， -TATAGCGGCCGCTTAGCACTTGACAGTGCTGG-3')引入Not I酶切位点，扩增产物含,c/;^5
基因编码的成熟蛋白序列。
反应体系为50 jnL:扩增Pcipg 5基因全长获得cDNA模板(2mU, 10xbuffer (5 ju L ), dNTP ( 4 |a L ), Pcipg 5F (1 |a L) , Pcipg 5R ( 1 m L )， TaqE ( 0. 5 ja L ), ddH20 ( 32. 5 n L)
PCR反应程序为94°C 10 min; 94°C 30 min, 67. 3°C 45s, 72°C 1 min,共35个循环； 最后72'C延伸10 min。取10)jL反应产物进行iy。琼脂糖凝胶电泳分析，然后进行测序，获得？c/'/^ 5基因表达序 列，然后目的基因回收连接与pGEM-T Easy Vector,转化大肠杆菌DH5a,蓝白斑筛选、质粒 DNA酶切鉴定，筛选阳性克隆质粒pGEM-T/,c//^5。
2.,c/》g 5基因毕赤酵母表达
2.1酵母表达载体的构建
(1) EcoR I和Not I双酶切pGEM-T/,c/'/^5质粒，回收插入片断。
(2) 与同样双酶切的酵母表达质粒pPIC9K连接，转化大肠杆菌DH5 a 。
(3) 转化后的DH5cc经Amp抗性筛选，获得菌落经37'C摇床过夜后提取质粒。
(4) 重组质粒pPIC9K/A^w 5酶切及测序鉴定。 2.2重组表达载体线性化
用StuI限制性内切酶(位于5' AOX l区域)进行线性化酶切，以获得GS115 His+Mut+表 型转化子，反应体系为
(1) 取质粒pPIC9K/v^//^5 10/iL (10-20 y g)，加入5yL 10X H buffer后，再加入 Stu I 3)uL。
(2) 加ddH力22uL,总体积为40iuL (空载体pPIC9K线性化反应体系相同)。
(3) 37'C反应4 h后，取少量反应液电泳检测酶切效果。
(4) 酶切完成后，将线性化载体DNA电泳，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收并纯化 目的片断，-20'C保存以备转化。
2. 3酵母转化
2.3.1毕赤酵母GS115感受态细胞制备
(1) 接种毕赤酵母GS115于3mL YPD液体培养基，30C振荡培养过夜，然后取lmL于50mL YPD 液体培养基，3(TC,振荡培养16-18h, OD600 = 1. 3 ~ 1. 5, 4'C、 3400rpm离心5min。
(2) 用50mL冰冷无菌水重悬细胞，然后用25mL冰冷无菌水重悬细胞，同上离心。
(3) 用5mL冰冷的lM山梨醇重悬细胞，同上离心。
(4) 同上离心，用O. 5 mL冰冷lM山梨醇重悬细胞，终体积为1.5mL,制备感受态细胞，用 于转化。
2. 3. 2重组表达载体pPIC9K/Pcipg5转化感受态细胞
(1) 取80juL酵母感受态细胞与5-20ug线性化重组表达载体(溶于5-lOyL TE )(空载体 做对照)。
(2) 将样品加入预冷的0. 2cm电转杯，冰洛5 min后电转。
(3) 加入lmL lmol/L冰冷的山梨醇于电转杯，后转至一个新离心管中。
(4) 将转化后的酵母菌于30'C下放置1-2h。
(5) 取200-600iuL菌液涂于MD平板上,30。C倒置培养2-3d,检测转化子后，进行Mur/Muts 表型筛选。2. 3.3酵母转化子筛选与鉴定
2. 3. 3. l酵母转化子甲醇利用表型平板筛选
(1) 酵母转化子对应接种于MD和固平板。
(2) 3(TC培养2-4d，测定菌落大小及数量。
(3) 入选均能在MD和画平板正常生长的酵母转化子，然后用PCR鉴定阳性克隆。 2.3.3.2酵母转化子基因组DNA提取
(1) 取酵母细胞,12000rpm离心lmin,吸除上清。
(2) 加入600 m l山梨醇buffer,加入大约50ja 1 Lyticase,充分混勾，30°C/30min， 4000rpm 离心10min,弃上清，破除酵母细胞壁。
(3) 加入200 yl缓冲液重悬沉淀，充分混勾。
(4) 加入20ju 1蛋白酶K溶液，混句。
(5) 加入220)li 1 GB缓冲液，充分混勾，70。C放置10min,离心除去管盖内壁水珠。
(6) 加入220 pl无水乙醇，充分混匀，离心除去管盖内壁水珠。
(7) 再加入一个吸附柱CB2中，12000rpm离心30 s,倒掉废液，然后将吸附柱放入收集管中。
(8) 向吸附柱中分别加入500 p 1、 700inlGD缓冲液，分别12000rpm离心30s,倒掉废液， 均将吸附柱CB2放入收集管中。
(9) 12000rpm离心2min,倒掉废液，置于室温数分钟晾干。
(10) 将吸附柱转入新离心管中，滴加50-200 u 1洗脱缓冲液TE,室温放置2-5min， 12000rpm离心2min，收集至离心管中。
2. 3.3.3 pPIC9K AOX l通用引物鉴定 反应体系50;/L:
(1) 加入AOXl通用引物5， A0X1: 1^L, 3， A0X1: 1^L。
(2) 加入IO x PCR Buffer (Mg2+free) 5;/L。
(3) 加入MgCl2 (25ramol/L)4 ^L。
(4) dNTP混合(2. 5mmol/Leach)4^L。
(5) 重组酵母基因组DNA 5;iL。
(6) Tap聚合酶(5U"L) 0. 5^L。
(7) ddH20 29. 5:L。
扩增反应条件94°C 4min; 94°C 1 min, 54°C 30 s, 72°C 1 min, 35个循环；72°C 10 min,取IO //L PCR产物检测。
2. 3.3.4 ,c/pg 5基因特异性引物鉴定 反应体系
(1)加戶c/滞5基因特异引物Pcipg 5F (20^mol/L)和Pcipg 5R (20〃mol/L)各l ^L。(2) 加10xPCR Buffer (Mg2+free) 5^L。
(3) 加MgC丄2 (25mmol/L)仏L。
(4) 加dNTP混合(2. 5mmol/Leach) L。
(5) 加重组酵母基因组DNA 5斗。
(6) 加Tap聚合酶(5U/^L) 0. 5〃L。
(7) 加ddH2。 29. 5 〃L。
扩增反应条件94°C 10 min; 94'C 30s, 67. 3°C 45s， 72°C lmin,共35个循环；最后 72。C延伸10 min。
2.3.15外源基因多拷贝转化子筛选
(1) 制备适量YPD培养基，加入适当体积的100mg/mLG418贮备液，混匀铺制平板，制备含 不同浓度的G418 ( 0 mg/mL， 0. 25mg/mL， 0. 5mg/mL， 1. 00 mg/mL, 2. 00 mg/mL, 4. 00 mg/mL ) 的YPD平板。
(2) 吸取2mL无菌水至每个含有His+转化子的MD平板，用无菌涂布器刮取菌落，将菌体重 悬于灭菌水中。
(3) 菌悬液混合后，转至50mL无菌离心管中，涡漩振荡5-10s,分光光度计测定细胞浓度。
(4) 分别取l x 105个菌体细胞涂布于已制备的含不同G418浓度的YPD平板。
(5) 3(TC培养2-5d后，挑取对G418最高浓度具抗性的菌落于YPD平板划线纯化，作为多聚 半乳糖醛酸酶诱导表达待选菌株。
2.4酵母转化子培养和多聚半乳糖醛酸酶诱导表达
(1) 挑取对G418具最高抗性水平的阳性菌落，接种于盛有25mL BMGY培养基的250mL摇瓶 中，28-3(TC振荡培养(250 - 300rpm) 16-18h,至生长对数期，转化pPIC9K空载体GS115菌株
为对照。
(2) 5000 rpm离心5min回收酵母细胞，弃上清，将细胞重悬于适当体积的BMMY培养基中， OD600值达1. 0。
(3) 将培养液置于500ml摇瓶中，28-3(TC摇床震荡培养。
(4) 间隔24h补加100y。甲醇至终浓度0. 5%,持续诱导。
(5) 间隔24h取样一次，至168h，每次取诱导培养液lmL于l. 5mL离心管中，最大转速离心 2-3 min,取上清液和细胞沉淀均冻存于-7(TC冰柜中。
(6) 表达产物SDS-PAGE分析，然后利用DNS法测定诱导表达的多聚半乳糖醛酸酶活性。 2. 5多聚半乳糖醛酸酶融合蛋白纯化
2.5.1蛋白样品的制备
(1) 收集诱导表达的酵母转化子培养物，6000rpm离心30min,弃沉淀，取上清。
(2) 将上清液按照60y。的饱和度加入(NH4)2SO4沉淀多聚半乳糖醛酸酶，8000rpm离心30min,
收集沉淀。(3)沉淀用8ml Native Binding Buffer重新悬浮后，透析过夜弃除盐离子，透析产物即
待纯化的蛋白样品。
2. 5. 2蛋白纯化步骤
2. 5. 2. 1 Ni-NTA凝胶纯化柱准备
(1) 吸取l. 5ml凝胶树脂加入至10ml凝胶纯化Ni-NTA柱中，轻微离心使树脂沉淀至柱子底
部，流尽清液。
(2) 加入6ml双蒸水，重新悬浮树脂。
(3) 轻微离心使树脂沉淀至柱子底部，流尽清液。
(4) 加入6ml Native Binding Buffer,重新悬浮树脂。
(5) 连续重复步骤3三次。
(6) 连续重复步骤4-5三次。 2.5.2.2多聚半乳糖醛酸酶纯化
(1) 取可溶性蛋白8ml注入Ni-NTA柱中。
(2) 轻柔搅拌使树脂在蛋白液中悬浮，吸附30-60min，去掉上清。
(3) 用8ral Native Wash Buffer冲洗，使树脂沉淀至柱子底部，去掉上清。
(4) 重复步骤3三次。
(5) 用8-12 ml Native Elution Buffer洗脱蛋白。
(6) 重复步骤5—次，收集洗脱样品，取l ml洗脱液进行SDS-PAGE分析。
(7) 将洗脱液用双蒸水透析，去盐离子，获得纯的融合蛋白，SDS-PAGE分析后，按照上述 方法测定纯化蛋白的活性。
实施列4 (户c//^ 5基因于辣椒疫病叶内转录表达水平的RT-PCR和Northern Blot检测)
1. 参试辣椒疫霉菌接种辣椒叶片
(1) 参试辣椒疫霉菌于0MA基质上培养7d。
(2) 利用Petri溶液诱导产生孢子囊，4'C处理30min诱导产生游动孢子，配制成浓度为l x 105/ml游动孢子悬浮液。
(3) 悬滴法接种健康辣椒叶片，观察病害症状。
2. 辣椒病叶总RNA提取与cDNA合成
(1) 接种ld、 3d、 5d、 7d的辣椒病叶经DEPC水处理后，分别取O. lg样品进行液氮研磨，移 入lml Trizol溶液室温静置5min。
(2) 加入0. 2mL氯仿，充分混合混勾，4'C下12000rpm离心15min，吸取上清，重复一至多次。
(3) 吸取上清，每lml Trizol加入O. 25倍异丙醇和0. 25倍RNA沉淀剂，充分混匀，室温放 置IO min, 4'C下12000rpm离心10 min。
(4) 收集RNA沉淀，用75%乙醇洗涤2次，重复离心。(5) 吸尽残余乙醇，或使残余乙醇挥发掉。
(6) 加50-100)j 1 DEPC处理水,将RNA溶液于-7(TC下保存备用。
3. 反转录合成cDNA第一链
(1) 取l-2ug总RNA,加入ddH20至9. 5 iuL, 75。C变性5min,冰浴5min,稍微离心。
(2) 加10X扩增缓冲液2)aL。
(3) 加10mmol/L dNTP混合液2 ju L。
(4) 加25mmol/LMgCl2 4iuL。
(5) 加引物01igo—dT 1 nL。
(6) 加RNA酶抑制剂O. 5juL。
(7) 加反转录酶M-MLV IiliL。
(8) 反应总体系20)uL。
(9) 反应液混合后，室温放置10min, 42'C温洛60min, 85'C水洛放置10min。
(10) 加180pL ddH20混匀，稍微离心，-2(TC下保存，设阴性对照3个分别是①加入第 一链cDNA反应所需的所有试剂，不加模板RNA;②加除反转录酶外的所有试剂；③加除引物外
的所有试剂。
4. RT-PCR
反应体系(1)加双蒸水32. 5 jliL; 10 x buf f er 5 |a L; MgCL24nL; dNTP 4 n L;引物 RT-5F:其序列如Seq IDNo: 7所示，1 RT-5R:其序列如Seq ID No: 8所示，1jliL; cDNA
2 |u L， TaqE 0. 5 ju L。
扩增条件94。C预变性5min; 94。C变性lmin, 64。C退火30s， 72。C延伸30s， 30个循环； 72。C延伸10min,取10/iL PCR产物iy。琼脂糖凝胶电泳检测。
p-actin参比体系同上，引物为P -actinF (其序列如Seq ID No: 9所示)；P-actinR (其序列如Seq ID No:10所示)。
P-actin扩增条件94。C预变性4min; 94。C变性lmin, 62。C退火lmin, 72。C延伸30s， 30 个循环，72'C延伸10min，经1%琼脂糖凝胶电泳分析。
5. Northern Blot
5.1辣椒病叶总RNA提取方法同上 5. 2 DIG-DNA探针标记制备
(1) 在一离心管中加入l ug RT-PCR扩增产物于灭菌的双蒸水中至终体积为16nL。
(2) 沸水洛10min,迅速置于冰洛冷却，变性DNA。
(3) 充分摇匀DIG-High Prime,力口4 )a L于变性DNA溶液中，混合并短暂离心。
(4) 37。C温洛lh或过夜。
(5) 加2juL 0. 2M EDTA(pH8. 0)或65。C温洛10min以终止反应。 5. 3 RNA转移与固定5. 3. l凝胶制备
(1) 取O. 72g琼脂糖溶于56. 7ml的M0PS中，加热融解后冷却至60。C左右，加入37%甲醛溶液 3. 3 ml于制胶盒中冷却。
(2) 取30nL RNA加入等体积的上样缓冲液中混匀。
(3) 65。C温育15min后，立即放入冰洛中冷却，离心5s。
(4) 加样前，将凝胶预电泳5min,随后将样品加至凝胶加样孔。
(5) 将凝胶浸入1X甲醛凝胶电泳缓冲液中，3-4V/cm电压电泳。
(6) 电泳后取出凝胶，用DEPC处理水淋洗数次，每次3min。
(7) 将凝胶在20xSSC中浸泡两次，每次15min,除去凝胶中的甲醛。
(8) 将尼龙膜在20xSSC中浸泡30min。
(9) 利用虹吸式转膜法转膜过夜。
(10) 转膜后，用2XSSC于室温下泡膜5-10min,夹于两层滤纸间晾干，然后在8(TC烤2h或 紫外照射5min以固定RNA。
5.3.2分子杂交
(1) 预热适宜体积的DIG Easy Hyb (10 mL/10 cm2膜)至68。C，在杂交管中轻轻摇动膜预 杂交30min。
(2) 煮沸地高辛一标记DNA探针5min，快速冰/水浴冷却，使之变性(大约25ng/ mL DIG Easy I-Iyb)。
(3) 加变性地高辛标记DNA探针至预热的DIG Easy Hyb (3.5 mL/100 cm2)膜中，充分混 匀并避免产生泡沬。
(4) 倒掉预杂交液，把探针/杂交混合液加至膜上，在杂交炉中，68'C温育4h或过夜，并 混合摇动。
5. 3. 3免疫学检测
(1) 分别用2XSSC和0. 5XSSC洗膜，每次5min后，再在清洗缓冲液中冲洗尼龙膜1-5min。
(2) 在10OmL封闭溶液中温育3 Omi n 。
(3) 在20mL抗体溶液中温育30min。
(4) 在100mL漂洗缓冲液中洗15min。
(5) 在20mL检测缓冲液中平衡2-5min。
(6) 膜上滴加显影液，15-25。C温育5min后，37°C温育湿膜10min。
(7) X光片于5-25。C显影15-25min。
实施列5 (/c/z^5基因在辣椒疫病病叶内翻译表达水平的Western Blot检测)
1、 辣椒疫病病叶总RNA提取方法同上
2、 Pci;^ 5基因表达蛋白特异抗血清制备
(1)将制备的/^/;^ 5基因表达纯化蛋白稀释至lmg/mL,制成抗原液。(2) 取适量纯化蛋白液按1:1比例加入弗氏不完全佐剂进行孵化，孵化45min左右，制备约 含有50(^g/mL表达产物的抗原油乳剂。
(3) 取l只健康家兔用乳化的户c/;^ 5基因表达蛋白进行免疫，连续免疫3次，每次免疫间 隔时间为l周，l周后进行第4次免疫，两周后取血。
(4) 将血样放置于4。C冰柜，过夜沉淀，然后吸取适量血清。
(5) 利用琼脂扩散方法检测制备的血清效价和专化性。 3、 Western Blot
3.1 SDS-PAGE电泳分析同上。 3.2电转移步骤■
(1) 切取与凝胶大小一致的硝酸纤维素膜(NC膜)于甲醇中浸泡30min，使膜至半透明。
(2) 滤纸和海绵浸泡于电转缓冲液PBST (lOOmL的PBS缓冲液中加入Tween-20 50ul混合均 匀)中至使用。
(3) 釆用电转液(25mM Tris PH8. 0, 192mM甘氨酸，20。/。甲醇)进行转化。
(4) 转化过程，先用100V电压150mA电流转移l-2h,然后用100V电压240mA电流转化30min。
(5) SDS-PAGE电泳后，将凝胶置于双蒸水中清洗2次。
(6) 按照海绵垫，滤纸，凝胶，NC膜，滤纸，海绵垫的顺序，将凝胶固定于电转移仪上， 加入l. 5L电转缓冲液。
(7) 按照凝胶为负极，NC膜为阳极的顺序电泳，电转反应在4'C下进行。 3.2融合蛋白与一抗结合步骤
(1) 取NC膜浸泡于15ml阻断缓冲液(PBST缓冲液中加入脱脂奶粉，加入比例为w/v-5: 100),然后水平缓慢振荡l-2h。
(2) 用25ml PBST缓冲液洗脱表面封闭液3次，每次洗脱5min。
(3) 将膜转至含一抗的溶液中， 一抗配置参照其效价，按照1:1000比例与阻断缓冲液均匀 混合，然后水平缓慢振荡2-3h。
(4) 用20ml电转缓冲液洗脱NC膜，每次5rain。 3. 3二抗结合与显色
(1) 含有一抗的NC膜转至二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)溶液中(二抗溶液用阻断缓冲液按 照l: 200比例稀释)，室温缓慢摇动2-3h。
(2) 用电转缓冲液20 ml洗脱3-4次，每次5min,并将膜转移至黑暗处。
(3) 按照北京希凯公司提供的DAB显色试剂盒进行显色操作，将膜转至其中，黑暗条件下 显色5-20min。
(4) 待蛋白条带显色清晰时，用20ml (1犯20终止反应，然后用数码相机或凝胶成像系统照相。
实施列6 (户"/w 5基因表达纯化蛋白对辣椒叶片的破坏作用和细胞壁降解)1、 户c々w 5基因表达纯化蛋白接种辣椒叶片操作
(1) 将戶c/;^ 5基因表达纯化蛋白稀释至浓度为700 //g/mL。
(2) 利用针刺法，将适宜浓度的表达纯化蛋白接种于4-6叶期的辣椒叶片。
(3) 采用同样接种方法，将辣椒疫霉游动孢子悬浮液(浓度为lxl05mL)、 700wg/mL的钝 化蛋白、无菌水接种于同时期的健康辣椒叶片。
结果表达纯化蛋白对辣椒叶片具明显的破坏作用，导致接种叶片皱缩，而经钝化后的蛋 白与无菌水一致，对辣椒叶片几乎无任何破坏作用。
2、 A，//^ 5基因表达纯化蛋白对辣椒叶片的破坏症状及降解细胞壁的透射电镜观察 2. 1症状观察
(1) 接种蛋白的辣椒叶片症状观察。
(2) 接种游动孢子的辣椒叶片症状观察。
(3) 阳性、阴性对照辣椒叶片症状观察，综合比较Pcipg 5基因表达纯化蛋白对辣椒叶片 的破坏作用。
2.2透射电镜观察
(1) 取样和固定蛋白接种辣椒叶片l-7d期间，间隔24h取样一次，所取小块样品放入2. 5%
戊二醛溶液中，抽气，确保细胞迅速固定。
(2) 脱水步骤:70y。丙酮15min—8(W丙酮14min—90y。丙酮15min—100y。丙酮2 x 10min,确保
包埋介质完全渗入细胞内，将细胞内水分全部驱除。
(3) 浸透和包埋步骤将脱水处理的材料于环氧树脂和十二烷基琥珀酸酐浸透ld后，在多 孔橡胶包埋模板中处理，然后于45'C烤箱内处理12h,再于60'C烤箱内处理36h使树脂聚合硬 化，形成包埋块。
(4) 切片及染色
① 修块将包埋块至于夹持器中，解剖镜下将组织置于45度角度，除去包埋剂，并修成 推体形。
② 半薄切片定位利用超薄切片机将处理材料切制成厚度为l-10um的切片，然后用小毛 刷移置于载玻片上，加温使切片展平，待干燥后，用甲苯胺蓝染色，然后光学显微镜观察定 位。
③ 超薄切片用自动切片机将切片切制后，放置于载网膜上。
染色用醋酸铀对超薄切片染色。 '
(5) 电镜观察、照相
① 观察将制作完备的超薄切片于3万倍透射电镜下观察细胞壁的降解。
② 照相选择细胞壁得到明显降解的材料进行照相，其结果如图6所示。〈110〉山东农业大学
〈120〉辣椒疫霉果胶甲基酯酶Pcipg 5基因、蛋白的制备方法及其应用
<160>10
<210>1
<211〉1086
<212〉腿
<213>辣椒疫霉(Phytophthora capsici) <220>
<221>sig_peptide
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<221>CDS
<222>(1)".(1086)
<400>1
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145 150 155 160
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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<211〉361
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1
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<210>10
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400〉10
cgctccgtca ggatcttcat c 2权利要求
1.一种辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶Pcipg 5基因，其特征在于该基因所编码的蛋白质具有导致辣椒叶片受害部位产生皱缩和坏死，并使叶片受害部位的细胞壁得到明显的降解，其基因序列如Seq ID No1所示；其蛋白质氨基酸序列为SEQ ID NO2所示。
2. —种辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶^c/;^ 5基因分离克隆及其蛋白质的制备方法， 其步骤如下1) 5基因分离克隆的具体步骤A:釆用CTAB法提取辣椒疫霉菌DNA，用QIAEXII GEL Extraction Kit试剂建议构建基 因组DNA文库，将大小为1. 5Kb-3. 0Kb的DNA片段连接于载体PUC19，转化大肠杆菌DH5 a , PCR鉴定文库质量。B:根据已报道植物、细菌、真菌的多聚半乳糖醛酸酶基因保寺序列，设计简并引物P710 (其序列如Seq ID No: 3所示)和P1150R (其序列如Seq ID No: 4所示)，利用Pooling-PCR 技术筛选DNA文库，阳性克隆测序获得基因全长序列。2) 制备蛋白质的具体步骤A:尸c々w 5基因酵母表达载体的构建，目的基因克隆至表达载体pPIC9K中。 B:将上述重组表达载体线性化后，转化毕赤酵母GS115感受态细胞，酵母转化子甲醇利 用表型的平板筛选。C:酵母转化子的培养和多聚半乳糖醛酸酶的甲醇诱导表达，表达产物生物学活性检测、 SDS-PAGE分析，多聚半乳糖醛酸酶纯化。
3. —种由尸c/p《5基因编码的蛋白质，应用于对接种辣椒叶片破坏和受害部位的细胞 壁降解作用检测。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，特别提供了1个克隆自辣椒疫霉菌的多聚半乳糖醛酸酶基因Pcipg 5及其蛋白质制作技术。立足于基因和蛋白质水平，证明了该基因有效的参与了辣椒疫霉菌侵染辣椒寄主及其导致辣椒叶片疫病病程发生的过程，立足于植物病理学和细胞化学技术进一步证明了该基因编码的蛋白质接种于辣椒叶片后，使叶片接种部位产生了明显的枯萎、皱缩症状，并使受害叶片部位的细胞壁得到明显的降解，即该基因编码一种重要的病程相关蛋白，或者可能是辣椒疫霉菌多聚半乳糖醛酸酶基因簇的一个重要靶标致病基因，本发明为进一步研制辣椒疫霉菌分子检测技术提供了重要的技术储备。
文档编号C12N15/56GK101638662SQ20091001799
公开日2010年2月3日 申请日期2009年9月2日 优先权日2009年9月2日
发明者张修国 申请人:山东农业大学