衍生自人基因的启动子的制作方法

衍生自人基因的启动子的制作方法
【专利摘要】本发明涉及转染的哺乳动物宿主细胞（其分泌外源蛋白的能力已通过使用具有衍生自人基因的启动子的外源基因表达载体得到增强），以及利用所述细胞生产外源蛋白的方法。提供了用于增强充当蛋白药物的外源蛋白在培养的哺乳动物细胞或其它宿主细胞中的生产的方法。提供了衍生自人基因的启动子，所述人基因在培养的哺乳动物细胞或其它宿主中具有比巨细胞病毒（CMV）启动子更强的启动子活性。
【专利说明】衍生自人基因的启动子

【技术领域】
[0001] 本发明涉及转染的哺乳动物宿主细胞(其外源蛋白转录活性已通过使用具有衍生 自人基因的启动子的外源基因表达载体得到增强)，以及利用所述宿主细胞生产外源蛋白 的方法。

【背景技术】
[0002] 由于遗传重组技术的发展，蛋白药物产品，例如治疗性蛋白和抗体药物的市场已 快速扩增。尤其是，抗体药物当施用到人体时可以具有高特异性，而不导致不良免疫反应， 并且因此其开发已被积极推进。
[0003] 作为通过其产生以抗体药物为代表的药物蛋白产品的宿主，可以使用微生物、酵 母、昆虫、动物或植物细胞、转基因动物或植物细胞等。为了使药物蛋白产品具有生物学活 性或免疫原性，翻译后修饰例如折叠或糖基化是必需的。因此，微生物(使用其无法进行复 杂的翻译后修饰)，或植物(具有不同聚糖结构)，不适合作为宿主。考虑到这种细胞具有聚 糖结构类似于人的聚糖结构并且安全，并且使用这种细胞可以进行翻译后修饰，使用培养 的哺乳动物细胞例如CH0 (中国仓鼠卵巢）细胞，其来自于与人密切相关的物种，是目前的 标准。
[0004] 在培养的哺乳动物细胞用作宿主的情况下，问题在于相比使用微生物或类似物生 长速率较低，生产效率低，成本高等（NPL 1)。另外，为了临床使用药物蛋白产品，必须施用 大量的产品。因此，其生产能力的缺乏是另一个世界性的问题。当在培养的哺乳动物细胞表 达系统中生产药物蛋白产品时，相比低分子量合成药物产品生产成本较高。已经进行相应 的尝试以通过改善相应生产步骤来减少生产成本。在培养的哺乳动物细胞表达系统中生产 量的改善是减少生产成本的有效方法（NPL 2和NPL 3)。因此，为了改善外源基因在培养的 哺乳动物细胞中的生产效率，已经研究了基于启动子、增强子、抗生素选择标志物、基因扩 增、培养工程改造技术等的各种方法。当其中CH0细胞用作宿主细胞表达外源基因（S卩，生 产药物蛋白产品）的情况下，通常使用病毒衍生的、人巨细胞病毒主要立即早期启动子(下 文称作"CMV启动子"）（NPL4、NPL 5和NPL 6)。另外，已知可以使用人核糖体蛋白基因例如 RPL32或RPS11的转录起始位点上游多核苷酸作为DNA元件，用于在CH0细胞中的蛋白表 达，组合另一种异源启动子（NPL7和PLT 1)。
[0005] 引用列表 专利文献 PTL ：; MO 2 00 6/12 309.7 非专利文献 NPL 1: Flarian M. Wurm, , ?-lat? Biotechool a 22(11): 1393-1398, 2004 I^IPL 2 : Farid SS.# J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. S4S⑴：8-18r 2007 K?L 3: Werner RG. Economic aspects of coTOercial manufacture of faiopharmaceuticaIs * J Biotechnoi. 113 {1-3): 171-腿# 2004 NPL 4: Durocher Y et al.r Curr Opin Biotechnoi - 20(6): 700-707, 2009 Wh 5: Eoshart M et al e r Cell* 41(2) : 521?530# 1985 NPL 6: Foecking MK et al ·, Gene. 45(1) : 101-105, 1 986 NPL 7: Hoeksema et al, r Biotechnology Research Internationalr Volume 2011# Article ID 4928?5# 11 pages。
[0006] 发明概述 技术问题 本发明的一个目标是提供用于增加要用在药物蛋白产品中的外源蛋白生产的方法，所 述方法使用对增强宿主细胞例如培养的哺乳动物细胞中外源基因的表达具有高活性的启 动子。通过鉴定在CH0细胞等中具有等于或高于CMV启动子的启动子活性的启动子，提供了 在哺乳动物细胞中稳定地实现高的外源基因表达的方法，并且可以提供有利于改善生产水 平(换句话说，减少药物蛋白产品在培养的哺乳动物细胞表达系统中的生产成本）的方法。
[0007] 问题解决方案 本发明人为了解决上述问题进行了深入研究，并发现从位于转录起始位点上游约2kbp 的核苷酸开始，并在紧接对应于人核糖体蛋白基因起始密码子的核苷酸序列上游的核苷酸 终止的多核苷酸具有高的启动子活性。他们发现所述启动子活性可以显著改善在培养的哺 乳动物细胞中表达的外源蛋白的生产，并且从而完成本发明。本发明包括下列方面。
[0008] (1)包含由序列表中SEQ ID NO: 1所不的核苷酸序列的多核苷酸。
[0009] (2)包含由序列表中SEQ ID N0: 2所不的核苷酸序列的多核苷酸。
[0010] (3)包含由序列表中SEQ ID N0: 3所不的核苷酸序列的多核苷酸。
[0011] (4)包含与根据上述（1)至（3)任一项的多核苷酸的核苷酸序列具有95%或更高 同一'I"生的核苷酸序列并具有启动子活性的多核苷酸。
[0012] (5)包含与根据上述（1)至（3)任一项的多核苷酸的核苷酸序列具有99%或更高 同一'I"生的核苷酸序列并具有启动子活性的多核苷酸。
[0013] (6)在严格条件下与包含与根据上述（1)至（3)任一项的多核苷酸的核苷酸序列 互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交并具有启动子活性的多核苷酸。
[0014] (7)包含根据上述（1)至（6)任一项的多核苷酸的外源基因表达单元。
[0015] (8)根据上述（7)的外源基因表达单元，其中所述外源基因是编码多聚体蛋白的基 因。
[0016] (9)根据上述（7)的外源基因表达单元，其中所述外源基因是编码异源多聚体蛋白 的基因。
[0017] (10)根据上述（7)的外源基因表达单元，其中所述外源基因是编码抗体或其功能 片段的基因。
[0018] (11)包含根据上述（7 )至（10 )任一项的外源基因表达单元的外源基因表达载体。
[0019] (12)包含根据上述（7)至（10)任一项的外源基因表达单元和一种或多种选自下 列组A中（a)至（i)所述的多核苷酸的外源基因表达载体： 组A (a) 包含由序列表中SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列的多核苷酸； (b) 包含由序列表中SEQ ID N0: 11所示的核苷酸序列的多核苷酸； (c) 包含由序列表中SEQ ID N0: 12所示的核苷酸序列的多核苷酸； (d) 包含由序列表中SEQ ID N0: 13所示的核苷酸序列的多核苷酸； (e) 包含由序列表中SEQ ID N0: 14所示的核苷酸序列的多核苷酸； (f) 包含由序列表中SEQ ID N0: 10至14任一所表示的核苷酸序列的至少3000个连续 核苷酸的多核苷酸； (g) 包含由序列表中SEQ ID N0: 10至14任一所表示的核苷酸序列的至少2000个连续 核苷酸的多核苷酸； (h) 包含与根据上述（a)至（g)任一项的多核苷酸的核苷酸序列具有95%或更高同一 性的多核苷酸序列并具有增强外源基因表达的活性的多核苷酸；和 (i) 包含与根据上述（a)至（g)任一项的多核苷酸的核苷酸序列具有99%或更高同一 性的核苷酸序列并具有增强外源基因表达的活性的多核苷酸。
[0020] (13)已经导入根据上述（11)或（12)的外源基因表达载体的转化的细胞。
[0021] (14)已经导入根据上述（11)或（12)的外源基因表达载体和元件载体（element vector)的转化的细胞。
[0022] (15)根据上述（13)或（14)的转化细胞，其中所述细胞是衍生自哺乳动物的培养 的细胞。
[0023] (16)根据所述（15)的转化细胞，其中所述衍生自哺乳动物的培养的细胞是C0S-1 细胞、293细胞或CH0细胞。
[0024] (17)生产蛋白的方法，其特征在于包括培养根据上述（13)至（16)任一项的转化 细胞并从所得的培养产物中获得衍生自外源基因的蛋白。
[0025] (18)根据上述（1)至（6)任一项的多核苷酸用于在转化细胞中表达外源基因的用 途。
[0026] (19)根据上述（11)至（12)的外源基因表达载体用于在转化细胞中表达外源基因 的用途。
[0027] 本发明的有益效果 通过将使用本发明的衍生自人基因的启动子的外源基因表达载体导入哺乳动物宿主 细胞，可以显著增强治疗性蛋白、抗体等的外源基因的表达。并且，通过组合DNA元件使用 本发明的启动子，可以进一步增强治疗性蛋白、抗体等的外源基因的表达。
[0028] 附图简述
[图1]图1显示通过使用SEAP活性作为指标在转染的CH0-K1多克隆细胞中评价启动 子活性的图。该图显示每个启动子的SEAP活性，并且CMV启动子的值归一化为1。显示了 两个独立实验的结果（η = 3,平均值土 SD)。
[0029] [图2]图2显示通过使用SEAP活性作为指标在转染的CH0-K1多克隆细胞中评 价截短启动子活性的图。该图显示每个启动子的活性，并且CMV启动子的值归一化为1 (η = 3,平均值土 SD)。
[0030] [图3]图3显示其中通过扩增GAPDH区域证实进行芯片上ChIP (ChIP-on-chip) 的样品特异性地与抗乙酰化组蛋白H3抗体染色质免疫沉淀的图。
[0031] [图4]图4显示其中插入DNA元件的SEAP表达载体的示意图。
[0032] [图5]图5显示其中通过使用在转染的CH0细胞系中CMV启动子表达的SEAP的 活性作为指标证实的DNA元件A2、A7、A18、B5和C14的增强表达效果的图。
[0033] [图6]图6显示其中通过使用在转染的CH0细胞系中EF-1 α或SV40启动子表达 的SEAP的活性作为指标证实的DNA元件Α2和Α7的增强表达效果的图。
[0034] [图7]图7显示其中插入DNA元件的抗体表达(抗体基因 X重链和轻链共表达） 载体的示意图。
[0035] [图8]图8显示其中通过在转染的CH0细胞系中使用CMV或EF-1 α启动子表达 的抗体的生产水平(通过ELISA法测量)作为指标证实的DNA元件Α7的增强表达效果的图。
[0036] [图9]图9是显不DNA兀件A2和相关序列的序列长度的表。
[0037] [图10]图10显示其中通过在转染的CH0细胞系中使用SEAP的活性作为指标证 实的DNA元件A2和相关序列的增强表达效果的图。
[0038] [图11]图11是显示DNA元件A7和相关序列的序列长度的表。
[0039] [图12]图12显示其中通过在转染的CH0细胞系中使用SEAP的活性作为指标证 实的DNA元件A7和相关序列的增强表达效果的图。
[0040] [图13]图13是显示DNA元件A18和相关序列的序列长度的表。
[0041] [图14]图14显示其中通过在转染的CH0细胞系中使用SEAP的活性作为指标证 实的DNA元件A18和相关序列的增强表达效果的图。
[0042] [图15]图15是显不DNA兀件B5和相关序列的序列长度的表。
[0043] [图16]图16显示其中通过在转染的CH0细胞系中使用SEAP的活性作为指标证 实的DNA元件B5和相关序列的表达增强效果的图。
[0044] [图17]图17是显不DNA兀件C14和相关序列的序列长度的表。
[0045] [图18]图18显示其中通过在转染的CH0细胞系中使用SEAP的活性作为指标证 实的DNA元件C14和相关序列的表达增强效果的图。
[0046] [图19]图19显示其中通过在转染的HEK293细胞系中使用SEAP的活性作为指标 证实的DNA元件A2、A7、A18、B5和C14的表达增强效果的图。
[0047] [图20]图20是显示在DNA元件A2、A7或A18的全长序列的基础上在起始和终 止点的核苷酸的表。
[0048][图21]图21是显示在DNA元件B5或C14的全长序列的基础上在起始和终止点 的核苷酸的表。
[0049] 实施方案说明 在下文中，将对本发明进行具体的说明。
[0050] 如本文所用，术语"基因"是指被转录成mRNA和随后翻译成蛋白质的区段，并且不 仅包括DNA，还包括其mRNA、其cDNA和其RNA。
[0051 ] 如本文所用，术语"多核苷酸"以与核酸相同的意义使用，并且还包括DNA、RNA、探 针、寡核苷酸和引物。
[0052] 如本文所用，术语"多肽"和"蛋白"的使用没有区别。
[0053] 如本文所用术语"基因表达"指其中mRNA从基因转录的现象和/或其中蛋白从 mRNA翻译的现象。
[0054] 如本文所用术语"外源基因"指人工导入宿主细胞的基因。
[0055] 如本文所用术语"外源蛋白"指由外源基因编码的蛋白。
[0056] 如本文所用术语"基因表达单元"指在转录阅读框的方向上具有至少启动子区域、 外源基因和转录终止区域(多聚（A)附加信号）的多核苷酸。
[0057] 如本文所用术语"增强外源基因表达的活性"指通过产生有利于在包含外源基因 的基因表达单元周围的任何DNA中转录的环境和显著改善转录效率，增强外源蛋白在宿主 细胞中的产生的活性。
[0058] 如本文所用术语"启动子"指在从DNA到RNA的转录起始中涉及的转录因子可以 结合的区域，并且在本说明书中有时称作"启动子区域"。启动子的实例包括从位于转录起 始位点上游约2kbp的核苷酸开始并在紧接对应起始密码子的核苷酸序列的上游核苷酸结 束的多核苷酸，并且启动子可以包含5' -UTR和内含子。
[0059] 如本文所用术语"启动子活性"指其中转录因子结合启动子并起始转录以产生基 因编码的蛋白的活性。其可以通过使用由报告基因编码的蛋白（例如分泌型碱性磷酸酶 (SEAP))的活性作为指标进行测定。
[0060] 如本文所用短语"具有启动子活性"指如下文所述(实施例3)在相同条件下具有 等于或高于CMV启动子的活性的表达SEAP的活性，以通过使用SEAP的表达水平作为指标 评价启动子活性。
[0061] 如本文所用术语"DNA元件"指在多聚核苷酸位于基因表达单元的附近或在含有基 因表达单元的外源基因表达载体中的情况下，具有增强外源基因表达的活性的多核苷酸。 [0062] 如本文所用术语"抗体的功能片段"，指具有抗原结合活性的抗体的部分片段，并 且包括Fab、F (ab'）2等。但是，该术语不限于这些分子，只要片段对抗原具有结合亲和性。 [0063] 如本文所用术语"同一性"指两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的序列之间 的关系，通过比较这些序列确定，如本领域已知。在本领域中，术语"同一性"还可以指核酸 分子间或多肽之间序列相关性的程度，如通过两个或更多个核苷酸序列或两个或更多个氨 基酸序列的串之间的匹配所确定。可以通过计算在具有缺口比对(如果有的话)的两个或更 多个序列的最小者之间相同匹配的百分比评价"同一性"，所述比对通过特定数学模型或计 算机程序(即"算法"）进行。具体而言，可以通过使用软件例如欧洲分子生物学实验室-欧 洲生物信息研究所（EMBL-EBI)提供的ClustalW2评价同一性，但是软件不限于其，并且可 以使用任何软件，只要其是本领域技术人员所使用的。
[0064] 如本文所用短语"在严格条件下杂交"指在形成所谓的特异性杂交但是不形成非 特异性杂交的条件下的杂交。条件的实例包括这样的条件，其中包含与另一个核酸具有80% 或更多，优选90%或更多，更优选95%或更多，最优选99%或更多的同一性的核苷酸序列的 核酸的互补链杂交，但是包含具有更低同一性的核苷酸序列的核酸的互补链不杂交。更具 体地，其意味着在68°C，在可商购获得的杂交液ExpressHyb杂交溶液（由Clontech, Inc. 制造）中实现杂交或在如下的条件下实现杂交：所述条件使得杂交在68°C，在0. 7至1. 0M NaCl的存在下进行，使用具有DNA固定于其上的滤器，然后在68°C使用0. 1至2 X SSC溶液 (lxSSC溶液由150mM NaCl和15mM柠檬酸钠组成）洗涤，或在其等效条件下实现杂交。 [0065] 1.用于增强外源基因表达的启动子 作为本发明的衍生自人基因的启动子(下文有时也称作"本发明的启动子")，优选从位 于转录起始位点上游约2kbp的核苷酸开始并在紧接对应人核糖体蛋白基因的起始密码子 的核苷酸序列的上游核苷酸结束的多核苷酸。衍生自人基因的启动子可以是从位于转录起 始位点上游约lkbp或约0. 5kbp的核苷酸开始并在紧接对应人核糖体蛋白基因的起始密码 子序列的核苷酸序列的上游核苷酸结束的多核苷酸。
[0066] 人核糖体蛋白基因优选为人核糖体蛋白S7基因（下文称为"RPS7")、人核糖体蛋 白L32基因（下文称为"RPL32"）或人核糖体蛋白L34基因（下文称为"RPL34")。
[0067] 本发明的启动子优选是RPS7、RPL32或RPL34的启动子，更优选是由序列表中任 意SEQ ID N0: 1-9所表示的多核苷酸，并且特别优选由任意SEQ ID N0: 1-3所表示的多核苷 酸。
[0068] SEQ ID N0: 1、2和3的核苷酸序列是分别从位于转录起始位点上游约2kbp的核苷 酸开始并在紧接RPS7、RPL32和RPL34对应起始密码子的核苷酸序列的上游核苷酸结束的 多核苷酸。SEQ ID N0: 4、6和8的核苷酸序列是分别从位于转录起始位点上游约lkbp的核 苷酸开始并在紧接RPS7、RPL32和RPL34对应起始密码子的核苷酸序列的上游核苷酸结束 的多核苷酸。SEQ ID N0: 5、7和9的核苷酸序列是分别从位于转录起始位点上游约0. 5kbp 的核苷酸开始并在紧接RPS7、RPL32和RPL34对应起始密码子的核苷酸序列的上游核苷酸 结束的多核苷酸。
[0069] 此外，本发明的启动子可以是包含与SEQ ID N0: 1-9表示的任一核苷酸序列具有 80%或更多，优选90%或更多，更优选95%或更多，最优选99%或更多同一性的核苷酸序列的 多核苷酸，并且具有启动子活性。
[0070] 本发明的启动子可以是这样的多核苷酸，其在严格条件下杂交到包括与包含选自 由SEQ ID N0: 1-9表示的核苷酸序列的任一核苷酸序列的多核苷酸互补的核苷酸序列的多 核苷酸，并具有启动子活性。
[0071] 本发明的启动子可以是这样的多核苷酸，其是包含其中一个或多个，优选1至 300,更优选1至30个核苷酸已被缺失、取代和/或添加的核苷酸的突变的多核苷酸，并具 有启动子活性，所述突变在选自由SEQ ID N0: 1-9表示的核苷酸序列的任一核苷酸序列中。
[0072] 将突变(缺失、取代和/或添加)导入上述核苷酸序列可以通过本领域已知的方法， 例如Kunkel法或缺口双链体法或等效的方法进行。例如，可以使用利用定点诱变法的突变 导入试剂盒，例如突变-K(TaKaRaBio, Inc.制造)或突变-G(TaKaRaBio, Inc.制造 )，LA PCR体外诱变系列试剂盒（TaKaRaBio, Inc.制造)。这样的突变的多核苷酸也可以用作本 发明的启动子。
[0073] 增强外源基因表达的本发明的启动子的活性可以通过使用由报告基因所编码的 蛋白如SEAP的活性作为指标来测定。在下列情况下，其中当使用本发明的启动子时报告 蛋白的活性等于或高于使用CMV启动子时，优选地，活性增加1. 2倍或更高，更优选1. 5倍 或更高，所述启动子可以判断为具有增强外源基因表达的活性。即使在其中活性增加约1. 2 倍或更高的情况下，预期这将减少细胞培养规模、细胞培养时间和纯化步骤，使其可能增加 产量并减少细胞培养成本。如果产量增加，则可能稳定地提供用作药物产品的外源蛋白。另 夕卜，如果细胞培养成本减少，用作药物产品的外源蛋白的成本也减少。
[0074] 并且，本发明的启动子还可以通过使用本领域技术人员熟知的方法将启动子导入 宿主细胞，用于增强宿主细胞的内源基因的表达。
[0075] 2.外源基因表达单元 本发明的外源基因表达单元（以下有时也称为"本发明的基因表达单元"）在转录阅读 框的方向上，至少具有在上述项目"1"中所述的本发明的启动子、外源基因和转录终止区 (多聚（A)附加信号)。
[0076] 另外，多聚（A)附加信号可以是对从启动子的转录具有导致转录终止活性的序列， 并且可以是来自与所述启动子的基因相同或不同的基因的序列。
[0077] 3.用于增强外源基因表达的DNA元件 通过使用在上面的项目"2"中所述本发明的基因表达单元并组合DNA元件，可以进一 步增强外源基因的表达。如实施例6所述，可以通过使用乙酰化组蛋白H3和元件之间的相 互作用作为指标获得组合使用的DNA元件。通常，据说组蛋白（H3和H4)的乙酰化与转录 激活相关，并且有两大理论已被提倡。一个理论是，组蛋白的乙酰化与核小体构象的变化 相关，所述变化方式使得组蛋白尾部被乙酰化以便被电中和，减弱DNA-组蛋白的相互作用 (Mellor J. (2006) Dynamic nucleosomes and gene transcription. Trends Genet. 22(6): 320-329)。另一个理论是组蛋白的乙酰化与多种转录因子的募集有关（Nakatani Y. (2001) Histone acetylases-versatile players. Genes Cells. 6 (2) : 79-86)。根据任一理论，非 常可能的是组蛋白的乙酰化与转录激活有关，并且通过使用抗乙酰化组蛋白H3抗体进行 染色质免疫沉淀（ChIP)，可以浓缩与乙酰化的组蛋白H3相互作用的DNA元件。
[0078] A2是与本发明的启动子组合使用以增强外源基因表达的DNA元件的实例。A2位 于人染色体15的80966429至80974878的区域，并且是具有62. 2%的AT含量的8450bp多 核苷酸。A2的核苷酸序列由序列表中SEQ ID N0: 10表示。
[0079] A7、A18、B5和C14是类似DNA元件的实例。A7位于人染色体11的88992123至 89000542的区域，并且是具有64. 52%的AT含量的8420bp多核苷酸。A7的核苷酸序列由 序列表中SEQ ID N0: 11表不。
[0080] A18位于人染色体4的111275976至111284450的区域，并且是具有62. 54%的AT 含量的8475bp多核苷酸。A18的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 12表示。
[0081] B5位于人染色体1的143034684至143043084的区域，并且是具有66. 37%的AT 含量的8401bp多核苷酸。B5的核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO: 13表示。
[0082] 最后，C14位于人染色体11的46089056至46097482的区域，并且是具有63. 81% 的AT含量的8427bp多核苷酸。C14的核苷酸序列由序列表中SEQ ID N0: 14表示。
[0083] 与本发明启动子组合使用的DNA元件的增强外源基因表达的活性可以通过使用 由报告基因所编码的蛋白如SEAP的活性作为指标来测定。
[0084] 在其中DNA元件与本发明的启动子组合使用的情况下，可以单独使用任一上述 DNA元件，或者可以使用DNA元件的一种类型的两个或更多个拷贝。或者，可以组合使用两 种或更多种不同类型的上述DNA元件。
[0085] A2、A7、A18、B5和C14是与本发明的启动子组合使用的DNA元件的优选的实例。
[0086] 本发明中使用的DNA元件可以是包含与SEQ ID N0: 10-14表示的任意核苷酸序列 具有80%或更多，优选90%或更多，更优选95%或更多，最优选99%或更多同一性的核苷酸 序列的核苷酸序列，并且具有增强外源基因表达的活性。可以相对例如日本的DNA数据库 等，使用程序例如FASTA或BLAST进行核苷酸序列同源性检索。
[0087] 与本发明的启动子组合使用的DNA元件可以是这样的DNA元件，其在严格条件下 杂交到包括与包含选自由SEQ ID N0: 10-14表示的核苷酸序列的核苷酸序列的多核苷酸互 补的核苷酸序列的多核苷酸，并具有增强外源基因表达的活性。
[0088] 参考 Molecular Cloning (Sambrook, J.等，Molecular Cloning: a Laboratory Manual 2nd ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 10 Skyline Drive Plainview, N.Y. (1989))等，本领域技术人员可以容易地获得这样的同源基因。并且，可以通过以相同 的方式进行FASTA检索或BLAST检索确定上述核苷酸序列的同一性。
[0089] 将突变(缺失、取代和/或添加)导入上述多核苷酸可以通过本领域已知的方法，例 如Kunkel法或缺口双链体法或等效的方法进行。例如，可以使用利用定点诱变法的突变导 入试剂盒，例如突变-K (TaKaRaBio，Inc.制造)、突变-G (TaKaRaBio，Inc.制造）或LA PCR体外诱变系列试剂盒（TaKaRaBio, Inc.制造）等。这样的突变的多核苷酸也可以用作 本发明的DNA元件。
[0090] 作为与本发明的启动子组合使用的DNA元件，可以使用包含序列表中SEQ ID N0: 10-14任一表示的核苷酸序列的至少3000或至少2000个连续核苷酸的部分片段。这样的 部分片段的实例包括:A2-1至A2-17,其是A2的部分片段;A7-1至A7-18,其是A7的部分 片段；A18-1至A18-4,其是A18的部分片段；B5-1至B5-6,其是B5的部分片段；以及C14-1 至C14-14,其是C14的部分片段。但是，所述DNA元件不限于这些部分片段，只要其具有增 强外源基因表达的活性。
[0091] 在本发明中，可以单独使用任一上述部分片段，并且也可以使用所述部分片段的 一种类型的两个或更多个拷贝。或者，可以组合使用两种或更多种不同类型的部分片段。此 夕卜，可以组合使用全长序列和任意上述DNA元件的部分片段。在上述组合中，所述全长序列 和部分片段可以衍生自相同的DNA元件或衍生自不同的DNA元件。
[0092] 对于A2的相应片段的多核苷酸序列，A2-1对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸1 至3000的多核苷酸序列；A2-2对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸2801至5800的多核 苷酸序列；A2-3对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸5401至8450的多核苷酸序列；A2-4 对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸701至2700的多核苷酸序列；A2-5对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸701至2200的多核苷酸序列；A2-6对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷 酸701至3700的多核苷酸序列；A2-7对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2001至5000 的多核苷酸序列；A2-8对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸4001至7000的多核苷酸序 列；A2-9对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸1至3700的多核苷酸序列；A2-10对应序 列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2001至5800的多核苷酸序列；A2-11对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2801至7000的多核苷酸序列；A2-12对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷 酸701至5800的多核苷酸序列；A2-13对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2001至7000 的多核苷酸序列；A2-14对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2801至8450的多核苷酸序 列；A2-15对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸1至5800的多核苷酸序列；A2-16对应序 列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸701至7000的多核苷酸序列；A2-17对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2001至8450的多核苷酸序列。
[0093] 对于A7的相应片段的多核苷酸序列，A7-1对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸 601至3600的多核苷酸序列；A7-2对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸3601至8420的 多核苷酸序列；A7-3对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸5401至8420的多核苷酸序列； A7-4对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸3401至6400的多核苷酸序列；A7-5对应序列表 中SEQ ID N0: 11的核苷酸1501至4500的多核苷酸序列；A7-6对应序列表中SEQ ID N0: 11 的核苷酸4401至7400的多核苷酸序列；A7-7对应序列表中SEQ ID NO: 11的核苷酸2401 至5400的多核苷酸序列；A7-8对应序列表中SEQ ID NO: 11的核苷酸1至3600的多核苷 酸序列；A7-9对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸1501至5400的多核苷酸序列；A7-10 对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸2401至6400的多核苷酸序列；A7-11对应序列表中 SEQ ID N0: 11的核苷酸3401至7400的多核苷酸序列；A7-12对应序列表中SEQ ID N0: 11 的核苷酸4401至8420的多核苷酸序列；A7-13对应序列表中SEQ ID NO: 11的核苷酸1至 5400的多核苷酸序列；A7-14对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸1501至6400的多核苷 酸序列；A7-15对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸2401至7400的多核苷酸序列；A7-16 对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸3401至8420的多核苷酸序列；A7-17对应序列表中 SEQ ID N0: 11的核苷酸1至6400的多核苷酸序列；A7-18对应序列表中SEQ ID N0: 11的 核苷酸1501至7400的多核苷酸序列。
[0094] 对于A18的相应片段的多核苷酸序列，A18-1对应序列表中SEQ ID N0: 12的核苷 酸1至5040的多核苷酸序列；A18-2对应序列表中SEQ ID NO: 12的核苷酸1001至6002的 多核苷酸序列；A18-3对应序列表中SEQ ID N0: 12的核苷酸2001至7000的多核苷酸序列； A18-4对应序列表中SEQ ID N0: 12的核苷酸3000至7000的多核苷酸序列。
[0095] 对于B5的相应片段的多核苷酸序列，B5-1对应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷酸 1至4001的多核苷酸序列；B5-2对应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷酸1至3200的多核苷 酸序列；B5-3对应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷酸2491至5601的多核苷酸序列；B5-4对 应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷酸5373至8401的多核苷酸序列；B5-5对应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷酸901至4001的多核苷酸序列；B5-6对应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷 酸4001至7000的多核苷酸序列。
[0096] 对于C14的相应片段的多核苷酸序列，C14-1对应序列表中SEQ ID N0: 14的核苷 酸960至4015的多核苷酸序列；C14-2对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸1987至5014 的多核苷酸序列；C14-3对应序列表中SEQ ID N0: 14的核苷酸4020至7119的多核苷酸序 列；C14-4对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸960至8141的多核苷酸序列；C14-5对应 序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸960至6011的多核苷酸序列；C14-6对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸4939至8141的多核苷酸序列；C14-7对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷 酸960至5014的多核苷酸序列；C14-8对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸2994至7119 的多核苷酸序列；C14-9对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸4020至8141的多核苷酸序 列；C14-10对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸1至5014的多核苷酸序列；C14-11对应 序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸1987至7119的多核苷酸序列；C14-12对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸2994至8141的多核苷酸序列；C14-13对应序列表中SEQ ID NO: 14的 核苷酸960至7119的多核苷酸序列；C14-14对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸1987至 8141的多核苷酸序列。
[0097] 4.多核苷酸的获得 在本发明中，可通过下述普通方法获得包含编码外源蛋白（其产量待增加，这将在稍后 描述)的外源基因的多核苷酸。例如，可以通过使用从外源基因片段合成的DNA探针筛选衍 生自表达外源蛋白的细胞或组织的cDNA文库分离这样的多核苷酸。因此可以通过本领域 常规使用的方法制备mRNA。例如，用胍试剂、酚试剂等处理细胞或组织，由此获得总RNA，并 且从而通过亲和柱法使用寡（dT)纤维素柱或包含琼脂糖2B等的聚U-琼脂糖柱作为载体， 或通过分批法获得聚（A) + RNA (mRNA)。并且，多聚（A)+RNA可以通过蔗糖密度梯度离心等 进一步分级。然后，使用这样获得的mRNA作为模板、寡dT引物和反转录酶合成单链cDNA。 从这样获得的单链cDNA，使用DNA聚合酶I、DNA连接酶、RNA酶Η等合成双链cDNA。使用 T4 DNA聚合酶钝化这样合成的双链cDNA，随后连接到适体(例如EcoRI适体)，磷酸化等，并 且所得的DNA掺入λ噬菌体例如Agtll以实现体内包装，由此制备cDNA文库。还可以使 用质粒载体代替λ噬菌体制备cDNA文库。此后，可以从cDNA文库选择包含目标DNA的克 隆（阳性克隆)。
[0098] 在其中上述的启动子，含有终止子区域的多核苷酸，上述的DNA元件，或包含用于 生产蛋白的外源基因的多核苷酸从基因组DNA中分离的情况下，根据常规方法（Molecular Cloning (1989)，Methods in Enzymology 194 (1991))，基因组 DNA 从要用作收集来源 的生物体的细胞系中提取，并且选择和分离所述多核苷酸。可以根据例如Cryer等的方 法（Methods in Cell Biology, 12，39-44 (1975))或 P. Philippsen 等的方法（Methods Enzymol·，194，169-182 (1991))进行基因组 DNA 的提取。
[0099] 也可以通过例如 PCR 法（PCR Technology. Henry A. Erlich, Atockton press (1989))获得目标启动子、DNA元件或包含外源基因的多核苷酸。在使用PCR法的多核苷酸 的扩增中，使用20至30聚体的合成单链DNA作为引物并使用基因组DNA作为模板。在证 实基因的多核苷酸序列后，使用扩增的基因。作为PCR的模板，可以使用基因组DNA文库， 例如细菌人工染色体（BAC)-文库。
[0100] 另一方面，可以通过（a)根据常规方法制备基因文库，和（b)从制备的基因文库选 择所希望的多核苷酸并扩增所述多核苷酸来获得包含未知序列的多核苷酸。可以通过如 下获得基因文库：部分消化通过常规方法从用作收集来源的生物体的细胞系获得的染色体 DNA，使用适当的限制性酶来使染色体DNA片段化，将所获得的片段连接到适当的载体上， 并将载体导入适当的宿主。还可以通过从细胞提取mRNA，从mRNA合成cDNA，将cDNA连接 到适当的载体并将载体导入适当的宿主来制备基因文库。作为用于该制备的载体，可以使 用通常已知作为用于基因文库制备的载体的质粒，并且也可以使用噬菌体载体、粘粒等。作 为要转化或转染的宿主，可以使用适合用于上述载体类型的宿主。通过菌落杂交法、噬菌斑 杂交法等使用包含对外源基因特异性的序列的标记探针从上述基因文库选择包含外源基 因的多核苷酸。
[0101] 此外，还可以通过总化学合成生产包含外源基因的多核苷酸。例如，可以通过下列 方法合成基因：其中制备并退火两对互补寡核苷酸的方法，其中通过DNA连接酶连接几个 退火的DNA链的方法，其中制备几个部分互补的寡核苷酸并通过PCR填平缺口的方法，等 等。
[0102] 可以通过常规技术，例如双脱氧法（Sanger等，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA, 74, 5463-5467 (1977))等进行多核苷酸序列的确定。还可以使用可商购获得的测序试剂 盒等容易地进行多核苷酸序列的上述确定。
[0103] 5.外源基因表达载体、元件载体 作为本发明的外源基因表达载体，提供了包含在上述项目"2"中所述的外源基因表达 单元的载体，所述外源基因表达单元包含上述项目"1"中所述本发明的启动子。本发明的 外源基因表达载体可以包含一种类型的上述项目"3"中所述的DNA元件，上述DNA元件的 一种类型的两个或更多个拷贝，或组合的上述DNA元件的两种或更多种不同类型。当使用 上述外源基因表达载体在宿主细胞中表达外源基因时，DNA元件可以位于所述基因表达单 元的紧接的上游或下游，或可以位于远离所述基因表达单元的位置。此外，可以使用包含多 个这样的DNA元件的一个外源基因表达载体。顺便提及，所述DNA元件可以关于所述基因 表达单元的正向或反向插入。
[0104] 此外，作为本发明中使用的载体，还包括这样的载体，其包含一种类型的上述DNA 元件、上述DNA元件的一种类型的两个或更多个拷贝或组合的两种或更多种类型的上述 DNA元件，且不包含基因表达单元(下文也称为"元件载体")。这样的元件载体可以组合包 含所述DNA元件的上述外源基因表达载体，或不包含DNA元件并仅包含外源基因表达单元 的外源基因表达载体使用。通过允许所述元件载体与所述外源基因表达载体共存，相比其 中单独使用外源基因表达载体的情况，外源基因的表达得到增强，并且因此，上述载体的组 合也包括在本发明的外源基因表达载体内。
[0105] 外源基因没有特别限制，但其实例包括报告基因，如分泌型碱性磷酸酶（SEAP)、绿 色荧光蛋白（GFP)和荧光素酶的基因；各种酶的基因，如α-淀粉酶基因和α-半乳糖苷酶 基因；各种干扰素的基因，其是药学上有用的和生理活性的蛋白，如干扰素 α和干扰素 Υ ; 各种白细胞介素的基因，如IL-1和IL-2 ;各种细胞因子基因，如促红细胞生成素（ΕΡ0)基因 和粒细胞集落刺激因子（G-CSF)基因；生长因子基因；和编码多聚体蛋白的基因如编码抗 体或其功能片段异源多聚体的基因。这些基因可以通过任何方法获得。
[0106] "抗体的功能片段"指具有抗原结合活性的抗体的部分片段，并包括Fab、F(ab'）2、 Fv、scFv、双抗体、线性抗体、抗体片段形成的多特异性抗体等等。抗体的功能片段还包括 Fab'，其是通过在还原条件下处理F(ab'）2获得的抗体的可变区的单价片段。但是，所述功 能片段不限于这些分子，只要所述片段对抗原具有结合亲和性。此外，这些功能片段不仅包 括通过用适当的酶处理抗体蛋白的全长分子获得的片段，还包括使用遗传修饰的抗体基因 在适当的宿主细胞中产生的蛋白。
[0107] 此外，本发明的外源基因表达载体和元件载体可以各自包含选择标志物用于选择 转化子。例如，通过使用抗生素抗性标志物(其赋予对抗生素如浅蓝菌素、短梗霉素、博来霉 素、刀豆氨酸、环己酰亚胺、潮霉素、嘌呤霉素、杀稻瘟菌素、四环素、卡那霉素、氨苄青霉素 或新霉素的抗性)，可以选择转化体。此外，当使用赋予对溶剂如乙醇的抗性，对甘油、盐等 的渗透压的抗性，对金属离子如铜离子等的抗性的基因作为标志物时，也可以选择转化子。
[0108] 本发明的外源基因表达载体和元件载体可以各自是不掺入染色体DNA的载体。通 常，外源基因表达载体转染进入宿主细胞，并此后随机掺入染色体。但是，通过使用衍生自 哺乳动物病毒例如猿猴病毒40 (SV40)、乳头瘤病毒（BPV，HPV)或EBV的组成型组分，载体 可以用作附加体载体，其在转染的宿主细胞中自我复制。例如，广泛使用含有SV40衍生的 复制原点和编码SV40大T抗原的序列（其是反式作用因子）的载体，含有EBV衍生的oriP 的载体和编码EBNA-1的序列的载体等。DNA元件可以有效地展示增强外源基因表达的活 性，无论载体的类型如何或其是否整合入染色体。
[0109] 6.转化的细胞 本发明的转化的细胞是上述项目"5"中所述外源基因表达载体已导入其中的转化细 胞。作为外源基因表达载体，（A)可以仅导入不包含DNA元件的外源基因表达载体，或（B) 可以组合导入不包含DNA元件的外源基因表达载体和元件载体。可选地，（C)可以导入包 含DNA元件的外源基因表达载体，或（D)可以组合导入包含DNA元件的外源基因表达载体 和元件载体。
[0110] 在宿主细胞中可以通过上述（B)或（D)中所述的组合进行外源基因的表达，根据 例如 Girod 等的方法（Biotechnology and Bioengineering, 91，2-11 (2005))和 Otte 等的 方法（Biotechnol. Prog·, 2007, 23, 801-807 (2007))。
[0111] 转化的宿主细胞的实例可以包括真核细胞，其优选的实例包括哺乳动物细胞，并 且更优选的实例包括衍生自人、小鼠、大鼠、仓鼠、猴或牛的细胞。这样的哺乳动物细胞的实 例包括C0S-1细胞、293细胞和CH0细胞（CH0-K1、DG44、CH0 dhfr-、CH0-S)，但是宿主细胞 不限于其。
[0112] 在本发明中，可以使用任何方法将表达载体导入宿主细胞，只要该方法允许导入 的基因稳定地存在于所述宿主细胞中，并在其中充分表达。通常使用的方法的实例包括 憐酸?丐法（Ito 等，（1984) Agric. Biol. Chem·，48，341)、电穿孔法（Becker, D. M.等， 1990; Methods. Enzymol·，194，182-187)、原生质体法（Creggh 等，Mol. Cell. Biol·, 5， 3376 (1985))、醋酸锂法（Ito, Η· (1983) J. Bacteriol. 153，163-168)和脂质体转染法。
[0113] 7.产生外源蛋白的方法 在本发明中，可以通过下列产生外源蛋白：通过已知方法培养上述项目"6"中所述转 化的细胞(其中已导入编码外源蛋白的基因)，从所得培养产物中收集蛋白，随后纯化蛋白。 如本文所用术语"培养产物"除了培养上清液之外还指培养的细胞或细胞匀浆。顺便提及， 作为可使用上述项目"6"中所述转化细胞产生的外源蛋白，不仅可以选择单体蛋白，还可以 选择多聚体蛋白。在其中产生多个不同的亚基形成的异源多聚体蛋白的情况下，有必要分 别向上述项目"6"所述宿主细胞中导入多个编码这些亚基的基因。
[0114] 培养转化细胞的方法可以根据用于培养宿主细胞的常规方法进行。
[0115] 在其中转化细胞是哺乳动物细胞的情况下，所述细胞在下列条件下培养，例如 37°C和5%或8% C02，进行约24至1000小时的培养时间。可以通过分批培养、补料分批培 养、连续培养等在静置、摇动、搅拌或通气条件下进行培养。
[0116] 编码来自上述培养产物(培养溶液）的外源蛋白的基因的表达产物的确认可以通 过SDS-PAGE、West ern分析、ELISA等进行。为了分离并纯化所产生的蛋白，可以使用常规蛋 白分离和纯化方法。完成培养后，在其中目标蛋白在细胞内产生的情况下，使用超声波匀浆 器、弗氏细胞压碎器、Manton-Gaulin匀浆器、DYN0-MILL等使细胞匀浆，从而获得靶蛋白。 另外，在其中目标蛋白在细胞外产生的情况下，同样地使用培养溶液，或者通过离心等去除 细胞。此后，通过提取等，使用有机溶剂收集目标蛋白，并且然后可以通过使用下列技术分 离并纯化收集的目标蛋白，例如各种层析技术(疏水层析、反相层析、亲和层析、离子交换层 析等)，使用分子筛的凝胶过滤，或使用聚丙烯酰胺凝胶的电泳等，根据需要单独或者组合。
[0117] 上述培养方法和纯化方法仅为实例，并且所述方法不限于其。可以通过已知的氨 基酸分析技术例如使用Edman降解方法的自动氨基酸测序确认纯化的基因产物的氨基酸 序列。
[0118] 8.产生抗体蛋白的方法 作为使用上述项目"7"中所述的生产方法产生的异源多聚体蛋白，抗体蛋白可以作为 示例。抗体蛋白是四聚体蛋白，其包含两个重链多肽分子和两个轻链多肽分子。因此，为了 获得以维持抗原结合亲和性状态的这样的抗体蛋白，有必要将重链和轻链基因导入上述项 目"6"中所述的转化细胞。在这种情况下，所述重链和轻链基因表达单元可以存在于相同 的表达载体或不同的表达载体上。
[0119] 作为在本发明中产生的抗体，通过用所希望的抗原免疫实验动物例如兔子、小鼠 或大鼠制备的抗体可以作为示例。并且，通过使用上述抗体作为起始材料获得的嵌合抗体 和人源化抗体也可以作为本发明产生的抗体的示例。并且，使用遗传修饰的动物或噬菌体 展示方法获得的人抗体也包括在本发明产生的抗体中。
[0120] 产生抗体所使用的抗体基因不限于具有特定多核苷酸序列的抗体基因，只要从所 述抗体基因转录和翻译的重链多肽和轻链多肽的组合具有结合给定抗原蛋白的活性。
[0121] 并且，不一定所述抗体基因编码所述抗体的全长分子，并且可以使用编码所述抗 体的功能片段的基因。这样的编码其功能片段的基因可以通过遗传修饰编码所述抗体蛋白 的全长分子的基因来获得。
[0122] 9.用于其它外源蛋白的生产方法 除了上述抗体之外，使用本发明的生产方法产生的外源蛋白的实例还包括，各种衍生 自人或非人的蛋白、其功能片段和其修饰的产物。这样的蛋白等的实例包括肽类激素，如 心房利钠肽（ANP)、脑钠肽（BNP)、C-型钠尿肽（CNP)、加压素、促生长素抑制素、生长激素 (GH)、胰岛素、催产素、生长素释放肽、瘦素、脂联素、肾素、降血钙素、骨保护素和胰岛素样 生长因子（IGF);细胞因子，如白细胞介素、趋化因子、干扰素、肿瘤坏死因子（如TNF-α、 TNF-β和TNF超家族)、神经生长因子(例如NGF)、细胞生长因子(如EGF、FGF、H)GF、HGF和 TGF)、造血生长因子(如CSF、G-CSF和促红细胞生成素）和脂肪细胞因子；受体如TNF受体； 酶，如溶菌酶、蛋白酶、蛋白水解酶和肽酶；其功能片段(具有部分或全部的原始蛋白的生物 活性的片段）和包括任何这些蛋白的融合蛋白。但是，所述蛋白不限于其。 实施例
[0123] 10.实施例 在下文中，本发明将具体参照实施例进行描述。但是，这些实施例不限制本发明的技术 范围。用于本发明的实施例的质粒、限制性酶、DNA修饰酶等是可商购获得的产品并且可以 根据常规方法使用。此外，用于DNA克隆、多核苷酸测序、宿主细胞转化、转化的宿主细胞的 培养、从所得培养产物的蛋白收集、蛋白纯化等的方法也可以是本领域技术人员熟知的并 可以见于文献。
[0124] (实施例1)用于评价启动子活性的载体CMV/pSeapIRESpuro的构建 通过使用SEAP的表达作为指标进行启动子活性的评价，并且构建用于评价的载体。
[0125] 1-1)通过PCR的SEAP的cDNA的扩增和限制性酶位点的添加 通过PCR扩增SEAP的cDNA，使用其中在紧接起始密码子上游添加 Nhel位点并在紧接 终止密码子下游添加 Bglll位点的引物和KOD-Plus-(TOYOBO)。作为模板，使用pSEAP2-对 照（Clontech)。所获得的片段用Nhel和Bglll消化并然后使用MinElute反应试剂盒 (Qiagen)纯化。
[0126] 所使用的引物： SEAPF： AAAGCTAGCA7GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC SEAPR: AAAAGATCTTCATGTCTGCTCGAAGCGGCCG6CCGC
[0127] 1-2) CMV/pSeapIRESpuro 的构建 pIRESpuro3 (Clontech)载体用Nhel和BamHI消化后，通过连接反应将1-1)中制备的 SEAP片段整合在其中。所获得的质粒命名为"CMV/pSeapIRESpuro"。
[0128] (实施例2) RPS7、RPL32和RPL34的启动子区域的克隆 作为认为包含具有高转录活性的启动子的人基因，通过使用mRNA水平作为指标选择 EEF2、YBX1、PPIA、PSAP、RAN、PRL32、PRL34、RPLP1、RPS7、RPS24、TMSB4X、UBC、YWHAE、ARPC2 和SERBP1，并且进行每个基因的启动子区域的克隆。所获得的质粒用于实施例3中启动子 活性的评价。
[0129] 2-1) RPS7的启动子区域的克隆 作为RPS7的启动子区域，关于GenBank中登录号NM_001011. 3下登记的mRNA序列，使 用从位于RPS7的转录起始位点的上游约2kbp的核苷酸起始，并在紧接对应RPS7的起始密 码子序列的核苷酸序列的上游的核苷酸结束的序列。
[0130] 通过PCR使用大肠杆菌人工染色体克隆RP11-644P19 (GenoTechs)作为模板扩增 RPS7的启动子区域，并且还使用下列引物组和K0D -Plus- (Τ0Υ0Β0)，并然后使用MinElute 反应试剂盒（Qiagen)纯化。在CMV/pSeapIRESpuro用Spel和Nhel消化并去除CMV启动 子后，使用 In-Fusion Advantage PCR 克隆试剂盒（Clontech)在 Spel-Nhel 位点整合 RPS7 的启动子区域，由此构建RPS7/pSeapIRESpur〇。所克隆的RPS7的启动子区域的核苷酸序列 由序列表中SEQ ID NO: 1表不。
[0131] RPS7的引物组： RPS7-F: TTGATTATTGACTA￡3TATTTATGTATATTAi.CAGCACATT.AACAGC RPS7-R; GCAGCAGCATGCTAGCGGCTTTCTCCTGC-GAGASCTGMGGCB.CAGCGG
[0132] 2_2)RPL32的启动子区域的克隆 作为RPL32的启动子区域，关于GenBank中登录号NM_000994. 3下登记的mRNA序列， 使用从位于RPL32的转录起始位点的上游约2kbp的核苷酸起始，并在紧接对应RPL32的起 始密码子序列的核苷酸序列的上游的核苷酸结束的序列。
[0133] 使用大肠杆菌人工染色体克隆RP11-767C1 (GenoTechs)作为模板扩增RPL32的启 动子区域，并且还使用下列引物组和KOD-Plus- (Τ0Υ0Β0)，并然后使用MinElute反应试剂 盒（Qiagen)纯化。在CMV/pSeapIRESpuro用Spel和Nhel消化并去除CMV启动子后，使用 In-Fusion Advantage PCR 克隆试剂盒（Clontech)在 Spel-Nhel 位点整合 RPL32 的启动子 区域，由此构建RPL32/pSeapIRESpur〇。所克隆的RPL32的启动子区域的核苷酸序列由序列 表中SEQ ID N0: 2表示。
[0134] RPL32的引物组： RPL32-F: TTGATTATTGACTAGTCTAAAGTGATTCCTAAAGAATTCTTCCC P.PL32-H: GCAGCAGCATGCTAGCGATGCCTTTTGGGGAAGAAGCGGCCCC
[0135] 2-3) RPL34的启动子区域的克隆 作为RPL34的启动子区域，关于GenBank中登录号NM_033625. 2下登记的mRNA序列， 使用从位于RPL34的转录起始位点的上游约2kbp的核苷酸起始，并在紧接对应RPL34的起 始密码子序列的核苷酸序列的上游的核苷酸结束的序列。
[0136] 通过PCR使用大肠杆菌人工染色体克隆RP11-462C24 (GenoTechs)作为模板扩增 RPL34的启动子区域，并且还使用下列引物组和KOD-Plus- (Τ0Υ0Β0)，并然后使用MinElute 反应试剂盒（Qiagen)纯化。在CMV/pSeapIRESpuro用Spel和Nhel消化并去除CMV启动 子后，使用 In-Fusion Advantage PCR 克隆试剂盒（Clontech)在 Spel-Nhel 位点整合 RPL34 的启动子区域，由此构建RPL34/pSeapIRESpur〇。所克隆的RPL34的启动子区域的核苷酸序 列由序列表中SEQ ID N0: 3表不。
[0137] RPL34的引物组： R PL3 4 -F: TTGATTATTGACTAGTATGGTGGCACAATCATGGTTCACTGCAGGC RPL34-R: GCAGCAGCATGCTAGCTCTGAGTGCCTAAATT?AGAATAGAGTAACATC
[0138] 2-4)其它人基因的启动子区域的克隆 根据上述 2-1)中所述方法进行 EEF2、YBX1、PPIA、PSAP、RAN、PRL32、PRL34、RPLP1、 RPS7、RPS24、TMSB4X、UBC、YWHA、ARPC2和SERBP1的各自启动子区域的克隆，由此构建包含 克隆的多核苷酸的pSeapIRESpuro。
[0139] (实施例3)使用转染的CH0-K1多克隆细胞中SEAP的表达水平作为指标评价启动 子活性 3-1)转染 CH0-K1细胞（ATCC)在5%C02中在37°C下亚培养，使用包含10%超低IgGFBS (GIBC0) 的F-12营养混合物培养基（GIBC0)。
[0140] 以5 x 105细胞/孔将CH0-K1细胞接种到6孔培养板（IWAKI)上。在后一天，使 用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen)转染实施例 1)和 2)中构建的 CMV/pSeapIRESpuro、 RPSVpSeapIRESpuro、RPL32/pSeapIRESpuro、RPLiM/pSeapIRESpuro 等各 2 μ g。
[0141] 3-2)使用嘌呤霉素的抗生素选择 转染2天后，通过胰蛋白酶处理从6孔板收集细胞，所收集的细胞的总量接种到6cm皿 (Nunc),并且以8 μ g/ml的最终浓度向培养基中添加噪呤霉素（Clontech)。
[0142] 3-3)使用转染的多克隆细胞系的评价 从开始抗生素选择开始，经过11天，用胰蛋白酶收集转染的多克隆细胞系，并且进行 细胞计数。然后，以1 X 1〇5细胞/孔将细胞接种到24孔培养板（IWAKI)上。经过24小时，收 集培养物上清液，并且使用SensoLyte? pNPP分泌型碱性磷酸酶报告基因测定法（ANASPEC) 测量培养物上清液中SEAP的活性。在RPS7、RPL32和RPL34的各个启动子区域的控制下 SEAP的活性高于充当对照的CMV启动子（CMV/pSeapIRESpuro)的控制下，并且SEAP的活性 分别比对照的活性高1. 7倍或更多，2. 0倍或更多，和2. 5倍或更多（图1)。同时，在EEF2、 YBX1、PPIA、PSAP、RAN、PRL32、PRL34、RPLP1、RPS7、RPS24、TMSB4X、UBC、YWHA、ARPC2 和 SERBP1的各个启动子区域控制下的SEAP的活性低于CMV启动子控制下的活性。
[0143] (实施例4)截短的启动子的克隆 通过用作RPS7、RPL32、RPL34的截短的启动子，从位于转录起始位点上游约lkb的核 苷酸开始并在紧接对应于各个基因的起始密码子的核苷酸序列的上游结束的核苷酸序列 (T1)，和从位于转录起始位点上游约0. 5kb的核苷酸开始并在紧接对应于各个基因的起始 密码子的核苷酸序列的上游结束的核苷酸序列（T2)，进行截短的启动子的克隆。
[0144] 4-1) RPS7T1 和 RPS7T2 的克隆 使用在2-1)中构建的RPS7/pSeapIRESpuro作为模板通过PCR扩增RPS7T1和RPS7T2， 并且还使用下列引物组和KOD-Plus- (Τ0Υ0Β0)，并然后使用MinElute反应试剂盒（Qiagen) 纯化。在CMV/pSeapIRESpuro用Spel和Nhel消化并去除CMV启动子后，使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒（Clontech)在Spel-Nhel位点整合RPS7T1和RPS7T2各自的启 动子区域，由此构建 RPS7Tl/pSeapIRESpuro 和 RPS7T2/pSeapIRESpuro。所克隆的 RPS7T1 和RPS7T2的启动子区域的核苷酸序列分别由序列表中SEQ ID N0: 4和5表示。
[0145] RPS7T1 的引物组： RPS7-T1: TTGATTATTGACTAGTCCTAGTGTGGCTTCTGCATTTTTCACAGTGC RPS7 -R; GCAGCAGCATGCTAGCGGCTTTCTCCTGtjGAGAACTGAAGGCACAGCGG RPS7T2的引物组： SPS7-T2; TTGATTATTGACTftGTCCTCGGCTCHCGGCAGCCTCGACCTTTCGGC RPS7-R; GCAGCAGCATGCTAGCGG€TTTCTCCTGGGAGA.3.CTGftAGGCACAGCGG
[0146] 4-2) RPL32T1 和 RPL32T2 的克隆 使用在2-2)中构建的RPL32/pSeapIRESpuro作为模板通过PCR扩增RPL32T1和 RPL32T2,并且还使用下列引物组和KOD-Plus- (Τ0Υ0Β0)，并然后使用MinElute反应 试剂盒（Qiagen)纯化。在CMV/pSeapIRESpuro用Spel和Nhel消化并去除CMV启动 子后，使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒（Clontech)在Spel-Nhel位点整合 RPL32T1 和 RPL32T2 各自的启动子区域，由此构建 RPL32Tl/pSeapIRESpuro 和 RPL32T2/ pSeapIRESpuro。所克隆的RPL32T1和RPL32T2的启动子区域的核苷酸序列分别由序列表 中SEQ ID NO: 6和7表示。
[0147] RPL32T1 的引物组： RPL32T1: TTGATTATTGACTAGTCCTCTCGftGTAACTGGGACTACAGGCATGC RPL32-R: GCAGCAGCATGCTftGCGATGCCTTTTCGGQAAGAAGCGGCCCC RPL32T2的引物组： RPL32T2: TTGATTATTGACTAGTGCAGTTTCGCCCAGTGGTTAGAAGCGTGG RPL32-R: GCAGCftGCftTGCTAGCGATGCCTTTTGGGGAAGAAGCGGCCCG
[0148] 4-3 ) RPL34T1 和 RPL34T2 的克隆 使用在2-3)中构建的RPL34/pSeapIRESpuro作为模板通过PCR扩增RPL34T1和 RPL34T2,并且还使用下列引物组和KOD-Plus- (Τ0Υ0Β0)，并然后使用MinElute反应 试剂盒（Qiagen)纯化。在CMV/pSeapIRESpuro用Spel和Nhel消化并去除CMV启动 子后，使用In-Fusion Advantage PCR克隆试剂盒（Clontech)在Spel-Nhel位点整合 RPL34T1 和 RPL34T2 各自的启动子区域，由此构建 RPL34Tl/pSeapIRESpuro 和 RPL34T2/ pSeapIRESpuro。所克隆的RPL34T1和RPL34T2的启动子区域的核苷酸序列分别由序列表 中SEQ ID N0: 8和9表示。
[0149] RPL34T1 的引物组： RPL34T1: TTGATTATTGACTAGTGCTTCCTGGAGGTGCM'TCTSAGAGCGCTCCCC RFL34-R: GChGCmCKTQCmCCrCTGAGTGCCTP^hTTMiGARThGhGThAChTC RPL34T2的引物组： RPL34T2: TTGATTATTGACTAGTGTAAAGCrTGTGCTCTGAATAAATGACAAGG RPL34-S; GCAGCAGCATGCTAGCTCTGAGTGCCTiyyiTTAAGAAmGAGTAACATC
[0150] (实施例5)使用转染的CH0-K1多克隆细胞中SEAP的表达水平作为指标评价截短 的启动子活性 5-1)转染 CH0-K1细胞（ATCC)在5%C02中在37°C下亚培养，使用包含10%超低IgGFBS (GIBC0) 的F-12营养混合物培养基（GIBC0)。
[0151] 以2x 105细胞/孔将CH0-K1细胞接种到6孔培养板（IWAKI)上。在后一 天，使用 Fugene 6 (Roche Applied Science)转染实施例 1)、2)和 4)中构建的 CMV/ pSeapIRESpuro> RPS7/pSeapIRESpuro> RPS7Tl/pSeapIRESpuro> RPS7T2/pSeapIRESpuro> RPL32/pSeapIRESpuro、RPL32Tl/pSeapIRESpuro、RPL32T2/pSeapIRESpuro、RPL34/ pSeapIRESpuro、RPL34Tl/pSeapIRESpuro 和 RPL34T2/pSeapIRESpuro 各 2 μ g。
[0152] 5-2)使用嘌呤霉素的抗生素选择 转染2天后，通过胰蛋白酶处理从6孔板收集细胞，并且所收集的细胞的总量接种到 6cm皿（Nunc),并且以8 μ g/ml的最终浓度向培养基中添加噪呤霉素（Clontech)以开始抗 生素选择。
[0153] 5-3)使用转染的多克隆细胞系的评价 从开始抗生素选择开始，经过11天，用胰蛋白酶收集每个转染的多克隆细胞系，并且 进行细胞计数。然后，以1 X 1〇5细胞/孔将细胞接种到24孔培养板（IWAKI)上。经过24 小时，收集培养物上清液，并且使用SensoLyte (注册商标）pNPP分泌型碱性磷酸酶报告基 因测定法（ANASPEC)测量培养物上清液中SEAP的活性。测量结果显示在图2中。在每种 截短的启动子的控制下SEAP的活性高于在充当对照的CMV启动子（CMV/pSeapIRESpuro)的 控制下，并且从而，其显示这些启动子具有高于CMV启动子的启动子活性。
[0154] (实施例6) DNA元件的提取 (6-1)使用抗乙酰化的组蛋白H3抗体的染色质免疫沉淀 根据下列方法使用EZ ChIP (Upstate)进行使用抗乙酰化组蛋白抗体的ChIP。顺便提 及，除非另有说明，Upstate的产品在下列方法中用作抗体、缓冲液等。
[0155] 首先，使用 GIBC0 (注册商标）Freestyle? 293 培养基（Invitrogen)在 37°C和 8%C02的条件下培养293F细胞（Invitrogen)，随后离心（1000rpm，5分钟，室温)，由此收集 生长阶段的细胞。在2 X 107个细胞在包含1%甲醛的培养基中搅拌10分钟后，向其中添加 l〇x甘氨酸，随后在室温搅拌5分钟。离心（3000rpm，5分钟，4°C )后，去除上清，并且向细胞 沉淀中添加 PBS以悬浮细胞。然后，再次离心细胞悬浮液以去除PBS，并且此后向细胞沉淀 添加 SDS裂解缓冲液以悬浮和裂解细胞。通过细胞裂解获得的每种样品使用超声波匀浆器 (BRANSON)进行DNA片段化，同时用冰水冷却样品，并向其中添加包含蛋白酶抑制剂混合物 的稀释缓冲液和固定有蛋白G的琼脂糖。所得混合物在4°C搅拌1小时，随后离心，并然后 收集上清液。随后，向其中添加10 μ g正常兔IgG或α -乙酰组蛋白H3抗体，随后在4°C 搅拌过夜。向所得溶液中添加固定有蛋白G的琼脂糖，并且所得混合物在4°C搅拌1小时， 随后离心，并然后收集沉淀。这样获得的沉淀用低盐免疫复合物清洗缓冲液清洗两次，用高 盐免疫复合物清洗缓冲液清洗两次，用LiCl免疫复合物清洗缓冲液清洗两次，并最后用TE 缓冲液清洗4次。然后向其中添加洗脱缓冲液(包含20 μ 1 1 Μ碳酸氢钠、10 μ 1 SDS和170 μ 1无菌水)。经过30分钟后，离心混合物，并且收集上清液。
[0156] 随后，向上清液中添加5Μ氯化钠，并且所得混合物在65°C加热过夜。然后向其中 添加 RNA酶，并且所得混合物在37°C孵育30分钟。然后向其中添加0. 5M EDTA、1M Tris-HCl 和蛋白酶K，并且所得混合物在45°C孵育2小时。
[0157] 最后，以比通过用蛋白酶K处理获得的溶液高5倍的量向其中添加试剂A、B和C， 随后使用旋转过滤器离心（l〇〇〇〇rpm，30秒，室温)，由此纯化染色质免疫沉淀的DNA。
[0158] (6-2)微阵列分析 通过使用GenomePlex完整全基因组扩增（WGA)试剂盒（Sigma)，扩增（6-1)中获得的 每种ChIP样品。方法根据伴随试剂盒的Sigma的方案。
[0159] 为了证实ChIP，通过使用320ng通过WGA扩增的每种DNA作为模板，并还使用下列 引物和 SYBR (注册商标)Premix Ex Taq? (Perfect Real Time) (TAKARA)，通过 PCR 法（95°C 进行5秒和60°C进行20秒x 45个循环）内部扩增磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH)基因。顺便 提及，GAPDH是用作阳性对照的持家基因，以证实DNA元件是否通过ChIP富集，并且PCR方 法使用EZ ChIP (Upstate)所附的引物进行。 5#-TACTAGCGGTTTXACGGGCG-3# 5r-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3f
[0160] 结果证实在用抗乙酰化组蛋白H3抗体进行免疫沉淀的样品中GAPDH被特异性扩 增（图3)。通过WGA扩增的每种DNA样品进行微阵列分析（NimbleGen)以进行芯片上染色 质免疫沉淀（芯片上ChIP)。"芯片上ChIP"是用于通过使在（6-1)中富集的DNA进行微阵 列分析鉴定每种DNA元件的技术。
[0161] (6_3)DNA元件的提取 基于（6-2)中获得的芯片上ChIP分析的结果，提取了具有62%或更多的AT含量的5个 序列。
[0162] A2:染色体 I5 (8〇966429 至 8〇974878) A7:染色体 11 (88992123 至 89〇0〇542) A18:染色体 4 (111275976 至 111284450) B5:染色体 1 (143034684 至 143043084) C14:染色体 11 (46〇89〇56 至 46〇97482)。
[0163] (实施例7) 使用分泌型碱性磷酸酶（SEAP)的表达作为指标的DNA元件的效果 (7-l)SEAP表达载体的构建 通过使用PSEAP-对照（Clontech)作为模板，通过PCR法（（94°C持续30秒，和68°C持 续2分钟X 40个循环）使用下列引物和KOD -Plus- (Τ0Υ0Β0)扩增SEAP基因。 5r-AAAGCTAGCftTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC- 5r -M.?LB.GftTCTTCATGTCTGCTCGAAGCGGCCGGCCGC- 3f
[0164] 随后，通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增的SEAP片段，并从凝胶上切下，然后使用 QIAquick凝胶提取试剂盒（Qiagen)纯化。这样获得的DNA片段用作插入片段。用限制 性酶Nhel和Bglll消化插入片段，并且用限制性酶Nhel和BamHI消化载体pIRES hyg3 (Clontech)。所获得的DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳以分别分离目标片段，并且将目标片 段从凝胶上切下，然后纯化。然后，进行连接反应和转化。使用LigaFastRapidDNA连接系 统（Promega)进行连接反应。如下进行转化。首先融化冷冻的细胞JM109 (TAKARA)，将连 接反应后获得的10 μ 1溶液添加到融化细胞的溶液中，并将所得混合物在冰上放置30分 钟。随后，对混合物应用热休克（42°C，45秒)并将混合物在冰上冷却5分钟。向此细胞悬 浮液中添加 lml LB培养基，并将所得混合物在37°C摇动1小时。然后将混合物铺板在包含 0. 1 mg/ml氨苄青霉素的LB平板上，并将板在37°C孵育14至16小时。此后，通过碱裂解， 从LB平板上培养的克隆收集目标质粒。最后，确定通过碱裂解获得的质粒中SEAP的多核 苷酸序列，由此构建pCMV/SEAP ires Hygro。
[0165] (7-2 ) DNA元件的克隆 随后，使用BAC SUBCLONING试剂盒（Gene Bridges)从包含对应插入到（7-1)中获得的 SEAP表达载体的DNA元件的多核苷酸序列的细菌人工染色体（BAC)克隆实施例6中提取的 各个DNA元件。
[0166] 首先，用限制性酶Spel消化（7-1冲获得的pCMV/SEAP ires Hygro几个小时，随后 进行乙醇沉淀，并且将沉淀物溶解在无菌水中。通过使用用Spel消化的载体作为模板，使 用下列引物和KOD -Plus- (Τ0Υ0Β0)进行PCR法（94°C持续15秒，55°C持续30秒，和68°C 持续10分钟X 30个循环)。 A2D: 5f-GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGGAT C€T a TTAAT AGTAATCMTTACG- 3# A2R: 5# -CTCATT€TGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTG?,TGCTATCCTTTCrtAGCMAATC CT AGTCAATZmTCMTGTC AACG- 3# A7D: 5f -CT.TATTTTCTiy\GTAGTAmGACTraATTGTGAGAACAAAATAJyyy\CT?GGATC CTATimTAGTAATCAATTACG- 3f A7R： 5# -CTCTTCCCATTCTCMTTG酿TCTACTTOWmGGTTTACCAmCTAAGACCTAG TCAATAATCAATGTCAACG-3* M8D: 5f -CGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGG'AGGCTGAGGCGGGTGGATCACCTCtAGGTCGA TCCTATTAATAGTAATCAATTACG-3f A18R： 5#-CATACAGAAGCCAGTTTGAACTGAGACCTCACTCCATTTCTTACAAGTTATGCCC TAGTCAATAATCAATGTCAACG- 3r BSD: 5r-ACCGTTTTATftTTGTTTAAGCATTTCCTAGACATATTTGGCTACAAATCTAGATC CT ATTAATAGT AATCAATTIICG- 3r B5R: 5r -GMCTTAGGGGGGCTGATTAmT?AAACAATAGMATQTAGTCTTASATG.2yyiCC TAGTCAATAATCAATGTCAACG-3" C14D: 5#-CaCAAftGTTCACTGTCAAGGCCAGGTGATGAGGCCCACACATGCCCGGSCCTTGA TCCTATTiiATAGTMTCAATTACG - 3 # C14R: 5# -CAAAACCTCATCTCTACTGAAAAT/iGAAAAT'i'AGCTGGGCGTGGTGGCAGGTGCC CTAGTCAATAATCAATGTCAACG-3"
[0167] 使用部分反应溶液通过琼脂糖凝胶电泳证实扩增之后，将剩余的反应溶液进行乙 醇沉淀。沉淀溶解在无菌水中并使用所得溶液作为用于转化的DNA。
[0168] 随后，进行用于转化的大肠杆菌的制备。
[0169] 对应在实施例6中提取的5个序列的BAC克隆如下。
[0170] [表 1] 1 提取的仔列 相应的BAC*SI I-~猫撕謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝謝瞧mmmm顯- ................................................................................................................................ _ ................................................................ I A2 BP11-152F13 A7 RP11-643G5 | A18 ^ RP11-115A14 35 RPH-64 0M9 ： ? C14 RP11-702F3 1
[0171] 已融化的10 μ 1上述BAC克隆（Advanced GenoTechs Co.)接种到1ml培养基(包 含15 μ g/ml终浓度的氯霉素)并在37°C孵育过夜。将30 μ 1培养溶液转移到1. 4ml培养 基(包含15 μ g/ml终浓度的氯霉素）并在37°C孵育2小时。重复两次离心和无菌水洗涤， 并将细胞悬浮到20 μ 1无菌水中。向冷却的比色杯（0. 1 cm)中添加1 μ 1 pRED/ET (Gene Bridges)和大肠杆菌，然后进行电穿孔（1350 V，10 μ F)。然后向其中添加 lml的S0C培养 基，并且所得混合物在30°C孵育70分钟。将100 μ 1培养溶液铺板到LB平板上(包含终浓 度分别为3 μ g/ml和15 μ g/ml的四环素和氯霉素)，并且在30°C孵育过夜。在第二天，这 样获得的每个克隆接种到lml培养基(包含终浓度分别为3 μ g/ml和15 μ g/ml的四环素 和氯霉素)，并且在30°C孵育过夜。将30 μ 1培养溶液转移到1. 4ml培养基(包含终浓度分 别为3 μ g/ml和15 μ g/ml的四环素和氯霉素),并且在30°C孵育2小时。然后向其它添加 50 μ 1 10%的L-阿拉伯糖，并进一步在37°C进行孵育1小时。此后，用无菌水洗涤重复两 次，并且向冷却的比色杯（〇. lcm)中添加悬浮在30 μ 1无菌水中的大肠杆菌和1 μ 1用于 转染的DNA，然后进行电穿孔（1350 V，10 μ F)。然后向其中添加 lml的S0C培养基，并且所 得混合物在37°C孵育90分钟。培养物溶液的总量铺板到LB平板(包含100 μ g/ml氨苄青 霉素）上，并孵育该平板。此后通过碱裂解获得目标质粒。最后，证实所获得的质粒的序列 和其限制性酶位点，由此构建目标质粒（图4)。
[0172] (7-3)使用SEAP表达作为指标的评价 使用宿主细胞 CH0-K1 (ATCC)和转染试剂 Lipofectamine 2000(Invitrogen)评价 (7-2)中构建的各个质粒。
[0173] 在转染后2天开始用800 μ g/ml的潮霉素进行抗生素选择进行约2周，由此建立 稳定表达的多克隆细胞系。这样建立的细胞系在测量前一天进行培养基替换，并且将给定 数目的细胞接种到24孔板（IWAKI)上。在细胞铺板24小时后，收集培养物上清液，并且测 量SEAP的活性。使用SensoLyte? pNPP分泌型碱性磷酸酶报告基因测定法（ANASPEC)测 量培养物上清液中SEAP的活性。
[0174] 测量结果显示在图5中。当将不具有元件的对照中SEAP的活性归一化为1时，具 有DNA元件A2、A7、A18、B5或C14的稳定表达的CH0细胞系的培养物上清液中SEAP的活 性显示比对照的值高5倍或更多的数值。基于该结果，证实了所有5个类型的DNA元件显 著增强SEAP表达。顺便提及，上述5个类型的DNA元件的多核苷酸分别由序列表中SEQ ID NO: 10至14表示。
[0175] (实施例8)组合使用的启动子的一般性 在实施例7中DNA元件的评价中使用的载体的启动子是CMV启动子，并且从而研究了 与其它一般启动子组合的DNA元件的使用。
[0176] (8-1)使用EF-1 α和SV40启动子的SEAP表达载体的构建 通过使用PSEAP2-对照（Clontech)作为模板，通过PCR法（（94°C持续30秒和68°C持 续2分钟X 40个循环）使用（7-1)中所述引物和KOD -Plus-扩增SEAP基因。与（7-1)中 相同的方式制备扩增的SEAP基因作为插入片段。用限制性酶Nhel和Bglll消化插入片段 并且用限制性酶Nhil和BamHI消化pIRESpuro3载体（Clontech)，并且如（7-1)中相同的 方式构建 pCMV/SEAP ires Puro。
[0177] 随后，通过使用pEFl/V5-His A (Invitrogen)作为模板，通过PCR法（94°C持续15 秒，60°C持续30秒和68°C持续2分钟X 30个循环)使用下列引物和KOD -Plus-扩增EF-1 α 启动子。 5f-AAAACTAGTCAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACC-3f 51 -AAAGftTATCCCTAGCCUGCTTGGGTGGTACCAAGC-3"
[0178] 通过使用上面构建的pCMV/SEAP ires Puro作为载体，对载体和启动子用限制性酶 Spel和EcoRV进行消化，并且根据（7-1)中所述的方法构建pEF/SEAP ires Puro。
[0179] 类似地，通过使用pcDNA3. 1+ (Invitrogen)作为模板，通过PCR法（94°C持续15 秒，60°C持续30秒和68°C持续1分钟X 30个循环）使用下列引物和KOD -Plus-扩增SV40 启动子。 5r - AAAACTAG7CTGTGG?aTGTGTGTCAC；TTAGGGTG-3r 5? -A^AGM'MCAGCTTTTTGCSJyyiGCCTAGGCCT.C-Sf
[0180] 通过使用上面构建的pCMV/SEAP ires Puro作为载体，对载体和启动子用限制性酶 Spel和EcoRV进行消化，并且根据（7-1)中所述的方法构建pSV40/SEAP ires Puro。
[0181] (8-2) DNA元件A2或A7的克隆 随后，使用在（8-1)中构建的pEF/SEAP ires Puro和pSV40/SEAP ires Puro作为基本 结构进行DNA元件A2或A7的克隆。
[0182] 首先，用限制性酶 Spel 消化 pEF/SEAP ires Puro 和 pSV40/SEAP ires Puro 几个小 时，随后进行乙醇沉淀，并且将沉淀物溶解在无菌水中。通过使用用Spel消化的相应载体 作为模板，通过PCR法（94°C持续15秒，55°C持续30秒，和68°C持续10分钟X 30个循环） 使用下列引物和KOD -Plus-制备用于转染的DNA。 A2 (EF/D); 5# -GGAAATTGACMGmTCATTCACiACAGTACCACAAACATGAAATAAATGTGCTa GTCAGAGAGGAATCTTTGCftGC-3f ?2 {SV40/D): 5f"GGAAATTGAGAAGTATCATTCACAACAGTACCaCAAACftTGAAATAAATGTGCTa GTCTGTGGABJGTGTGTCAGTTAG-3J A2 (SF 顧 SV40/R): 5#-CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGATGCTATCCTTTCAAGCMyiATT TTAAAACTTTATCCATCTTTGCA-3r hi (EF/D): 5# -CTT?iTTTTCTAAGTAGTATAGACTTAATTGTGAGAi\CAAAATAAAAACTTGCTAG TCHGftGAGGAJiTCTTTGCAGC- 3" A7 {SV40/D): 5# -CTTivTT?TCT?ftAGmGTATAGACTTMTTGTGAGAACAAAATMJ4MiCTTGCTAG TCTGTGGMTGTGTGTCAGTTJIG- 3# (EF m SV40/R); 5f-CTCTTCCCATTCTCA7TTGMTCTACTTCAAAAGGTTTACCATACTAAGAACTAG TTTTAAAACTTTATCCATCTTTGCA-3r
[0183] 通过使用这样制备的用于转染的DNA和用pRed/ET转染的BAC，将DNA元件A2或 A7克隆到（8-1)中所述的载体中。顺便提及，根据（7-2)中所述的方法进行该方法。
[0184] (8-3)使用SEAP表达作为指标的评价 使用宿主细胞 CH0-K1 (ATCC)和转染试剂 Lipofectamine 2000(Invitrogen)评价 (8-2)中构建的各个质粒。
[0185] 在转染后2天开始用8 μ g/ml的嘌呤霉素进行抗生素选择进行约2周，由此建立 稳定表达的多克隆细胞系。这样建立的细胞系在测量前一天进行培养基替换，并且将给定 数目的细胞接种到24孔板上。在细胞铺板24小时后，收集培养物上清液，并且测量SEAP 的活性。使用SenS〇LyteTMpNPP分泌型碱性磷酸酶报告基因测定法（ANASPEC)测量培养物 上清液中SEAP的活性。
[0186] 测量结果显示在图6中。当在无元件的对照中SEAP的活性归一化为1时，DNA元 件A2或A7展示增强表达的效果使得SEAP的活性比对照的活性在使用EF-1 α启动子的情 况下高两倍或更多，在使用SV40启动子的情况下高4倍或更多。基于这些结果，证实当与 一般启动子组合使用时，这些DNA元件展示增强外源基因表达的效果。
[0187] (实施例9)使用抗体表达作为指标的评价 (9-1)人轻链表达载体pEF6KCL的构建 通过使用质粒pEF6/V5-HisB (Invitrogen)作为模板，通过PCR使用下列引物和K0D -Plus-获得位置2174 (紧接BGHpA的下游）和位置2958 (Smal)之间的DNA片段(包含fl 复制起始和SV40启动子和复制起始的DNA片段，下文称为"片段A"，片段A的多核苷酸序 列由序列表中SEQ ID N0: 15表不）。 5,-CCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGC-3J 5r-AAACCCGGGAGCTTTTTGCftAAftGCCTAGG-3f
[0188] 通过重叠 PCR连接所获得的片段A和包含编码人κ链分泌信号、人K链恒定区 和人多聚（Α)附加信号的DNA序列的DNA片段(下文称为"片段Β")。这样获得的其中连接 了片段Α或片段Β的DNA片段用限制性酶ΚρηΙ和Smal消化，并且将所获得的片段连接到 质粒pEF6/V5-HisB (Invitrogen)，其用限制性酶ΚρηΙ和Smal消化，由此构建在EF-1 α启 动子下游具有信号序列、克隆位点、人κ链恒定区和人多聚（Α)附加信号序列的人轻链表 达载体PEF6KCL。
[0189] 将通过用限制性酶ΚρηΙ和Smal消化上述方法制备的pEF6KCL获得的DNA片段连 接到pEFl/myc-HisB (Invitrogen)(其用ΚρηΙ和Smal消化)，然后转化，碱裂解和测序，由 此构建质粒pEFIKCL。
[0190] (9-2)人重链表达载体pEFlFCCU的构建 包含编码人IgGl信号序列和恒定区氨基酸序列的DNA序列的DNA片段(此DNA片段的 多核苷酸序列由序列表中SEQ ID N0: 16表示）用限制性酶Nhel和Pmel消化，并且将所得 片段连接到用Nhel和Pmel消化的质粒pEFIKCL，由此构建在EF-1 α启动子的下游具有信 号序列、克隆位点、人重链恒定区和人多聚（Α)附加信号序列的人重链表达载体pEFlFCXU。
[0191] (9-3)单人源化抗体基因 X表达载体(人源化的抗体基因 X/pEF_LHN#)的构建 通过连接（9-1)或（9-2)中构建的L链或Η链表达载体，构建单抗体表达载体（pEF_LHN (缺少可变区））。
[0192] 通过PCR法向基因表达单元的两端添加限制性酶Sail位点：一个在启动子的上 游，并且另一个在PEF1KCL的多聚（A)的下游。然后进行琼脂糖凝胶电泳，从凝胶切出所需 的DNA片段，并且纯化DNA片段，由此制备插入片段。通过用限制性酶Sail消化（9-2)中 构建的载体PEF1FCCU，在位于所述基因表达单元上游的Sail位点线性化该载体。然后，将 线性化的载体连接到上述插入片段，然后转化，碱裂解和测序，由此构建单人源化抗体表达 载体（pEF_LHN (缺少可变区））。
[0193] 随后，将下列寡核苷酸导入载体pEF_LHN (缺少可变区）的Aatll位点。 5f-CGCGGCCGCACTAGTG1CGT-3? 5f-CACTftGTGCGGCCGCGACGT-3#
[0194] 将相应的寡核苷酸稀释到5 pmol，并通过使用T4多核苷酸激酶（TAKARA)，使得反 应在37°C进行1小时。然后向其添加10x Η缓冲液（TAKARA)，并且通过在96°C反应1分钟 和然后在室温反应30分钟进行退火。连接这些寡核苷酸和用限制性酶Aatll消化的载体 pEF_LHN，然后转化，碱裂解和测序，由此构建pEF_LHN# (缺少可变区)。
[0195] 通过将人源化抗体基因 X的可变区整合到上面构建的通用载体（pEF_LHN# (缺少 可变区）），完成单人源化抗体基因 X表达载体(人源化抗体基因 X/pEF_LHN#)的构建。
[0196] 首先，通过使用下列引物和KOD -Plus-，通过PCR法（94°C持续15秒，55°C持续30 秒和68°C持续1分钟X 30个循环）扩增人源化抗体基因 X的L链可变区。
[0197] L链可变区： 5#-AAACATATGGCGACATCCAGATGAC-31 5 r -AJ\ACGTACGCTTGATCTCCftCCTTGG -3#
[0198] 扩增的L链可变区片段和通用载体（pEF_LHN# (缺少可变区))用限制性酶Ndel和 BsiWI消化，随后进行琼脂糖凝胶电泳，将所需片段从凝胶上切出，纯化，连接反应，转化，碱 裂解和测序，由此将所述L链可变区整合到载体中。以相同的方式，通过使用下列引物和 KOD -Plus-，通过PCR法（94°C持续15秒，55°C持续30秒和68°C持续1分钟X 30个循环） 扩增人源化抗体基因 X的Η链可变区。
[0199] Η链可变区： 5#-AAAGCXGAGCCAGGTGCAGCTGCAGG-3f 5r -JiAAGCTGiiGCTCA€GGTCflCCAGGGTTC-3#
[0200] 扩增的Η链可变区片段和其中插入L链可变区的载体用限制性酶BlpI消化，随后 进行琼脂糖凝胶电泳，将所需片段从凝胶上切出，纯化，连接反应，转化，碱裂解和测序，由 此将所述Η链可变区整合到载体中，并且构建单人源化抗体基因 X表达载体(人源化抗体基 因 X/pEF_LHN#)。
[0201] (9-4)单人源化抗体基因 X表达载体(人源化的抗体基因 X/pCMV_LHN#)的构建 通过使用（9-3)中构建的单人源化抗体基因 X表达载体(人源化的抗体基因 X/pEF_ LHN#)作为基本载体结构，通过根据下列方法替换启动子构建另一个单人源化抗体基因 X 表达载体(人源化的抗体基因 X/pCMV_LHN#)。
[0202] 通过使用pIRES puro3作为模板，通过PCR法（94°C持续30秒，和68°C持续3分钟 X 40个循环）使用下列引物和KOD -Plus-扩增CMV启动子片段。
[0203] Η链的上游： 5 * -CTTTTGCAiUlAAGCrrCGCGl'TACATAACTTiiCGGTAAATGGCC- 3^ 5#-TTCATGGTGGCGCTAGCCCGCAGATATCGATCCGAGCTCGGTA-L链的上游： 5# -TGACGTCGACAAGCT7CGCGTTftCATiy\CTTACGGTAiyW'6€CC-3# 5f -CTGGATGTCGCCATrtTGCGCCGGAGATCCACAGCAGCJiGGGAGATGAACftCCTGG GTCTGCAGCA€CATGGTGGCGCmGCCCGCAGATATCGA?CCGAGCTCGGTA-3r
[0204] 向PCR反应溶液中添加限制性酶Dpnl，并使得反应在37°C进行1小时，随后使用 MinElute reaction Cleanup试剂盒（Qiagen)纯化，由此制备用于在In-Fusion中使用的样 品。同时，用限制性酶HindIII、NheI、NdeI和Fsel消化人源化抗体基因 X/pEF_LHN#，随后 进行琼脂糖凝胶电泳，由此在所得的片段中分离两个大片段。将每个片段从凝胶上切出，并 从凝胶提取DNA，由此制备用于在In-Fusion中使用的样品。将所有用于In-Fusion的样 品合并，并且使用In-Fusion? Advantage PCR Cloning试剂盒（TAKARA)进行克隆，随后进 行转化，碱裂解和测序，由此构建单人源化抗体基因 X表达载体(人源化抗体基因 X/pCMV_ LHN#)。
[0205] (9-5 ) DNA 元件 A7 的克隆 从已证实具有增强SEAP表达效果的5种类型的DNA元件中选择A7,并克隆到抗体表达 载体中。
[0206] 如（7-2)中相同的方式，通过使用用限制性酶Notl消化的每种单人源化抗体基因 X表达载体(人源化抗体基因 X/pEF_LHN#和人源化抗体基因 X/pCMV_LHN#)作为模板，通过 PCR法（94°C持续15秒，55°C持续30秒和68°C持续11分钟X 30个循环）使用下列引物和 K0D -Plus-制备用于转染的DNA。 人源化抗体基因 X/pEF_LHN# D: 5f -CTCTTCCCMTCTCAT+TTGMTCTACTTCAAAAGGTTTMXAmCTAAGACTCGA GGCACTAGTGACGTCAGGTGGCACT-3, 人源化抗体基因 X/pEF_LHN# R: 5# -CTCT?CCCOTTCTCATTTGAATCTACTTO*AASGGTTTACCATACTAHGftGCACT AGTGACGTCAGGTGGCACTTTTCGG-3 * 人源化抗体基因 X/pCMV_LHN# D: 使用人源化抗体基因 X/pEF_LHN# D。 人源化抗体基因 X/pCMV_LHN# R: 使用人源化抗体基因 X/pEF_LHN# R。
[0207] 通过使用上面制备的用于转染的DNA和用pRed/ET转染的BAC，将DNA元件A7克 隆到（9-3)和（9-4)中所述的单人源化抗体基因 X表达载体中。图7中显示了载体构建的 示意图。顺便提及，根据（7-2)中所述的方法进行该方法。
[0208] (9-6)使用抗体表达作为指标的评价 使用宿主细胞 CH0-K1 (ATCC)和转染试剂 Lipofectamine 2000(Invitrogen)评价 (9-5)中构建的各个质粒。
[0209] 在转染后2天开始用800 μ g/ml的遗传霉素（Roche)进行抗生素选择进行约2 周，由此建立稳定表达的多克隆细胞系。这样建立的细胞系在测量前一天进行培养基替换， 并且将给定数目的细胞接种到24孔板上。细胞铺板24小时后，收集培养上清液，通过ELISA 法测量培养物上清液中抗体表达水平。顺便提及，如下进行ELISA。在包被50 ng/孔的抗 κ轻链的96孔板中，将100 μ 1无细胞培养物上清液加入到各孔中，并将板在37°C孵育1 小时。顺便提及，去除样品（培养物上清液)，并且每孔用200 ylPBS-吐温（0.05%)洗涤。 然后，向每孔中添加100 μ 1 HRP-标记的抗人IgG (Fc)，并且将板在37°C孵育另外1小时。 此后，去除HRP标记的抗人IgG(Fc)，并且每孔用用PBS-吐温（0. 05%)洗涤。然后使用POD 底物ABTS试剂盒（Nacalai)显色，并且测量在405nm的测量波长的吸收。对于抗κ轻链、 所述抗人IgG (Fc)和样品的稀释，使用PBS-吐温（0.05%)。通过使用系列稀释到12ng、 6ng、3ng、l. 5ng、0. 75ng、0. 375ng和0· 1875ng的人IgG作为标准品，计算样品的浓度。
[0210] 结果显示在图8中。证实了当在抗体表达载体中使用EF-la启动子或CMV启动 子时，具有DNA元件A7的样品相比无元件的对照具有更好的增强抗体产生的效果。
[0211] (实施例10)展示增强外源基因表达活性的序列的长度 (10-1)具有不同序列长度的DNA元件的克隆 基于实施例7中使用的序列的长度，构建包含每种DNA元件但具有不同序列长度的载 体。
[0212] 基于0嫩元件4237318、85和(：14各自全长设计的具有不同序列长度的0嫩元 件的细节分别显示在图9、11、13、15和17中。首先，用限制性酶Spel消化（7-1)中所述 pCMV/SEAP ires Hygro几个小时，随后进行乙醇沉淀，并且将沉淀物溶解在无菌水中。通过 使用用Spel消化的载体作为模板，通过PCR法（（94°C持续15秒，55°C持续30秒，和68°C 持续10分钟X 30个循环）使用下列引物和KOD -Plus-制备用于转染的DNA。通过使用这 样制备的用于转染的DNA和相应的用pRed/ET转染的BAC，将具有不同序列长度的每种DNA 元件克隆到（7-1)中所述的pCMV/SEAP ires Hygro中。顺便提及，根据（7-2)中所述的方 法进行该方法。 A2-1D: 5f ~CATGCACAGATTAGCCMTTAGTACTTACTAAATCAA.%CTCAA?TTCTGA.%GTCT AGTTATmATAGTMTCAATTACG- 31 A2-1R： 51 -CTCATTCTGTGGGTTGTCATTTCACTTCCTTGftTGCTATCCTTTCilAGCAAAATT CftATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3r A2-2D: 5#-ACACTGGTCAAAGGGACAGGTCATTGTTATGCTGGCAATGCAGGCTGCTGAAAAC TAGTTATTAATftGTjmTCAATTACG-3# A2-2R: 5r-ACTGTAGCTTCTTATTTTTTACCTGCAGTGCATTCCTGTAAAAGTAGTGTGGAGT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3f A2-3D; -CTGGAAATTGIiGAAGTATCATTCACAACIIGTACCACAAACATGAAATiyyiTGTGC TAGTTATTAAT AGT/SATCMiTTACG - 3# A2-3R; 5"-CCAAGCTTGTCCAACCGCGGCCTGCAGGCTGCATGCAGCCTGTGAAGGCTTTGftT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3# A2-4D: 5# -TCA/sXCATTTATCMTTTTATCTTCAAAGTCCCTCACTTCAGGGaGATGATATAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3" A2-4R: 5r-ATATATAAAAGTTCATSTATATATAAAATCATGCAATACACGSCCTTTTGTGACT CWTAATCAATGTCAACGCGTATAT-3f A2-5D: 5，-CGCATAAAAG.SAAAAGCATCCTimjmTAAAOW：CATCAATGGCTCCTCGGTGGC mGTTATTAftTAGTAATCIlATTACG" 3f A2-5R; 使 A2-6D: 5?-GGGSGGCTACAGCTTGCCTCTCTftACCACTAAMGGCATGACCCTCCTCAAAGCT AGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3 * A2-6R: 使用,《41 A2-7D: 5 ^ -TCTGGCTTCCCTGGGCCACGCTGGAAGAAGAATTGTTCT'TGCGCCACACATAAAAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3, A2-7R; -AGCTGATTTTTACGTTAAATGTAACATGTAAAG.aJATATATGTGTGTTTTTAGAT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3, A2-8D: 5# -GTGAAGAGGAGGAGiYiGTCMAATTa%AAGTCTTAimTGATGTfiGTTTTAAGTAC TAGT7ATTAATA6TAATCAATTACG-3r A2-8R: -ATGACACTTC-ftTATTGTTGTTTATATTGCTGGTTAGTATGTGCCTTCATTTACCT CAATAaTCAATCTCAACGCGTATAT^- 3f A2-5D; 使 HJA2-6P? A2-9R: ttlljAlR. A2 -10 D: A2-10R; 使 WA2-71 A2-11D: 使IHA2-WL· A2-21R: 使·Α2-21 A2-12D: 使用 Λ2-2Ι), A2-12R; 使 111 .42-411- A2-13D: 使用Α2-Μ-- A2-13R； ftW.42-m- A2-KD; 使用A2D? A2-I4R; 使用A2-2H A2-15D; 使用A2-21 A2-15R: 使用A2K, A2-16D: 使用.42-βΙ A2-16R: tf 用 A2-41 A2-17D: 使謂A21 A2-17R: 使 WA2H AT-ID: 5, -AAAAACAAAACTGGAGTA/^CAAGATGA.ATTGTTTTAATAGAGGCACTGTATTAC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3 * A7-1R: 5#-ftTACAATGTTCCATGTATTCTGTGCCTGAACCTATGCAGCTGftTGTAGCTGAAGT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3f Λ7-20.· 5# -GATCTTftTTTTCTAAGTAGTATAGACTTilATTGTGAGAACAAAATAAAAACTTGC TAGTTATTAftTAGTAATCAATTACG-3 # i\7-2 R: 5r -TGTTGTTTTCAGCCACTAAGTTTGAGGTGATTTGTTCTGGCAGTCCTJIGGAAACT CAATAATC#y\TGTCAACGCGTATAT- 3# A?-3D: 使 l+f|A?-2IL· A7-3R: 5#-AGCCTACACTACCCTTTGCAGCCTTTGGTAACTATCCTTCTGCTGTCTACCTCCT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3# Α1-Α?: 5f-AGGAGCTCCTGAATGAAGGACATCACTCAGCTGTGTTAAGTATCTGGAACAATAC TAGTTATTAATAGTMTCAATTftCG-3# A7-4R: 5f -GACATJyyUiTGTAAGATATGAmTGCTfiTGTAAGAT ATGATACCTGCCTTAAAAT CAATAATCAATGTCAACGCGTATAT-3# A7-5D: 5f-CACTGCTTGATACTTACTGTGGACTTTGAAAATTATGimTGTGTGTGTGTGTGTC TAGTTATTAATAGTAATCAATTACG-3# A7-5R: 5r -CAATTACATTCCAGTG^TCTGCTACTTAGAATGCATGACTGailCTCCTGGGTGGT CAMmTCAATGTCAACGCGTATAT-3# A7-6D: 5f"TTATTTTGAAGAGAAACTCCTGGTTCCCACTTAAAATCCTTTCTTGTTTCCAAGC TAGTTAT TAATaGTAATCAATTACG-3r A7-6B: 5f"AAGCAGTGTGTGTTTaCCTGCM'GTGTATGTG/mTTAACTCTGTTCCTGAGGCftT €ftATAATCI?TGTCAACGCGTATAT-3# A7-7D; 5; -ATTGCATGTTCTCATTTMTTGTGGGATGl'JlAAAftTCAMACAATAGAACGTATC TAGTTftTTAATAGTaATCAATTACG-3# A7-7R: -TTGGGAGGCCGCAGCTGGTAGATCACTTGAGGCCACGAATTTGACACCAGCAGGT C?AT AATCJy^TGTCAACGCGTATftT - 3# A7-8D: A7-8R: 使 fi+Um A7-90; 使用A7-7D. A7-9R: 使用.47---? &7-10D; 使 f+UM-ll?, A7-10R: 使謂.47-7R, A7-11D: 使姻A7-6Da A7-I1R: 使用A7-4R? H7-12D; 使用A7-2IK A7-12R: 使 ll.lA7-iKt> A7-13D: 使用 i\7-13R; 使用A7R? A7-14D; 使|_屬" A7-14R: 使fflA7-5l A7-15D: 使用A7-6IK A7-15R: ttIljA7-7R, A7-16D: 使用A7-2D? A7-16R: 使 IIIA7-II A7-17D: 使用A7-4IK ---nR： mm Am, A1-18D: 使用Λ7-6ΙΚ A7-18R 使爾A7-51 A18-1: 5# -ATCCCCTGCTCTGCTAAmjaAGAATGGATGTTGACTCTCAGGCCCTAGtTCTTGA TCCTATTAATAGTAATCRATTACG-3 * M8-1R: MS-2D: S^-CTAAAGTGCTGGGATTACAGGCATAAGCCACCGTGCCCGGCTGGSGCATTGGGAT CCTATTAATAGTAATC AAT'T ACG- 3f JU8-2R: 5# -HCTSCTTACACATTTCGaGTTTTRimTAilGGCGTTCAATATAGAGTGaACaCCTA GTCAATAATCAATGTCftACG-31 A18-3D: -CAGGCATAAGCCACCGCACCCGGCCACCCCTTACTAATTTTTIiGTAACGTCGATC CTATTAATAGTAATCAATTACG-3f A18-3R: 卜 CTGM'TCmCTTTGMXTCTGCTTTCXAACTTI'GCCCCAAAGJmAGTmGTCACC? AGTCAATAATCAATGTCAACG-3f A18-4D: 使用 AJ8-3_h A18-4R: 5#-TTCA?4TG?AACIAGCTCTG'TGAGGCTCATTTGTACCCATTTTGTTCAGTACTGCC TilGTCASTAATCMTGTCAACG- 3r B5-1D; 5l -ACATACCCAGAGACACTGAGAGAGACAGACAGACAGTAAACAGAGGIiGCACGATC CTATTAftTAGTAATCAATTJiCG - 3r B5-1R: 使用B5R. B5-2D: -GCTCMTTGTATCTTATGAAAACAATTTTTCMiAATAiWiCAAGAGATATGATCC TSTTJ\ATftGTMTCMTTACG-3# B5-2R: 使用B5R* 35-3D: -CCTGTGCTGftATACCGfCTGCATMGTATAGGAAAGGGTTAACTCAGCAGGGAfC CTATTAATAGTAATCAATTACG-3f B5-3E: 51 -T&TGTGAATGGJyyirAimATAATCAAGCTTGTTAGAATTGTGTTCaTAATGACCC TAGTCft ATA^.TCAATGTCAACG- 3< B5-4D: ttlfjBSD, B5-4R: f/ -GA.%AGTCTACAATTTTTTCAGTTT?ViiiATGGTj%TTTATT?GTIlHCaT6Ti\CCCTA GTCAATAATCAATGTCAftCG-3r B5-5D; 使用B5-11K B5-5R: 5#-CAAAGATGAAGGATGAGAGTGACTTCTGCCTTCATTATGTTATGTGTTCATATCC mGTCAATAATCAATGTCAACG- 3， B5-6D: 5r - CftGTGAATTAT.TCACTTTGTCTTAGTTAAGTAl.AA.JiTAAAATCTGftCTGTGATCC TATTAATAGTAATCAATTACG-3r B5-6R: 5#-GAACAGACAGGTGRATGAGCACAGAGGTCATTTGTAAftCCGTTTGTGGTTAGCCT AGTCAATAATCAATC-TCAACG-3J C14-1D; 5# - CTTTTTGGCTTCTGTGTTTHAGTTATTTTTCCCCTAGGCCCA€A,%ACAGftGTCGa TCCTATTAATAGTMTCAATTACG- 3f C14-IR; 5 *-AACCTTGGAAAAATTCTGTTGTGTTTAGIAGCATGTACCAATCTATCACTCCTAG TCAATAATCAATGTCAACG-3? C14-2D： -CTATTCACTGTCTGTAGGATGAiymAGTTAATAACACCCTGftGAGGTTTCGATCC TATTAATAGTAATCaATTACG-3r C14-2R: 5,-CCTTAGATTAGTTTATTGTATTTTTTATCAGCTACTATAAGGTTTACACACCCTA GTCAATAATCAATGTCAACG-3# C14-3D; 5f -CAAGACCCTCAV4ATTCAAAAATTTCCTTTATCTTGCTGTAGCSCCTCCTGCG.HT CCTATTAATAGTAATCAATTACG-3f C14-3R; 5*-GGAGGGGHTAGGAAGGGGATGAGGCCTAACAGGTTGATGftTCTAGGCTTTACCTA GTCMTMTCMTGTC?iaCG_ 3, C14-4D: -CTCiyyyyiGGAGAT^ATTCCAGCCCCTCGCCTTAAAGAATCCCmTCftAGTGftTG CTATTAATAGTAATCAATTACG-3f C14-4R: 使朋04-11 C14-5D: 5#-CGCTTGAACCTGGGAGGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCACGCCGTTGGATCC TATTAATAGTAATCAATTACG-3r C14-5R: 使 nicm C14-6D: 使 JUC:14-#h C14-6R; 5#-TTAACTTTTTCATCCTACAGACAGTGAATftGTAAAGCTTTCTSTGAAGACATACC CTAGTCAATAATCAATSTCAACG-3# C14-7U: 使用 C:I4-2I>,-. C14-1R: 使用Cl 4-11 C14-8D: 使爾 04-3?,. C14-8R: -AAATTATTTCCTGGTGGGCAATATTAGAiiTATGGGGAATGTTTGCTTCTGAGCCT AGTCAMAATCAATGTCAACG-3， C14-9D; C14-5R; 使用 使 WCM-3R, C14-I0D; 使用 Ι?4-2?, C14-10R: 使 IfJCMl C14-11D: 使 IOC: 1131). C14-11R: 使师0'21 C14-12D: 使用 C_4*41J? C14-12R: 使用04-il C14-13D; 使 I.HC14-3IK C14-13R: 使用 C'l'lR?v C14-14D: 使用 C'14-4l C14-14R; 便用Cl 4-21
[0213] 对于A2的相应片段的多核苷酸序列，A2-1对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸1 至3000的多核苷酸序列；A2-2对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2801至5800的多核 苷酸序列；A2-3对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸5401至8450的多核苷酸序列；A2-4 对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸701至2700的多核苷酸序列；A2-5对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸701至2200的多核苷酸序列；A2-6对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷 酸701至3700的多核苷酸序列；A2-7对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2001至5000 的多核苷酸序列；A2-8对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸4001至7000的多核苷酸序 列；A2-9对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸1至3700的多核苷酸序列；A2-10对应序 列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸2001至5800的多核苷酸序列；A2-11对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2801至7000的多核苷酸序列；A2-12对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷 酸701至5800的多核苷酸序列；A2-13对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2001至7000 的多核苷酸序列；A2-14对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸2801至8450的多核苷酸序 列；A2-15对应序列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸1至5800的多核苷酸序列；A2-16对应序 列表中SEQ ID N0: 10的核苷酸701至7000的多核苷酸序列；A2-17对应序列表中SEQ ID NO: 10的核苷酸2001至8450的多核苷酸序列。
[0214] 对于A7的相应片段的多核苷酸序列，A7-1对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸 601至3600的多核苷酸序列；A7-2对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸3601至8420的 多核苷酸序列；A7-3对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸5401至8420的多核苷酸序列； A7-4对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸3401至6400的多核苷酸序列；A7-5对应序列表 中SEQ ID N0: 11的核苷酸1501至4500的多核苷酸序列；A7-6对应序列表中SEQ ID N0: 11 的核苷酸4401至7400的多核苷酸序列；A7-7对应序列表中SEQ ID NO: 11的核苷酸2401 至5400的多核苷酸序列；A7-8对应序列表中SEQ ID NO: 11的核苷酸1至3600的多核苷 酸序列；A7-9对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸1501至5400的多核苷酸序列；A7-10 对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸2401至6400的多核苷酸序列；A7-11对应序列表中 SEQ ID N0: 11的核苷酸3401至7400的多核苷酸序列；A7-12对应序列表中SEQ ID N0: 11 的核苷酸4401至8420的多核苷酸序列；A7-13对应序列表中SEQ ID NO: 11的核苷酸1至 5400的多核苷酸序列；A7-14对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸1501至6400的多核苷 酸序列；A7-15对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸2401至7400的多核苷酸序列；A7-16 对应序列表中SEQ ID N0: 11的核苷酸3401至8420的多核苷酸序列；A7-17对应序列表中 SEQ ID N0: 11的核苷酸1至6400的多核苷酸序列；A7-18对应序列表中SEQ ID N0: 11的 核苷酸1501至7400的多核苷酸序列。
[0215] 对于A18的相应片段的多核苷酸序列，A18-1对应序列表中SEQ ID N0: 12的核苷 酸1至5040的多核苷酸序列；A18-2对应序列表中SEQ ID NO: 12的核苷酸1001至6002的 多核苷酸序列；A18-3对应序列表中SEQ ID N0: 12的核苷酸2001至7000的多核苷酸序列； A18-4对应序列表中SEQ ID N0: 12的核苷酸3000至7000的多核苷酸序列。
[0216] 对于B5的相应片段的多核苷酸序列，B5-1对应序列表中SEQ ID NO: 13的核苷酸 1至4001的多核苷酸序列；B5-2对应序列表中SEQ ID NO: 13的核苷酸1至3200的多核苷 酸序列；B5-3对应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷酸2491至5601的多核苷酸序列；B5-4对 应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷酸5373至8401的多核苷酸序列；B5-5对应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷酸901至4001的多核苷酸序列；B5-6对应序列表中SEQ ID N0: 13的核苷 酸4001至7000的多核苷酸序列。
[0217] 对于C14的相应片段的多核苷酸序列，C14-1对应序列表中SEQ ID N0: 14的核苷 酸960至4015的多核苷酸序列；C14-2对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸1987至5014 的多核苷酸序列；C14-3对应序列表中SEQ ID N0: 14的核苷酸4020至7119的多核苷酸序 列；C14-4对应序列表中SEQ ID N0: 14的核苷酸960至8141的多核苷酸序列；C14-5对应 序列表中SEQ ID N0: 14的核苷酸960至6011的多核苷酸序列；C14-6对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸4939至8141的多核苷酸序列；C14-7对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷 酸960至5014的多核苷酸序列；C14-8对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸2994至7119 的多核苷酸序列；C14-9对应序列表中SEQ ID N0: 14的核苷酸4020至8141的多核苷酸序 列；C14-10对应序列表中SEQ ID N0: 14的核苷酸1至5014的多核苷酸序列；C14-11对应 序列表中SEQ ID N0: 14的核苷酸1987至7119的多核苷酸序列；C14-12对应序列表中SEQ ID N0: 14的核苷酸2994至8141的多核苷酸序列；C14-13对应序列表中SEQ ID N0: 14的 核苷酸960至7119的多核苷酸序列；C14-14对应序列表中SEQ ID NO: 14的核苷酸1987至 8141的多核苷酸序列。
[0218] 全长序列上的相应片段的起始和终止点也显不在图20和21中。
[0219] (10-2)具有不同序列长度的DNA元件的评价 使用宿主细胞CH0-K1 (ATCC)和转染试剂Lipofectamine 2000评价（10-1)中构建的 各个质粒。
[0220] 以与（7-3)相同的方式，在转染后用潮霉素进行抗生素选择，由此建立稳定表达的 多克隆细胞系。这样建立的细胞系在测量前一天进行培养基替换，并且将给定数目的细胞 接种到24孔板上。在细胞铺板24小时后，收集培养物上清液，并且测量SEAP的活性。
[0221] 测量结果显示在图10、12、14、16和18中。其证实不仅全长DNA元件，还有具有比 全长更短的序列长度的克隆都具有增强表达的效果。基于结果，证实DNA元件A2、A7、A18、 B5和C14具有增强外源基因表达的活性，即使在其中它们具有比全长更短的序列长度的情 况下。但是，当序列长度是全长时它们展示最高的效果。
[0222] (实施例11)使用CH0细胞系之外的宿主细胞的效果 使用CH0细胞系作为实施例7至10评价中的细胞系。但是在实施例11中，选择HEK293 细胞系作为CH0细胞系之外的细胞系。在37°C存在5%C02的情况下将HEK293细胞系进行 静态培养，使用包含10%FCS的DMEM培养基（Invitrogen)，并且在转染前一天将给定数目的 细胞接种到6孔板上。为了评价包含（8-2)中构建的每种DNA元件的SEAP表达载体，使用 每种质粒和转染试剂Lipofectamine 2000 (Invitrogen)进行转染。在转染后2天开始用 潮霉素进行抗生素选择进行约2周，由此建立稳定表达的多克隆细胞系。这样建立的细胞 系在测量前一天进行培养基替换，并且将给定数目的细胞接种到24孔板上。在细胞铺板24 小时后，收集培养物上清液，并且测量SEAP的活性。使用SensoLyte? pNPP分泌型碱性磷 酸酶报告基因测定法（ANASPEC)测量培养物上清液中SEAP的活性。
[0223] 测量结果显示在图19中。以与实施例3中相同的方式，证实了每种DNA元件在 HEK293细胞系中也高度有效增强外源基因（SEAP)的表达。
[0224] 工业应用性 通过使用根据本发明的启动子或根据本发明的外源基因表达载体，将外源基因表达单 元导入哺乳动物宿主细胞，可能改善治疗性蛋白、抗体等的外源基因的产生。 序列表 <110> DAIICHI SANKYO COMPANY, LIMITED 〈120>衍生自人基因的启动子 <130> DSPCT-FP1232 <160> 16 〈170> Patentln 版本 3. 4 <210> 1 <211> 2348 <212> DNA 〈213>智人 <400> 1 atttatgtat attaacagca cattaacagc taaaaagaaa aactcacata atcatattag 60 ttcatagaaa caatgcattt gacatactcc aacatccatt catgatttta ttttattttg 120 tatttatata ttttttttga gatggagtct cgctgtcacc caggctggag tgcaatggct 180 cgatctcggc tcactgcagg ctccgccccc ggcggttcac gccattctcc tgcctcagcc 240 tcccgagtag ctgggactac aggcgcccgc cacctcgccc agctaatttt ttgtattttt 300 agtagagacg gggtttcacc gtgttagcca ggatggtctc gatctcctga cctcgtgatc 360 cacccgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt gagccaccgt gcccggccca 420 tgattttaaa aaaacctctc agaaatagaa acagagggaa cttcctgaat ttgattaaaa 480 atacctgcaa aatcctagag ctaatattat acttaatggt gaaagactga atggttttcc 540 cctaagatgg agaacaaggc acggatgtcc ttgctcacca ctcctattca acaaaggact 600 ggaaaccaga aataacttta attttttttt ttctcaagtg ataggttcac agagaaaaag 660 ctttactgga tgaactttta gattactact tttatagagc agcagagata aaagccaggt 720 cgaaaagtgc atgtggagta aggaaatgga cctagttcga caaaagggct cagaacgact 780 gcccagatga gattgtagac gcagctgtag tttactttct atctggaaga aacttcaagt 840 tatccttaat tttccaagga gacagtcact taccttttaa aaaacattat tagagaagca 900 ccgggcggga gcatatctag cattaaaaat gtgggatgaa taccatctct gcttggtaaa 960 ggtggttggg aatcctgaga gagggcacct agtgtggctt ctgcattttt cacagtgcct 1020 ggaccacggc tgaaagtaac tcttgcatga catttgacag aagaggaaac cgaagctcag 1080 attaaattcc ctgtccacag cgggatcatt cggcacgagt tcctccctgt ctggaatgct 1140 cttccccagc aatagatcct gcggctcttc cgtgtctcag tctaatgtca ttccgttcca 1200 ggattcccga cttcttaaag cataaataat ccctccccac cctctcattg tactgttatg 1260 taacttatta caatatgtca ttatatattt agtcatactg ctttaggtaa tgtcttctcc 1320 actgaactgt aagctccatg agggcaagag ttcagtcggt tttacttaat aattagcacc 1380 tagtacagta ctagcataga atgaaggcct cgcaattttt tttaaattta tttttagaca 1440 gggtcttgcg ctgtcgccca ggctggagtg cagtggtgca acctcggctc acggcagcct 1500 cgacctttcg gctccagcga tcctcccgcg tcggcctccg gggtagctgg gactgcaggc 1560 gcgcaccacc atgactggct aatttttttt tttttttttt tgtagacatg gggtctcgcc 1620 atgttgccca ggctggttcc tgagctcaag tgatcctcct gcctcggcct cccaaagtgc 1680 tgggattaca ggcgtgagcc tcagcgccca gccaagttag ccttttttaa acgtcctgtc 1740 tccggaggtt gccgaagttg gttttcttcg gcctccttct ctctcccagg cccagggctg 1800 ggacgaggcc ggttcccgcc tgcaacctgc actgaagacg ggaaccttgg gagccggtac 1860 cggaacgctc ggaaacggca ccaaagtacg aatcctaggg cggaaaagcg ttaccaagac 1920 actcgtcccc agagccgctt cctgggactc tctagcctcc taccgcttct cagtgatgtt 1980 ccggtttccg ccctcctcct cgcgctgttt ccgcctcttg ccttcggacg ccggattttg 2040 acgtgctctc gcgagatttg ggtctcttcc taagccggcg ctcggcaagg taggttggcg 2100 gcctgctctc cgacagaact tttcttcttg ggttgaggaa aacgcctttt ggagtcaggc 2160 cctggagggg cgagccttgc tcacagggtg gggatacagc cgattacccg ccctgtgctt 2220 tccgatggct tctgcggggc gagcggggcc tggccggggg gtgcgggcgg gagggcgagc 2280 cagcggcgcc tgcagcccgg gccgcgtaac gctgaccgct gtgccttcag ttctcccagg 2340 agaaagcc 2348 〈210〉 2 〈211〉 3345 〈212〉 DNA 〈213〉智人 〈400〉 2 ctaaagtgat tcctaaagaa ttcttccctt ttatcacttc cagtaggcct ctgtgaaacc 60 aaatctacct ccgcttacaa gaaagatgct gggctggcct tctctcaaag tctttccaaa 120 cttttcttgg cattgactta gacaccctag gaatctaact tgagaaaatg ttttcattaa 180 aaaaaatctc aggaagtaaa acctcctgaa tgattactga gttgacataa atcttatgtg 240 tatattctta tcagaaaaaa agtatcttca ttttgtggga caccaattca tgtattatta 300 ttattttgag acaaagtttc gctcttgttg cccaggctgg agtgcaatgg cgcgatctcc 360 acttactgca acctccacct cctgagttca agtgattctc gtgcctcagc ctccctagta 420 gctggaacta caggcatgtg ccaccacacc cagctaattt tttgtaactt tagtagagat 480 ggggtttcac catgttggcc aggatggact cgaactcctg accacaggtg atctgcccac 540 ctcagcttcc caaagtgctg ggattacagg catgagccac cgcgcccagt cgctgggtct 600 tacagtaact ttatgtttaa cattttgagg aaatgctatt cttttccaaa gtgactgcac 660 catttcatat ttgcactagc actgtacgga cattcccatt tctctgtcct agtgagtgtg 720 aaatggtatc tcactgcagt tccagtttgt atttccctga tggctaatga tgtggatcat 780 ttcatgtgtt cattggccac agagaaatgt ctatttggat tctttaccca tttttcaatt 840 gggttatttg tctttatagg tttgttgttg ttgagacaga gtcttgctct gtcactcagg 900 ctggagtgca gtggcattat cacagctaac tgcagtctag aactgctggg ctcacgtgat 960 catcccagct cagcctctcg agtaactggg actacaggca tgcgccacca gccccagcta 1020 attattttat tttttgtaga gacagggtct tactatgttg cctaggccgg tcttgaactc 1080 ctgggctcaa gcaaatctcc cacctcagac tcccaaagta ttggaattat aggtgtgaac 1140 catagtgctc agccaatttg cacaataatc ttaaatacaa aagctaagca aaacaaatca 1200 agagcatctt taaaaactag gcagtctggg aggcaggggc tgccgtgagc cgtgagatgg 1260 cacctttgca ttccagccta ggtgacagag ggaggccctg tctaaaaaaa accaaaaacc 1320 aaaaaacaaa acaaaacaaa aaacatctag gcagtagctc gtgcccgtaa tcccagctac 1380 tcaggaggct gaggcgagag aatcgtttga gcccaggagt tcaagaccag cctgggcaac 1440 agagtgagac cccatttcta aaaaatgaac aaagaaaaac taggcagttt cgcccagtgg 1500 ttagaagcgt ggagtttgga gtcaagtctc caaatttcat cttccacata tgcaaaatgg 1560 agacaataat aggggtacgt tatagaattg tggtaggcat agtgaactcc atcgcatgtt 1620 agctgttttc gttactattt actgtctaaa ttcggtgatg aaattattag gaagtctctg 1680 tcttgttctc ttctgaccac taagaggcgc acttcggagt agaagaaacg cgggcggaaa 1740 tagcccaaaa gcggattggc ttcgacttct ggcggaagta aattcctccc tccaccaggt 1800 cttattagct cagaaagaat tccaaatttc tacgtagtcc caaggatagg tagaatacat 1860 ttctcagtcc tattcctagt tattattgtc tattaaaaca tgtatactca gaatttttgc 1920 ggcattattt tttgacgtgt ctttatttta tttaaaagag ccggagccgg aagtgcttgc 1980 ctttttccct gctaggaccc aggggttacg acccatcagc ccttgcgcgc caccgtccct 2040 tctctcttcc tcggcgctgc ctacggaggt ggcagccatc tccttctcgg taagtgttaa 2100 tccgtggcaa tccgcattcc tgcgggattc atctggcccc gtcgcccagt ggtgcggagg 2160 cctccccttc agcgcggtag tgtctgtggg tattgttatt gtcagcttac tggagcgtgt 2220 acaggaacag aacgaagccg ccgagttgat agggctttgc gtcccagagc ctcctgccct 2280 ccgcctgtat tcagagctgc gggctgcttg tttgttcctt ggcggtggag ggtgctagtt 2340 gaggccagac ttcggggtct cctgggggcc gtgggacgac caggggtggc ccagcttgac 2400 agctttcagc tgggatctgt ggatcccagc gctcaccaat gtcggcccac gtgtattcgt 2460 tcatgccatg gccggcttct tccgctgcag tctctggccc gagggctgct gctgcgggac 2520 cgccaaggaa agacgagctg taggtcggct ggtccagctg caggcagaaa ttctggtagt 2580 atctctggga atatgaagat gcaactgccc ccaccttgcc ttcgaggata tcatgggcca 2640 gaaggcagag tcgttttgaa tacgtggttc attgagtacc cactctgggc cagttgatgg 2700 ctgcgaagag agcagaaggg gtgctgctgt aggaaatcaa tggctcggaa gaccacactg 2760 aggaaggtgt gagttgatac tggaagatct ccaggtttga ggcatcttca gaggtatatg 2820 gtggttttgt gtgtgttgag ggtgtggtag cgcagcagct ccctagggaa ttagaaggtt 2880 ttattgaaca tttaccctgt gacaggcact gcaggcattc agcgcgcagt gtcatcttca 2940 ttttacaggt gaggaaaaga ctcaggttca agtagatggt caaggccagt actaccggaa 3000 ggaccatctg ggggttcgga cactggtggg gtgggatttg ctgccccttg caaattgaga 3060 gtgtcttggg gtcagttttg atttgctcag ctgttggcat tctttgggct ctgagtgggt 3120 gaggtgaccc ttgacctcct gggatcgcat ctggagagtg cctagtattc tgccagcttc 3180 ggaaagggag ggaaagcaag cctggcagag gcacccattc cattcccagc ttgctccgta 3240 gctggcgatt ggaagacact ctgcgacagt gttcagtccc tgggcaggaa agcctccttc 3300 caggattctt cctcacctgg ggccgcttct tccccaaaag gcatc 3345 〈210〉 3 〈211〉 3337 〈212〉 DNA 〈213〉智人 〈400〉 3 atggtggcac aatcatggtt cactgcagcc tcaaacttct aggctcaagt gatcctccag 60 cctcagcctc ctgagtaggt gggactaaag gtgtgtgcta caacacctgg ctaattaaaa 120 aaaaaaaatt tgtagagatg ggcgtctcgc tatgttgccc aggctgatct ttaactacag 180 gtctcagtga tctttctgta tcagcctccc gaagtgctag gattaacagg catgggccac 240 tgtacctggc tgtctttgaa gtttttaata agattgccat atctctctca agactgatca 300 agaaaaaatg caaatacaaa tttaaagaga gggaaaaata gtattatgga actgggttaa 360 gtaccttaag ggaaaactac aacaatgaga ccactattct tatctacttg ggtgggggaa 420 ggcacggaca gagacgtaaa caacagcata gtgtgccaag ggctcccatc tcctgttctc 480 ttctgctctg caaagtctct cttaaaatat agagaacata ttgcaagtaa atacattcat 540 tagtgcattt attcaaaaac cacatttgtc tctctatgca agcttccatc tcaatgcctg 600 gcacagagac gaaaaggatt tcagaggaca aaaatcaaag gactggaaag gagggaagta 660 gctgatgaca aggtcggggg agaagcagct atttgagagt gagcagaggg aaggatataa 720 ccagagcctt ccatctggtg ttgtgacaaa gatggcagtg atgtgaggct tgatagaatc 780 aataggcctc acagttcaag acagactaca tgccctcagt cacttgcctg ctttcttggt 840 ttgctagatg gattagaaat actagaagga aagttgagtg ggtactggga tatcctatcc 900 aaatcctctc ttctggggca atgcagctgc ctcacagcaa ccacgttgtg gatcacctga 960 ccccgccttt ctcagcttcc tggaggtgca ttctaagagc gctccccata agccaacact 1020 caagtctctt cgaggtgtgt ttccagggag cctgatctaa gattaaaaac ttaaaggccc 1080 cttttagaat tgtcttttac agcccaggca aagagttctt tactttttta gaggtcatga 1140 atccctttga caaggtgatg aaagccaggg accctcttct cagaaaaata cacacgtgcg 1200 cttaatgtaa aattttacat actgttttaa aggttaaact ttaccaccca tgaaaagcct 1260 caagtagttc tttgtacata atcataagat tagcaaccat ttactgagca cttcctctct 1320 ataagaccct gtgctaagtg ctttaacttc ataatgcctt tgatcatgac ataacatggc 1380 acggtagttc ctaatatctt ccttttagag atttaagggc ttgctcaaag taacatagct 1440 aataattagc agacactgga ttaaaatccc aatttgtttg taaagcttgt gctctgaata 1500 aatgacaagg aaagagaagg gaaggttgaa gaagggaagg ttcttgaagg tccctggtcc 1560 ttgaaggtcc cttaaccata aatgtcaaga gttgggattt aaacccaggt ctaacgccag 1620 agctggcgcc ctttagatta 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tggggtggag 600 gggggtggta tggagcaagg ggcaagttgg gaagacaacc tgtagggcct gcggggtcta 660 ttgggaacca agctggagtg cagtggcaca atcttggctc actgcaatct ccgcctcctg 720 ggttcaagcg attctcctgc ctcagcctcc cgagttgttg ggattccagg catgcatgac 780 caggctcacc taatttttgt ttttttggta gagacggggt ttcaccatat tggccaggct 840 ggtctccaac tcctaatctc aggtgatcta cccaccttgg cctcccaaat tgctgggatt 900 acaggcgtga accactgctc cacgcgccct gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg 960 tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt 1020 tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc 1080 tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga ccccaaaaaa cttgattagg 1140 gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg 1200 agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt tccaaactgg aacaacactc aaccctatct 1260 cggtctattc ttttgattta taagggattt tgccgatttc ggcctattgg ttaaaaaatg 1320 agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg aatgtgtgtc agttagggtg 1380 tggaaagtcc ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc 1440 agcaaccagg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc agaagtatgc aaagcatgca 1500 tctcaattag tcagcaacca tagtcccgcc cctaactccg cccatcccgc ccctaactcc 1560 gcccagttcc gcccattctc cgccccatgg ctgactaatt ttttttattt atgcagaggc 1620 cgaggccgcc tctgcctctg agctattcca gaagtagtga ggaggctttt ttggaggcct 1680 aggcttttgc aaaaagctcc cggg 1704 <210> 16 〈211〉 1120 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 <220> 〈223>人IgGl信号+人IgGl恒定区 <400> 16 tgctagcgcc accatgaaac acctgtggtt cttcctcctg ctggtggcag ctcccagatg 60 ggtgctgagc caggtgcaat tgtgcaggcg gttagctcag cctccaccaa gggcccaagc 120 gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc acctctggcg gcacagccgc cctgggctgc 180 ctggtcaagg actacttccc cgaacccgtg accgtgagct ggaactcagg cgccctgacc 240 agcggcgtgc acaccttccc cgctgtcctg cagtcctcag gactctactc cctcagcagc 300 gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac 360 aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga gttgagccca aatcttgtga caaaactcac 420 acatgcccac cctgcccagc acctgaactc ctggggggac cctcagtctt cctcttcccc 480 ccaaaaccca aggacaccct catgatctcc cggacccctg aggtcacatg cgtggtggtg 540 gacgtgagcc acgaagaccc tgaggtcaag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 600 cataatgcca agacaaagcc ccgggaggag cagtacaaca gcacgtaccg ggtggtcagc 660 gtcctcaccg tcctgcacca ggactggctg aatggcaagg agtacaagtg caaggtctcc 720 aacaaagccc tcccagcccc catcgagaaa accatctcca aagccaaagg ccagccccgg 780 gaaccacagg tgtacaccct gcccccatcc cgggaggaga tgaccaagaa ccaggtcagc 840 ctgacctgcc tggtcaaagg cttctatccc agcgacatcg ccgtggagtg ggagagcaat 900 ggccagcccg agaacaacta caagaccacc cctcccgtgc tggactccga cggctccttc 960 ttcctctaca gcaagctcac cgtggacaag agcaggtggc agcagggcaa cgtcttctca 1020 tgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacaccc agaagagcct ctccctgtct 1080
【权利要求】
1. 多核苷酸，其包含由序列表中SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
2. 多核苷酸，其包含由序列表中SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
3. 多核苷酸，其包含由序列表中SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
4. 多核苷酸，其包含与根据权利要求1至3任一项的多核苷酸的核苷酸序列具有95% 或更高同一性的核苷酸序列并具有启动子活性。
5. 多核苷酸，其包含与根据权利要求1至3任一项的多核苷酸的核苷酸序列具有99% 或更高同一性的核苷酸序列并具有启动子活性。
6. 多核苷酸，其在严格条件下与包含与根据权利要求1至3任一项的多核苷酸的核苷 酸序列互补的核苷酸序列的多核苷酸杂交，并具有启动子活性。
7. 外源基因表达单元，其包含根据权利要求1至6任一项的多核苷酸。
8. 根据权利要求7的外源基因表达单元，其中所述外源基因是编码多聚体蛋白的基 因。
9. 根据权利要求7的外源基因表达单元，其中所述外源基因是编码异源多聚体蛋白的 基因。
10. 根据权利要求7的外源基因表达单元，其中所述外源基因是编码抗体或其功能片 段的基因。
11. 外源基因表达载体，其包含根据权利要求7至10任一项的外源基因表达单元。
12. 外源基因表达载体，其包含根据权利要求7至10任一项的外源基因表达单元和一 种或多种选自下列组A中（1)至（9)所述的多核苷酸： 组A (1) 包含由序列表中SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列的多核苷酸； (2) 包含由序列表中SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列的多核苷酸； (3) 包含由序列表中SEQ ID NO: 12所示的核苷酸序列的多核苷酸； (4) 包含由序列表中SEQ ID NO: 13所示的核苷酸序列的多核苷酸； (5) 包含由序列表中SEQ ID NO: 14所不的核苷酸序列的多核苷酸； (6) 包含由序列表中SEQ ID NO: 10至14任一所表示的核苷酸序列的至少3000个连续 核苷酸的多核苷酸； (7) 包含由序列表中SEQ ID NO: 10至14任一所表示的核苷酸序列的至少2000个连续 核苷酸的多核苷酸； (8) 包含与根据上述（1)至（7)任一项的多核苷酸的核苷酸序列具有95%或更高同一 性的多核苷酸序列并具有增强外源基因表达的活性的多核苷酸；和 (9) 包含与根据上述（1)至（7)任一项的多核苷酸的核苷酸序列具有99%或更高同一 性的核苷酸序列并具有增强外源基因表达的活性的多核苷酸。
13. 转化的细胞，其已经导入根据权利要求11或12的外源基因表达载体。
14. 转化的细胞，其已经导入根据权利要求11或12的外源基因表达载体和元件载体。
15. 根据权利要求13或14的转化的细胞，其中所述细胞是衍生自哺乳动物的培养的细 胞。
16. 根据权利要求15的转化的细胞，其中所述衍生自哺乳动物的培养的细胞是C0S-1 细胞、293细胞或CH0细胞。
17. 生产蛋白的方法，其特征在于包括培养根据权利要求13至16任一项的转化的细胞 并从所得的培养产物中获得衍生自外源基因的蛋白。
18. 根据权利要求1至6任一项的多核苷酸用于在转化细胞中表达外源基因的用途。
19. 根据权利要求11至12的外源基因表达载体用于在转化的细胞中表达外源基因的 用途。
【文档编号】C12N15/09GK104066839SQ201280068236
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2012年11月27日 优先权日:2011年11月28日
【发明者】村上贤二 申请人:第一三共株式会社