使用特异性和选择性电场与电磁场调节干细胞基因生产的制作方法
【专利摘要】本发明描述的方法和装置用于通过对骨细胞或含干细胞的其他组织是特异性和选择性的电场和/或电磁场的电容耦合或电感耦合，调节干细胞中BMP2和4，TGF-β1、2和3，FGF-2，骨钙素和碱性磷酸酶mRNA，其中通过向相对于干细胞布置的电极或一个或多个线圈或其他场生成装置施加特异性和选择性信号，生成所述特异性和选择性的场，使得便于治疗患病或受伤的骨和其他组织。
【专利说明】使用特异性和选择性电场与电磁场调节干细胞基因生产
[0001] 对相关申请的交叉引用
[0002] 本专利申请是2011年9月23日提交的美国专利申请号13/242, 606的部分延续 案，所述美国专利申请是2008年7月3日提交的美国专利申请号12/167, 283 (现为美国专 利8, 065, 015)的延续，美国专利申请号12/167, 283是2002年10月8日提交的美国专利申 请号10/257, 126 (现为美国专利7, 465, 566)的延续，美国专利申请号10/257, 126是2001 年2月23日提交的PCT/US01/05991的美国国家阶段，其要求于2000年2月23日提交的 美国临时申请号60/184, 491的优先权。这些申请的内容通过引用以其整体并入本文。 发明领域
[0003] 本发明涉及通过施加适当的电场或电磁场而上调干细胞中可被诱导以调节骨和 软骨生长和修复的那些基因的表达的方法。所述基因包括骨形态发生基因 （特别是BMP 2 和4)、转化生长因子β基因（TGF-β1、2和3)、成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2)，以及控制 活的干细胞中碱性磷酸酶和骨钙素表达的基因。通过将特异性和选择性的电信号和电磁信 号施加到线圈、电极或其他的场产生装置而生成电场和电磁场，将所述场施加到受伤或患 病的骨、软骨和其它组织以进行治疗。
【背景技术】
[0004] 虽然近来有大量关于某些组织和细胞的生长和修复的相互作用及活性的研究，却 很少或几乎没有对电场和/或电磁场对干细胞的影响及这种被刺激的细胞可能对骨、软骨 和其它组织的生长和修复的作用的研究。这样的研究可能在开发对各种医疗问题的新的治 疗上有用。
[0005] BMP家族的基因包括那些在促进骨形成和维持、从前成骨细胞的增殖、到前成骨细 胞向成熟的成骨细胞的分化、以及对成骨细胞在其整个寿命中的维持中重要的生长因子。 转化生长因子（TGF-β 1、2和3)控制许多细胞功能，包括生长、增殖和分化。成纤维细胞生 长因子（FGF-2)已被证明对正常无伤的动物中的骨形成具有积极的同化作用，并在骨质疏 松症实验模型中减少骨质流失。FGF-2(也称为碱性成纤维细胞生长因子或bFGF)刺激骨形 成，减少破骨细胞的表面，并且在骨的骨髓腔中诱导新的骨针。
[0006] 因此，上调以上所讨论的基因将在治疗通常被称为骨质疏松症、其中骨去矿物质 且变得异常稀薄的疾病的治疗中有用。在骨质疏松症中，骨吸收超过骨形成，从而导致骨弱 化和可能的椎体骨折和塌陷。虽然骨质疏松症通常被认为只折磨老人，然而某些类型的骨 质疏松症可能会影响骨骼没有经受机能性应力的各年龄段的人。在这些情况下，患者在长 时间的固定不活动期间可能会经历密质骨和松质骨的严重损失。已知老年患者在骨折后固 定时因废用而出现骨质流失，而这种骨质流失可能最终导致在已经骨质疏松的骨架上发生 继发性骨折。骨密度降低不仅可能导致椎骨塌陷，而且会导致臀部、下臂、手腕、脚踝骨折， 以及失能的痛苦。需要有可选择的非手术疗法以在这些疾病中诱导骨形成。
[0007] 自从1979年由美国食品和药物管理局批准后，脉冲电磁场（PEMF)和电容耦合 (CO已被广泛用于治疗不愈性骨折（骨折不愈合）以及相关的骨愈合中的问题。对于这种 形式的疗法的试验的原始基础是观察到了对骨骼的物理应力引起微小电流的出现，其与机 械应变一起被认为构成了将物理应力转化成促进骨形成的信号的机制。连同成功用于骨折 不愈合的治疗的直接电场刺激，还发现使用PEMF和电容耦合（其中电极被放置在治疗区域 的皮肤上）的非侵入性技术也是有效的。PEMF在高导电性的细胞外液中产生小的、感应电 流（法拉第电流），而电容耦合直接导致在组织中的电流；PEMF和CC二者从而模拟了内源 性电流。
[0008] 该内源性电流，最初被认为是由于在骨中晶体的表面上发生的现象，已被证明是 主要由于在含有具有固定负电荷的有机成分的骨的通道中含电解质的流体的移动，产生了 所谓的"流动电位"。骨中电现象的研究表明，当骨被机械压缩时出现机电转换机制，引起流 体和电解质在骨细胞表面上的固定负电荷的表面上的移动，从而产生流动电位。这些电位 在骨中起到一定的用途，而且，与机械应变一起，导致能够刺激骨细胞合成可钙化基体以及 由此骨生成的信号转导。
[0009] 由本发明人和其他人于1996年报道，在Cooper培养皿中培养的MC3T3-E1骨细 胞中，循环双轴0.17 (%机械应变导致了6?-@11111?嫩的显著增长（131^111:〇11等人，13;[0(3116111· Biophys. Res. Commun. 229 :449-453,1996)。1997 年一些重要研究随后出现。据报道在一 项研究中，相同的循环双轴0. 17%机械应变在相似的骨细胞中使得TOGF-A mRNA显著增 加 （Brighton 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 43 :339_346,1997)。另据报道，20mV/ cm的60kHz的电容耦合电场在Cooper培养皿中类似的骨细胞中产生TGF-P1的显著增 加 （Brighton 等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. 237 :225_229,1997)。另据报道，软骨 细胞基质基因和蛋白可被特异性和选择性的电场所上调（Wang，W.，Wang，Z.，Zhang，G.， Clark, C. C. , and Brighton, C. T. , Clin. Orthp. and Related Res. ,427S：S 163-173,2004； Brighton, C. T. , Wang, ff. , and Clark, CC, Biochem. Biophys. Res. Commun. , 342 :556-561, 2006)。此外，已经显示骨形态发生蛋白（BMP)的基因表达也可以被特异性和选择性的电场 上调，所述电场在很多信号方面不同于其信号对关节软骨是选择性和特异性的电场（Wang， Z. , Clark, C. C. and Brighton, C. T. , J. Bone Joint Surg. ,88 :1053-1065,2006) 0
[0010] 在本发明人的美国专利7, 465, 566中，公开了用于创建调节患病或受伤组织的靶 基因的场的、特异性和选择性电和电磁信号的确定方法。本发明通过描述调节骨髓干细胞 的靶基因表达的方法，建立在前述专利中描述的技术的基础上。这些基因属于BMP超家族， 并且包括BMP2和4，FGF-2和TGF-β 1、2、3,碱性磷酸酶和骨钙素。描述了通过施加由特异 性和选择性的电和电磁信号生成的场，治疗骨疾病和损伤，包括骨质疏松症、骨质减少、骨 坏死、骨缺损、新鲜骨折、有风险骨折、延迟愈合、骨折不愈合，以及作为脊柱融合的辅助。
【发明内容】
[0011] 本发明涉及通过应用向邻近目标的骨或组织细胞的线圈、电极或其他场生成装置 施加特异性和选择性的信号而生成的特异性和选择性的电场和/或电磁场，调节BMP超家 族的基因表达，所述BMP超家族包括但不限于，干细胞（作为实例）中的BMP 2和4，TGFi3 1、 2和3,及成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2)、碱性磷酸酶和骨钙素。通过对在其中测量到生成 的电场的效果的信号持续时间、振幅、频率和占空比执行连续的剂量-响应曲线，发现了上 调干细胞中mRNA的最佳信号。所述最佳信号生成了振幅20-40毫伏/厘米、持续时间12 小时、频率60千赫和占空比50-100%的电容耦合电场。特别地，本发明涉及通过施加这些 信号产生的场而上调干细胞中的基因表达。
[0012] 在本发明的一个不例性实施方式中，提供了用电容稱合的电场、电磁场或混合场 而特异且选择性地上调上述干细胞的基因表达（通过mRNA测定）的方法。以具有约12小 时的场持续时间、60千赫的频率、50% -100%的占空比以及正弦波构型的约10-40毫伏/ 厘米的电容耦合电场对下述进行处理：骨质疏松症、骨质减少、骨坏死、新鲜骨折、有风险骨 折、延迟愈合、骨折不愈合、骨缺损、在脊柱融合中作为辅助等，所述电容耦合电场引起待上 调的BMP 2和4，FGF-2和TGFii 1、2和3的表达。根据本发明的方法，"特异性和选择性"的 信号是具有预定的振幅、持续时间、占空比、频率和波形特征的信号，其能上调BMP超家族 基因的表达（特异性）。这使得人们可以选择不同的信号来上调BMP超家族的基因的表达， 以实现给定的生物学或治疗的响应（选择性）。本发明还涉及使用本文所描述的方法以产 生特异性和选择性的信号，生成电场和/或电磁场来上调BMP超家族基因的表达的装置。
[0013] 在相关的方面，本发明涉及用于治疗骨质疏松症、骨质减少、骨坏死、新鲜骨折、有 风险骨折、延迟愈合、骨折不愈合、骨缺损，作为脊柱融合中的辅助和用于处理一个或多个 上述状况的其他疗法的方法和装置。本发明的方法中还包括通过有条理地改变已知会增 力口、或怀疑会增加所述目标基因的细胞生产的起始信号的持续时间，用于确定用于BMP 2 和4, TGFii _1、2和3及FGF-2的基因表达的"特异性和选择性"信号的方法学。在找到最 佳持续时间之后，对于通过上述基因的基因表达确定的最佳持续时间，改变该信号的振幅。 占空比、频率和波形都以相同的剂量响应方式有条理地改变，同时保持其他信号特征恒定。 重复这个过程，直到确定了产生BMP 2和4, TGFii _1、2和3, FGF-2,碱性磷酸酶，骨钙素表 达的最大增加的最佳信号。对于每个所述的基因来说，最佳信号可能在基因与基因之间有 所不同。
[0014] 本发明的这些和其它方面将在本发明的以下详细描述中得到阐述。
【专利附图】
【附图说明】
[0015] 根据本发明的详细描述并结合附图，本发明将是显然的，其中：
[0016] 图1是当干细胞被暴露于各种电容耦合电场振幅下，BMP 2和4, TGF 1、2和3， FGF-2,碱性磷酸酶和骨钙素的mRNA表达的散点图示。如图所示，各种mRNA的最大表达出 现在从10mV/cm到60mV/cm的信号范围内。
[0017] 图2是当干细胞被暴露于振幅为20mV/cm的电容耦合电场下持续各种时间时，BMP 2和4，TGF 1、2和3，FGF-2,碱性磷酸酶和骨钙素的mRNA表达的散点图示。如图所示，各种 mRNA的最大表达出现在12小时的信号持续时间时。
[0018] 图3是在20mV/cm的电场振幅和12小时的信号持续时间下当干细胞被暴露于各 种电容耦合电场频率时，BMP 2和4, TGF 1、2和3, FGF-2,碱性磷酸酶和骨钙素的mRNA表 达的散点图示。如图所示，各种mRNA的最大表达出现在60kHz的频率下。
[0019] 图4是在60kHz的频率、20mV/cm的电场振幅和12小时的信号持续时间下当干细 胞被暴露于各种电容耦合电场占空比时，BMP 2和4, TGF1、2和3, FGF-2,碱性磷酸酶和骨 钙素的mRNA表达的散点图示。如图所示，各种mRNA的最大表达出现在具有正弦波构型的 50%至100%的占空比下。
[0020] 图5是示出了一种例如根据本发明的示例性应用用于治疗脊柱骨质疏松症的装 置的图。
[0021] 说明性实施方式的详细描述
[0022] 本发明将在下面参考图1-5详细说明。本领域技术人员将理解，这里所给出的那 些附图的描述仅用于示例的目的，并不旨在以任何方式限制本发明的范围。所有关于本发 明的范围的问题，可以通过参考权利要求书来解决。
[0023] 本发明是基于这样的发现，即通过施加由特异性和选择性的电和/或电磁信号生 成的场，可以调节某些干细胞基因的表达，所述电和/或电磁信号被施加至邻近所述基因 的线圈、电极或其他的场生成装置。换句话说，本发明人发现，存在特异性的电和/或电磁 信号，其生成用于调节骨、软骨和其它组织中干细胞中的基因的场，并且这些特异性的信号 能够特异性和选择性地调节这些细胞中的基因。特别地，根据本发明，通过应用向场生成装 置施加特异性和选择性的电和/或电磁信号而生成的场，可调节掌管组织或细胞的生长、 维持、修复和变性或恶化的基因表达，从而产生有益的临床效果。这些发现可用于开发治疗 方法，所述治疗方法针对某些医疗状况，包括骨质疏松症、骨质减少、骨坏死、新鲜骨折、有 风险骨折、延迟愈合、骨折不愈合、骨缺损、脊柱融合，以及作为以上任意一种或多种状况的 治疗中的辅助。
[0024] 如本文所用，术语"信号"用于指代各种信号，包括装置输出的机械信号、超声信 号、电磁信号和电信号。应当理解的是，本文所用的术语"场"是指靶定组织内的电场，不管 它是混合场或脉冲电磁场还是通过直流电、电容耦合或电感耦合产生的场。
[0025] 术语"远程"用来意味着从一定的距离外起作用、接受作用或控制。"远程"调节指 的是从一定的距离外控制基因的表达。"远程地"提供指的是从一定的距离外提供。例如， 从远程源提供特异性和选择性信号，可以指从距离组织或细胞有一定距离的源或从身体外 部或身体以外的源提供信号。
[0026] 术语"特异性和选择性"信号是指产生了具有预定的振幅、持续时间、占空比、频率 和波形特征的电场从而上调或下调靶基因或功能互补的靶基因（特异性）的信号。这允许 人们选择不同的"特异性和选择性"信号以上调或下调各种基因的表达从而实现给定的生 物学或治疗响应（选择性）。
[0027] 所用的术语"调节"是指控制基因的表达。调节被理解为包括上调和下调两者。上 调指提商基因的表达，而下调指抑制或阻止基因的表达。
[0028] "功能互补"是指在给定的细胞或基因中表达是互补的或协同的两种或更多种基 因。
[0029] "组织"是指与细胞的胞外物质一起形成患者结构材料中的一种的所述细胞的聚 集体。如本文所使用的，术语"组织"旨在包括身体的任何组织，包括肌肉和器官组织、肿瘤 组织以及骨或软骨组织。此外，如本文所用的术语"组织"还可以指单个细胞。
[0030] "患者"是指动物，优选为哺乳动物，更优选人。
[0031] 本发明提供了靶向某些组织、细胞或疾病的治疗方法和装置。特别地，在受伤或患 病组织或细胞中，与修复过程相关的基因表达可以通过施加由特异性和选择性针对靶组织 或细胞中待调节基因的电信号所生成的场而进行调节。可以通过施加对于每种基因或每 组互补基因来说特异性和选择性的信号而上调或下调基因的表达，从而产生有益的临床效 果。例如，特定的特异性和选择性信号产生的电场可以上调某种期望的基因的表达，而同一 种或另一种特定的特异性和选择性信号可以产生电场下调某种不希望的基因的表达。某种 基因可以被一种特定的特异性和选择性信号所产生的场上调，并被另一种特异性和选择性 信号所产生的场下调。本领域技术人员将理解，某些患病或受伤的组织可以通过调节那些 掌管所述组织的生长、维持、修复和变性或退化的基因而被靶向进行治疗。
[0032] 本发明的方法和装置基于的是，鉴定那些生成了对于与某些靶定的患病或受伤组 织相关的基因表达来说特异性和选择性的场的信号。例如，通过改变施加到场生成装置的 信号的频率、振幅、波形或占空比从而生成对于每种选择的基因或者基因家族的施加场，使 得以各种形式施加的电场（例如电容耦合、电感耦合或混合场）能够特异性和选择性地调 节患者身体中靶定组织或细胞中的基因表达。暴露于电场的持续时间也可以影响电场特异 性和选择性地调节在患者体内的靶定组织或细胞中的基因表达的能力。特异性和选择性信 号可以系统性地产生施加到每个基因的电场，直到发现提供了关于基因表达所需的效果的 频率、振幅、波形、占空比和持续时间的适当组合。
[0033] 应当理解的是，可以有针对性的对各种患病或受伤组织或疾病状态进行治疗，因 为用于某些基因表达的电场的特异性和选择性可以被几个因素影响。特别地，由具有合适 的频率、振幅、波形和/或占空比的电信号生成的电场对某些基因的表达可以是特异性和 选择性的，从而提供针对性的治疗。时间的因素（例如，暴露于电场的持续时间）也能影响 电场对特定基因的表达的特异性和选择性。通过施加特定的持续时间的电场，基因表达的 调节可能更为有效（或成为可能）。因此，本领域的技术人员将理解的是，本发明提供了改 变产生电场的电信号的频率、振幅、波形、占空比和/或施加的持续时间，直到发现所述电 场对某些基因的表达是选择性和特异性的，从而提供针对多种患病或受伤组织或疾病的治 疗。
[0034] 因此，本发明可以提供有针对性的治疗，因为有可能通过施加由具有适当的频率、 振幅、波形和/或占空比的特异性和选择性信号产生的电场适当的持续时间，从而调节与 特定的患病或受伤组织相关的某些基因的表达。产生电场的信号的特异性和选择性因此 可能被影响，以便调节某些基因的表达，从而针对某些患病或受伤组织或疾病状态进行治 疗。特别地，本发明提供了对于骨质疏松症、骨质减少、骨坏死、新鲜骨折、有风险骨折、骨折 不愈合、骨缺损、脊柱融合，以及作为以上任意一种或多种病症的治疗中的辅助的针对性治 疗。
[0035] 本发明的装置能够施加特异性和选择性的信号到场生成装置，从而产生特异性和 选择性的场，其被直接施加于患者的患病或受伤组织和/或皮肤上。本发明的装置也可提 供特异性和选择性场的远程应用（例如，在离患病或受伤组织一定距离处施加场，不过所 述场仍然在靶细胞内产生所需的效果），但是需要理解电容耦合装置必须接触受试者的皮 肤。在电容耦合的情况下，本发明的装置可包括将电极贴附至患者身体靠近受伤或患病组 织的器件。例如，自粘接导电电极可以附着到在患者的骨折骨骼两侧的皮肤上。如图5所 示，本发明的装置可包括自粘接电极，其可将所述装置贴附至患者的身体上。例如，本发明 的装置可包括电极，其贴附到在反面具有VELCRO?贴的电源单元，使得所述电源单元可 以贴附到适合绕在患者上的石膏周围的VELCRO?带（未示出）上。在电感耦合的情况 下，本发明的装置可包括取代电极的、贴附至电源单元上的线圈或其他场生成装置。自粘接 带状电极也可以被贴附到患者的背部，使一对电极的每一个电极都平行于脊柱，该对电极 中的一个电极纵向放置在脊柱的一侧，该对电极的另一电极纵向放置在脊柱的对面。在这 种情况下，VELCRO?贴可以是患者所穿着的衣服的一部分。
[0036] 本发明的装置可以采用各种方式应用。所述装置可以是便携式的，也可以暂时或 永久地贴附至患者的身体。本发明的装置优选是非侵入性的。例如，可以通过应用适于与患 者皮肤接触的电极而施加由预定的特异性和选择性的电信号所产生的电场，从而使本发明 的装置应用到患者的皮肤上。这样的信号也可通过其中流有时变电流的线圈而进行施加， 从而产生特异性和选择性的电磁场，其能穿透组织并在靶组织中产生特异性和选择性的电 场。例如，线圈可如美国专利号7158835描述的被结合到患者的衣物并置于患者的脊柱和 /或臀部附近。本发明的装置也可以是能够植入到患者中的，包括植入在患者的皮肤下。
[0037] 本领域的技术人员将进一步了解，本发明的场生成装置可以以各种形式提供，包 括：具有用于施加到一对或多对电极的程序化、多种、可切换、特异性和选择性的信号的电 容偶联电源单元，与具有可切换、多种、特异性和选择性信号的电源单元附连的电磁线圈或 螺线管，以及具有用于产生特异性和选择性信号电源供应的超声刺激器。一般来说，场生成 装置的倾向性基于的是患者的接受性和患者依从性。在本领域中当前可用的最小和最便携 单元是电容耦合单元；然而，具有极为敏感的皮肤的患者可能更喜欢使用电感耦合单元。另 一方面，超声单元需要最多的患者合作，但可能是某些患者需要使用的。 实施例
[0038] 本发明是通过下面的例子详细说明，这是为了说明的目的，并无意限制本发明的 范围。
[0039] 材料和方法
[0040] 人类干细胞（5X IO5细胞/cm 2)被放置于专门改良的Cooper培养皿上。在实验 条件快要开始前更换培养基，使细胞生长十天。在第10天，这些研究中的实验细胞培养物 用输出为44. 81V峰-到-峰、电容耦合的60kHz正弦波信号处理。这在培养皿中的培养基 中生成了 20mV/cm、电流密度300 μ A/em2的计算场强。对照细胞培养皿除了电极未连接到 函数发生器外，其他与被刺激的培养皿均相同。
[0041] 在实验结束时，根据制造商的指示使用TRIzol分离总RNA，并使用Superscript II逆转录酶进行逆转录（RT)。从公布的cDNA序列中选择或使用Primer Express软件程 序设计在实时RT-PCR技术中使用的寡核苷酸引物。使用ABI Prism? 7000序列检测系统 对RT-PCR产物进行定量实时分析。
[0042] 如下所述，系统地发现了用于目标基因，包括BMP2和4、TGF-P 1、2和3、FGF-2、碱 性磷酸酶和骨钙素的所需上调的最佳信号。采用已知会导致产生能增加（或者甚至只是怀 疑会增加）给定蛋白的细胞生产的电场的电信号作为起始信号，用于确定在靶组织中生成 所述电场用于该蛋白的基因表达（mRNA)的特异性信号。首先通过在保持所有其他信号特 征恒定（持续时间，占空比和频率）的同时改变信号的振幅，来执行剂量-响应曲线（图1)。 这确定了用于该蛋白的基因表达的起始信号的最佳振幅。然后执行第二剂量-响应曲线， 这次改变电场在靶组织中的持续时间（以mV/cm)，同时保持最佳的振幅和其他信号特征恒 定（图2)。执行第三剂量-响应，这次在保持之前发现的最佳振幅和最佳持续时间恒定的 同时，改变信号的频率（图3)。执行第四剂量-响应，在保持之前发现的最佳振幅、持续时 间以及频率恒定的同时，从100% (恒定的）到10%或更低改变占空比（图4)。通过这种 方法，确定了用于在BMP 2和4, TGF-β 1、2和3，FGF-2,碱性磷酸酶和骨钙素的基因表达中 产生最大增加的最佳信号。
[0043] 图1显示培养10天后人类干细胞响应的散点图，示出了刺激振幅对8个目标基 因 （BMP 2和4, TGF- β 1、2及3, FGF-2,碱性磷酸酶，和骨钙素）的mRNA表达的作用。在 20mV/cm时，所述基因中的7个的mRNA表达趋同，这不存在于其他振幅水平下。还进一步注 意到，所选择的基因可以给出特异性的响应。例如，对于TGF-β 3的最佳振幅发生在IOmV/ cm，BMP-4则发生在60mV/cm，等等。干细胞在60ΚΗζ频率、50%的占空比下被刺激12小时。
[0044] 图2显示培养10天后人类干细胞响应的散点图，示出了刺激持续时间对8个目标 基因 （BMP 2和4，TGF-M、2及3，FGF-2,碱性磷酸酶，和骨钙素）的mRNA表达的作用。用 60KHz频率、50%占空比和20mV/cm振幅的信号刺激干细胞2-24小时。注意到在12小时刺 激后，存在所述8个基因的表达的趋同，这不存在于其他测试的持续时间。此外，如图1所 示，所选择的基因在除12小时刺激外的特定的小时处有最佳响应。
[0045] 图3显示培养10天后人类干细胞响应的散点图，示出了刺激的频率对8个目标基 因 （BMP 2和4, TGF- β 1、2及3, FGF-2,碱性磷酸酶，和骨钙素）的mRNA表达的作用。在 50%占空比和20mV/cm的振幅下用各种信号频率刺激干细胞。注意到在刺激12小时后在 60kHz的频率下得到8个基因的最佳表达。
[0046] 图4显示培养10天后人类干细胞响应的散点图，示出了刺激的占空比对8个目标 基因 （BMP 2和4，TGF-M、2及3，FGF-2,碱性磷酸酶，和骨钙素）的mRNA表达的作用。占 空比是12. 5% (1分钟开/7分钟关）、25% (1分钟开/3分钟关）、50% (1分钟开/1分钟 关）、75% (1分钟开/20秒关），以及100% (信号一直开）。注意到50%、75%和100%得 到几乎相同的结果。选择50%的占空比是因为它需要较少的能量，并且因此使电池寿命更 长。
[0047] 图5显示用电容耦合装置对病人进行骨质疏松症治疗。在布口袋中的电源组 (130)被穿戴，所述布口袋用布带固定在腰部，或可以滑入病人衣物的任何口袋。元件 110a、b和120a、b显示了表面导电布电极，其用导电凝胶粘在患者背部，位于Ll到L5 7jC平 处的腰椎任一侧。电源单元提供了根据本发明的优化的信号，例如，60KHz频率、50%占空 比和每天持续12小时的20mV/cm的正弦波信号。这是用于刺激指定腰椎内干细胞以上调 8个目标基因 （BMP 2和4，TGF-M、2及3，FGF-2,碱性磷酸酶，和骨钙素）的mRNA表达的 最佳信号。
[0048] 本发明清楚地显示，在实施例中所述的最佳电场（10mV/cm-60mV/cm，优选20mV/ cm，12小时持续时间，60kHz频率，以及50-100 %占空比）可以显著上调BMP 2和4， TGF-β 1、2及3, FGF-2,碱性磷酸酶和骨钙素基因的表达，并因此增加在骨质疏松症、骨质 减少、骨坏死、骨骨折、有风险骨折、骨折不愈合、骨缺损、脊柱融合中的骨形成，以及作为以 上任意一种或多种治疗中的辅助。另外，图1-4清楚地显示，在四个剂量-响应研究的每一 个中，各种基因的响应之间存在差异。本领域技术人员将理解，如本文使用电容耦合所描述 的适当的电场，也与电感耦合及生成等效或几乎等效的电场特征的所有电磁系统是相同有 效的。本领域技术人员还将会理解，更独特的信号特征可以通过更多的实验来和更多的数 据点发现（例如，100±3%的占空比，持续30±3分钟），但每一个信号特征的这样相对较小 的变化被认为是在本文给出的教导下处于本领域技术人员的水平之内的。
[0049] 本领域技术人员也将认识到，对本发明的许多其他改进可能在本发明的范围之 内。例如，本文所描述的最佳场可以通过成对或成条状、结合在托架、包或石膏中的两个或 更多个合适的表面电极施加到任何骨骼，并通过电容耦合的方式递送。此外，这里所描述的 最佳电场可以通过结合在托架、包或石膏中的线圈或螺线管被施加到任何骨骼，并通过电 感耦合的方式递送。因此，本发明的范围并非限定于上述的优选实施例，而是仅由权利要求 书限定。
【权利要求】
1. 一种装置，其用于治疗骨质疏松症、骨质减少、骨坏死、新鲜骨折、有风险骨折、骨折 不愈合、骨缺损、脊柱融合，以及作为骨质疏松症、骨质减少、骨坏死、新鲜骨折、有风险骨 折、骨折不愈合、骨缺损、脊柱融合治疗的辅助，通过靶组织中的人类干细胞提高骨形成，和 /或用于在患者中涉及通过mRNA和蛋白所测量的BMP2和4, TGF-0 1、2和3, FGF-2,骨钙素 和碱性磷酸酶的其他病症， 所述装置包括： 生成具有约60kHz的频率的至少一种特异性和选择性信号的信号源，所述信号源控 制和改变所述至少一种特异性和选择性信号的施加持续时间，每24小时时段提供约12小 时的持续时间，并且所述信号源在50%到100%之间改变所述特异性和选择性信号的占空 比；和 一个或多个场生成装置，其连接到所述信号源以便接收所述至少一种特异性和选择性 信号并且被可操作地相对于靶组织布置，所述一个或多个场生成装置在接收到所述至少一 种特异性和选择性的信号后，导致在所述靶组织中生成振幅约10到60mV/cm的特异性和选 择性的电场和/或电磁场，当所述场被施加到含BMP2和4, TGF- 0 1、2和3, FGF-2,骨钙素和 碱性磷酸酶的靶组织时，所述场特异性和选择性地上调BMP2和4, TGF-0 1、2和3, FGF-2， 骨钙素和碱性磷酸酶的基因表达，和/或上调通过mRNA测量的靶组织中的蛋白。
2. 根据权利要求1的装置，其进一步包括驱动所述信号源的便携式电源单元。
3. 根据权利要求1的装置，其进一步包括将所述一个或多个场生成装置贴附至患者身 体靠近靶定骨组织的器件。
4. 根据权利要求1的装置，其进一步包括将所述信号源贴附至患者身体的器件。
5. 根据权利要求1的装置，其中通过将所述至少一种特异性和选择性信号施加到所述 一个或多个场生成装置上而生成的场，通过电容耦合或电感耦合被施加到所述靶组织上。
6. 根据权利要求1的装置，其中所述特异性和选择性的信号具有正弦波构型。
7. 根据权利要求1的装置，其中所述靶组织中的特异性和选择性的场具有约为20mV/ cm的振幅。
【文档编号】C12N13/00GK104350150SQ201280067937
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2012年11月21日 优先权日:2011年11月23日
【发明者】卡尔·T·布莱顿 申请人:宾夕法尼亚大学理事会