专利名称：一种成体干细胞的组织分解、细胞黏附与萃取及培养技术的制作方法
一种成体干细胞的组织分解、细胞黏附与萃取及培养技术技术领域
本发明有关于制造一种生物制剂，藉由同时剥离切碎、分解消化及筛网过滤胎盘特定部位组织，经特定物质黏附及无血清培养萃取有效筛选大量成体干细胞的技术。
背景技术：
迄今，间叶干细胞已由各国著名专家经临床测试证实是一种有价值的干细胞，其具备有抑制免疫力、帮助修复组织与弥补造血功能等功能，此外亦有专家公开指出具备上述若干功能的间叶干细胞，其细胞数量与功能发挥程度有关，细胞数量越多，功能发挥程度越高；细胞数量越少，则反之。间叶干细胞来源包括有胚胎干细胞(embryonic stem cell) 与成体干细胞(adult stem cell)，其中成体干细胞存在于包括有骨髓、脐带、胎盘及血管壁等，本领域技术人员，皆以相似的培养技术进行扩增培养，可制成生物制剂产品，但现有技术中除取得成体干细胞的步骤过于繁琐影响质量无法一致性，亦无法有效筛选获得大量的初代培养(PO)成体干细胞，进而导致影响产量及产品功能性。
由于间叶干细胞具备有抑制免疫力、帮助修复组织与弥补造血功能等优点，为达到上述已被证实的有效功能，所需的细胞数量将是关键因素之一，本领域技术人员通常需要将取得的干细胞于体外培养数代，以期达到增加细胞数量的目的，于是在培养过程中将培养液加入不等量的人类血清或动物血清，因该血清内容物复杂，易造成产品批次间难以进行质量管控，甚或难以管控该血清引起人畜共通疾病的危险性，因此在产品应用上将产生不可预测的风险存在。目前坊间市售标榜以胎盘间叶干细胞为主的产品，实有购买者担心该产品是使用含动物血清培养液及混杂整体胎盘组织生产出来的，因购买者担心若该产品的成份与来源过于混杂，则易降低购买产品的意愿。
由于现有细胞取得来源复杂，产品质量保证难以落实，包括必须能够在长时间扩增培养下，依然产生跟原本细胞一模一样，另外亦必须能够在长时间扩增培养下，经诱导培养液培养后，依然具有分化形成特定形态及功能的成熟细胞，且为能达到大量取得自胎盘特定组织部位中纯化成体干细胞，同时必须避免使用含人类血清或动物血清培养液以隔绝污染风险，因此我们发明一种制造胎盘绒毛膜间叶干细胞(P Iacenta- chorion-membrane derived mesenchymal stem cell, pc_MSC)生物制剂的组织分解、细胞黏附与完全无血清 (serum-free)培养萃取生产技术。发明内容
由于胚胎干细胞的取得涉及伦理道德议题，本发明以成体干细胞为主，遂能避免这层障碍与产品购买者的疑虑。本发明提供了一种成体干细胞分离及增殖的方法，适用于不同个体胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)的分离及增殖，且经过多次继代培养增殖后，仍然可以保持稳定的外观形态与相同的识别度。未分化细胞，诸如组织前趋细胞、干细胞以及它们的类似物，具有使用于再生医学或治疗用组织工程的商业潜力，并且对于未分化细胞于再生医学或治疗用组织工程的应用而言，在体外培养呈现未分化状态的未分化细胞的便利的方法是必要的。本发明提供了一种分离方法萃取特定部位组织，具有高稳定性，且培养过程中排除动物血清，培养条件均为已知物质，可确保临床应用时无动物物质污染的风险。
目前已发表的学术研究成果中，源自骨髓或胎盘等来源的间叶干细胞，其分离、取得与培养方式皆与本发明技术有所差异，本发明技术特征包括(I)使用分解液浸润组织且同时配合将胎盘特定的绒毛膜组织剥离切碎及筛网过滤程序，将切碎物置入涂固有特定物质器皿使其黏附于上作为取得间叶干细胞来源、(2)简化现有技术中取得成体干细胞的步骤、(3)提供有效筛选胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)。本发明技术的实验证明如下内容说明
(I)以涂固有不同物质的细胞培养皿进行孵育相同初始细胞的实验显示，胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)对特定涂固物质具有偏好性，其中以涂固有Human Collagen Type IV的细胞培养皿进行孵育时，该物质具备有效筛选非目标细胞的效果，请参阅图1。(2)取得全体细胞后，藉由本发明技术内容所提的细胞增殖溶液进行增殖，实验数据显示全体细胞数量越多，则初始细胞增殖越多，请参阅图2。(3)以本发明技术从来自不同捐赠者的胎盘中取得胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)，再以继代培养方式完成不同继代次数的实验显示可以保持稳定的外观形态与相同的识别度的结果，请参阅图3，因此本发明技术提供了一种成体干细胞分离及增殖方法，皆可适用于不同个体胎盘绒毛膜间叶干细胞 (pc-MSC)。(4)以本发明技术将胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)进行继代扩增培养至二十代时，以细胞表面抗原鉴定技术进行确认鉴定，其中细胞标记⑶73、⑶90、⑶105及HLA-G的测试呈阳性反应；细胞标记⑶14、⑶34、⑶45的测试呈阴性反应，请参阅图4。(5)以本发明技术将胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)进行继代扩增培养至十代时，经诱导培养后，细胞分化潜力的实验显示胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)仍然保持具有分化多种胚层细胞的能力，其中，A与D为成骨细胞分化试验，A为对照组，D为试验组；B与E为软骨细胞分化试验，B为对照组，E为试验组；C与F为脂肪细胞分化试验，C为对照组，F为试验组，请参阅图5。
图1 :以不同涂固材料的培养皿培养胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)的结果，由图可见胎盘绒毛膜间叶干细胞(pc-MSC)对特定材料具有偏好性，于材料E上具有最佳的生长效率，本发明分离与培养方式与目前已发表学术成果中有关的间叶干细胞(源自骨髓或胎盘 等不同来源)不同。
图2 :不同全体细胞数量对胎盘绒毛膜间叶干细胞生长影响的结果。
图3 :不同捐赠者不同继代次数生长情形的结果，由图可见以此分离方法所得的细胞，来自不同捐赠者胎盘具有类似的形态，且经多次继代培养仍能保持稳定的外观形态。
图4 :细胞表面抗原鉴定的结果，由图可见符合一般对间叶细胞表面抗原信号的定义，其中具有⑶73、⑶90、⑶105的表达，并有HLA-G细胞表面抗原的表达且未侦测到 CD14、CD34、CD45 的信号。
图5 :干细胞分化潜能试验的结果，由图可见胎盘绒毛膜间叶干细(pc-MSC)具有分化多种胚层细胞的能力，其中，A与D为成骨细胞分化试验，A为对照组，D为试验组；B与 E为软骨细胞分化试验，B为对照组，E为试验组；C与F为脂肪细胞分化试验，C为对照组，F为试验组。
附图中符号简单说明
材料A:老鼠第一型胶原蛋白(Mouse CollagenTypeI);
材料B:层粘连蛋白(Laminin)；
材料C:纤维连接蛋白素(Fibronectin)；
材料D:人类第一型胶原蛋白(Human CollagenTypeI);
材料E:人类第四型胶原蛋白(Human CollagenTypeIV)；
材料F:无任何物质黏附(None Coating)。
具体实施方式
本发明将藉由下列实施方式做进一步的说明，这些实施方式并不限制本发明前面所揭示的内容。本发明所列实施方式除无菌操作、离心分离、细胞增殖培养、细胞表面抗原鉴定，可简化现有技术中取得成体干细胞的步骤，亦可增加现有技术中起始PO (初代培养) 成体干细胞数量，本领域技术人员，虽可做些许的改良与修饰，但仍不脱离本发明的范畴。 本发明实施方式步骤如下说明
(一 )取自生物体经分娩后排出体外的胎盘，以组织洁净溶液进行清洁洗净，其中该溶液包含有HBSS配方培养基及浓度介于O. 9%至1. 1%的磷酸盐缓冲液。
( 二)完成上述步骤后，于无尘环境空间内实施本步骤，以无菌操作方式使用手术刀剥离该胎盘的羊膜组织及绒毛膜组织。
(三)完成上述步骤后，于无尘环境空间内实施本步骤，以无菌操作方式使用步骤 (一)组织洁净溶液清洁洗净附着于该绒毛膜组织的血块，清洁洗净完毕后，将该绒毛膜组织移至细胞专用培养皿内。
(四)完成上述步骤后，于无尘环境空间内实施本步骤，以无菌操作方式使用组织分解消化溶液分解消化步骤(三)培养皿内的绒毛膜组织，并且应同时用手术刀切碎，其中该溶液包含有SMEM配方培养基、浓度介于O. 9mg/ml至1. lmg/ml的Protease 14、浓度介于 O. 9mg/ml 至1. lmg/ml 的 Collagenase B 及浓度介于1. 9mg/ml 至 2. lmg/ml 的 DNase I , 接着放置该培养皿于4摄氏度的环境空间，持续其消化时间介于12小时至16小时。
(五)完成上述步骤后，于无尘环境空间内实施本步骤，以无菌操作方式使用孔径介于70微米至100微米的筛网过滤步骤(四)培养皿内的所有物质，接着藉由离心分离方式取得该过滤液中的全体细胞。
(六)完 成上述步骤后，于无尘环境空间内实施本步骤，以无菌操作方式使用未混合任何血清的细胞增殖溶液增殖步骤(五)全体细胞，增殖培养间期每三日更换新鲜的细胞增殖溶液直至细胞浓度介于IX IOfVcm2至9X IOfVcm2，其中该溶液包含有MCDB201配方培养基、浓度介于O. 9%至1. 1%的ITS及浓度介于O. 9%至1. 1%的磷酸盐缓冲液。
(七)完成上述步骤后，于无尘环境空间内实施本步骤，以无菌操作方式使用涂固有浓度介于O. lmg/cm2至lmg/cm2的Human Collagen 4的细胞培养皿孵育筛选步骤(六) 细胞，持续孵育24小时后，接着藉由移除未贴附该培养皿的细胞，有效筛选获得初代(PO) 胎盘绒毛膜间叶干细胞，浓度介于IX IOVcm2至9X 104/cm2。
(八)完成上述步骤后，以细胞表面抗原鉴定技术，确认鉴定步骤(七)胎盘绒毛膜间叶干细胞表面抗原特征，其中该细胞特征为细胞标记CD73、CD90、CD105及HLA-G的测试呈阳性反应，细胞标记⑶14、⑶34、⑶45的测试呈阴性反应。
(九)接续步骤(七)，于无尘环境空间内实施本步骤，以无菌操作细胞增殖培养方式使用未混合任何血清的干细胞增殖溶液增殖步骤(七)初代细胞的继代培养，培养间期每三日更换新鲜的干细胞增殖溶液，其中该溶液包含有MCDB201配方培养基、浓度介于 O. 9%至1. 1%的ITS、浓度介于O. 9%至1. 1%的磷酸盐缓冲液及浓度介于9ng/ml至llng/ml 的 EGF。
(十)接续步骤(九)，于无尘环境空间内实施本步骤，以无菌操作细胞继代培养方式使用未混合任何血清的干细胞增殖溶液进行增殖至二十代(P20)时，以细胞表面抗原鉴定技术，再确认鉴定该胎盘绒毛膜间叶干细胞表面抗原特征，其中该细胞特征为细胞标记⑶73、⑶90、⑶105及HLA-G的测试呈阳性反应，细胞标记⑶14、⑶34、⑶45的测试呈阴性反应。
另外，本发明实施方式要求限于以下说明
(十一)仅限萃取胎盘绒毛膜的部位，必须移除胎盘绒毛膜以外组织。
(十二)以本发明技术取得全体细胞的任何过程中，其中该过程包含必须添加组织分解消化溶液且同时用手术刀细切至适当的大小均一，再以孔径介于70微米至100微米的筛网过滤杂质及收集滤液，藉由离心分离方式，移除所有溶液，即可取得全体细胞，该过程中不可以使用研磨及/或震荡方式处理。
(十三)组织分解消化溶液的组成成分，仅限使用SMEM配方培养基、PiOtease14、 Collagenase B及DNase I四种成分组成。
(十四)以本发明技术取得全体细胞过程中，仅限使用孔径介于70微米至100微米的筛网进行过滤。
(十五)以本发明技术获得的初始细胞，仅限使用涂固HumanCollagen Type IV 的细胞培养皿培养，才能有效筛选获得初代(PO)胎盘绒毛膜间叶干细胞。
(十六)本发明技术实施过程中，仅限使用无人类血清及/或动物血清，亦不含任何未知成分血清的各种溶液。
(十七)以本发明技术扩增培养初代(PO)胎盘绒毛膜间叶干细胞，于培养期间使用干细胞增殖溶液的组成成分，仅限使用MCDB201配方培养基、ITS、EGF及磷酸盐缓冲液四种成分组成。
权利要求
1.一种生物材料，其为胎盘绒毛膜间叶干细胞，并已保藏于台湾财团法人食品工业发展研究所，保藏编号为BCRC960408。
2.一种促进组织再生、组织修复、血管新生、造血功能及辅助免疫调节的生物制剂，由权利要求1的生物材料与继代培养以扩增该生物材料的溶液组成，其为可进行重复继代培养仍可保持该生物材料稳定的外观形态及同时具备分化多种细胞的能力。
3.根据权利要求2的生物制剂，其中该生物材料获自哺乳动物分娩后的胎盘绒毛膜组织。
4.根据权利要求3的生物制剂，其中该胎盘绒毛膜组织选自猪、牛、羊、犬、兔、鼠及人类的胎盘绒毛膜组织。
5.根据权利要求3的生物制剂，其中该胎盘绒毛膜组织为人类的胎盘绒毛膜组织。
6.根据权利要求3的生物制剂，其经连续步骤处理，包括(a)将胎盘清洁洗净并以手术刀手动剥离该胎盘的绒毛膜组织；(b)将附于该绒毛膜组织的血块清洁洗净；(c)分解消化并同时以手术刀手动切碎该绒毛膜组织；(d)以筛网过滤该绒毛膜组织进而取得含该组织分离出来的细胞的滤液；(e)将该滤液以无血清细胞培养溶液进行细胞培养；(f)再将该细胞均匀分布于涂固有生物物质的培养载体，持续培养24小时后，移除未贴附该培养皿的细胞，最后，筛选获得初代(PO)胎盘绒毛膜间叶干细胞以供使用。
7.根据权利要求6的生物制剂，其中步骤(a)与(b)中，该清洁洗净溶液选自HBSS培养基，以及进一步包含O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求6的生物制剂，其中步骤(c)中，该组织分解消化溶液系选自SMEM培养基，以及进一步包含 O. 9mg/ml 1. lmg/ml Protease 14、0· 9mg/ml 1. lmg/mlCollagenase B 及 L 9mg/ml 2. lmg/ml DNase I。
9.根据权利要求6的生物制剂，其中该步骤(c)中，将该绒毛膜组织浸泡于4摄氏度环境持续消化分解12 16小时而形成糜粥状。
10.根据权利要求6的生物制剂，其中步骤(d)中，该过滤筛网选自70 100微米孔径。
11.根据权利要求6的生物制剂，其中步骤(e)中，该细胞培养溶液选自MCDB201培养基，以及进一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS及O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸盐缓冲液。
12.根据权利要求6的生物制剂，其中该步骤(e)中，以每三日更换新鲜细胞培养溶液直至形成细胞浓度为I 9X IOfVcm2。
13.根据权利要求6的生物制剂，其中步骤(f)中，该细胞选自由胎盘间叶干细胞、组织前驱细胞、母细胞、组织特化细胞、基质细胞、组织前趋细胞、间叶细胞、脂肪衍生基质细胞、脂肪衍生干细胞及胎盘衍生干细胞所组成的群。
14.根据权利要求6的生物制剂,其中步骤(f)中，该生物物质组份系选自由Laminin、Fibronectin> Human Collagen Type1、Human Collagen Type IV 及它们的衍生物所构成的群组。
15.根据权利要求6的生物制剂，其中步骤(f)中，该生物物质组分选自由HumanCollagen Type IV及其衍生物所构成的群组。
16.根据权利要求6的生物制剂，其中该步骤(f)中，以数量O.1 1. Omg/cm2的生物物质组分涂布固定于培养载体。
17.根据权利要求6的生物制剂，其中该步骤(f)中，有效提供I 9XIOVcm2生物材料即初代胎盘绒毛膜间叶干细胞以供使用。
18.根据权利要求2的生物制剂，其中该溶液选自MCDB201培养基，以及进一步包含O.9% 1. l%(v/v) ITS、0. 9% 1. 1%(ν/ν)憐酸盐缓冲液及 9ng/ml llng/ml EGF,使得该干细胞持续继代培养。
19.根据权利要求2的生物制剂，其特征为至少包含重复进行该继代培养的重复次数达到20次仍可保持该生物材料稳定的外观形态，其中至少包含重复次数达到10次仍可保持该生物材料稳定的外观形态及同时具备分化多种细胞的能力。
20.根据权利要求14至17任一所述的生物制剂，其特征为有效筛选目标细胞，选自无血清培养基的黏附型未分化干细胞。
21.一种根据权利要求2至20任一所述的促进组织再生、组织修复、血管新生、造血功能及辅助免疫调节的生物制剂，其用途为应用于医学美容领域、再生医学领域、组织工程领域及医药领域。
22.一种制造促进组织再生、组织修复、血管新生、造血功能及辅助免疫调节的生物制剂的方法，该方法包括下述连续步骤(a)将胎盘清洁洗净并以手术刀手动剥离该胎盘的绒毛膜组织；(b)将附于该绒毛膜组织的血块清洁洗净；(c)分解消化并同时以手术刀手动切碎该绒毛膜组织；(d)以筛网过滤该绒毛膜组织进而取得含该组织分离出来的细胞的滤液；(e)将该滤液以无血清细胞培养溶液进行细胞培养；(f)再将该细胞均匀分布于涂固有生物物质的培养载体，持续培养24小时后，移除未贴附该培养皿的细胞，将筛选取得初代(PO)胎盘绒毛膜间叶干细胞以供使用；(g)提供无血清细胞继代培养溶液进行扩增培养。
23.根据权利要求22的方法，其中步骤(a)与(b)中，该清洁洗净溶液选自HBSS培养基，以及进一步包含O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸盐缓冲液。
24.根据权利要求22的方法，其中步骤(c)中，该组织分解消化溶液系选自SMEM培养基，以及进一步包含 O. 9mg/ml 1. lmg/ml Protease 14、0· 9mg/ml 1. lmg/mlCollagenase B 及 L 9mg/ml 2. lmg/ml DNase I。
25.根据权利要求22的方法，其中该步骤(c)中，将该绒毛膜组织浸泡于4摄氏度环境持续消化分解12 16小时而形成糜粥状。
26.根据权利要求22的方法，其中步骤(d)中，该过滤筛网选自70 100微米孔径。
27.根据权利要求22的方法，其中步骤(e)中，该细胞培养溶液选自MCDB201培养基，以及进一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS及O. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸盐缓冲液。
28.根据权利要求22的方法，其中该步骤(e)中，以每三日更换新鲜细胞培养溶液直至形成细胞浓度为I 9X IOfVcm2。
29.根据权利要求22的方法，其中步骤(f)中，该细胞选自由胎盘间叶干细胞、组织前驱细胞、母细胞、组织特化细胞、基质细胞、组织前趋细胞、间叶细胞、脂肪衍生基质细胞、月旨肪衍生干细胞及胎盘衍生干细胞所组成的群。
30.根据权利要求22的方法，其中步骤(f)中，该生物物质组份系选自由Laminin、Fibronectin、Human Collagen Type1、Human Collagen Type IV 及它们的衍生物所构成的群组。
31.根据权利要求22的方法,其中步骤(f)中，该生物物质组分选自由HumanCollagenType IV及其衍生物所构成的群组。
32.根据权利要求22的方法，其中该步骤(f)中，以数量O.1 1. Omg/cm2的生物物质组分涂布固定于培养载体。
33.根据权利要求22的方法，其中该步骤(f)中，有效提供I 9XIOVcm2生物材料即初代胎盘绒毛膜间叶干细胞以供使用。
34.根据权利要求22的方法，其中步骤(g)中，该细胞继代培养溶液选自MCDB201培养基，以及进一步包含O. 9% 1. l%(v/v) ITS、0. 9% 1. 1%(ν/ν)磷酸盐缓冲液及9ng/ml llng/ml EGF0
35.根据权利要求30至33任一所述的方法，其特征为有效筛选目标细胞，选自无血清培养基的黏附型未分化干细胞。
36.根据权利要求34的方法，至少包含重复进行该继代培养的重复次数达到20次仍可保持该筛选取得的初代胎盘绒毛膜间叶干细胞稳定的外观形态，其中系至少包含重复次数达到10次仍可保持该干细胞稳定的外观形态及同时具备分化多种细胞的能力。
37.根据权利要求22的方法，其中筛选取得的细胞特征为对至少一种选自由CD73、⑶90、⑶105及HLA-G组成的群组中的细胞标记的测试呈阳性反应；对至少一种选自由⑶14、⑶34、⑶45组成的群组中的细胞标记的测试呈阴性反应。
38.根据权利要求36的方法，其中继代培养的细胞特征为对至少一种选自由CD73、⑶90、⑶105及HLA-G组成的群组中的细胞标记的测试呈阳性反应；对至少一种选自由⑶14、⑶34、⑶45组成的群组中的细胞标记的测试呈阴性反应。
39.权利要求36至38任一所述的方法，其特征为进行重复继代培养仍可保持该干细胞稳定的外观形态及同时具备分化多种细胞的能力。
40.一种根据权利要求22至39任一所述的方法，其应用于医学美容领域、再生医学领域、组织工程领域及医药领域。
全文摘要
本发明揭示一种简易的由胎盘特定组织中取得大量成体干细胞制成生物制剂的方法，其主要特征在于使用分解液浸润组织且同时配合全体组织剥离切碎及筛网过滤程序，将切碎物置入涂固有特定物质的器皿使其黏附于上。本发明亦揭示含有一种无血清的培养液进行成体干细胞培养的方法，其特征在于培养全程使用适当的无血清培养液，可将该未分化的成体干细胞培养于涂固有特定物质的器皿，藉此成体干细胞的增生及分化潜力得以被保持，此方法可以被用于体外扩增成体干细胞而不会丧失其复制及分化能力。因此，本发明的方法可以被应用于再生医学、组织工程以及使用在其它来源的干细胞须具备有抑制免疫力、修复组织与造血功能需求上。
文档编号A61L27/38GK103031273SQ20121028648
公开日2013年4月10日 申请日期2012年8月13日 优先权日2011年9月28日
发明者林泰元, 陈耀昌, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:林泰元, 陈耀昌