一种PD‑1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用与流程

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于crispr/cas9技术的pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术：
：人源化动物模型是指带有人类功能性基因、细胞或组织的动物模型。这种模型通常作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。研究人类复杂疾病的发病机制,筛选有效药物,需要理想的动物模型来进行大量的体内试验.小鼠是应用最为广泛的生物模型之一，但考虑到小鼠与人类在生理、病理等诸多方面存在差异,构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型尤为重要。利用基因修饰的方法，将人类基因“放置”在大、小鼠染色体上所制备的人源化基因动物模型，是进行一些人类疾病研究的方法。肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，《science》杂志将肿瘤免疫疗法评为2013年十大科学突破第一位。目前，针对pd-1/pd-l1通路抑制剂的研究受到了特别的关注。pd-1(programmeddeath-1)主要表达于t细胞及初级b细胞表面，pd-1的两个配体(pd-l1和pd-l2)，广泛表达于抗原提呈细胞(apcs)等。pd-1与其受体的相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到pd-l1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的pd-l1的表达，表达的pd-l1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤t细胞的凋亡，进而逃避免疫系统的攻击。抑制pd-1与其配体的结合，可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤视野，进而达到杀伤肿瘤组织及治疗癌症的作用。目前有国内外很多大公司开始正在加紧开发抗pd-1药物。最熟悉的全球制药巨头当属bms和默沙东，两家公司的opdivo和keytruda均已拿下黑色素瘤和肺癌适应症。2015年11月，fda批准opdivo用于晚期肾细胞癌，opdivo头颈癌关键iii期临床已成功完成。在2016年1月举办ascogi2016上公布的结果显示，这两款药在管癌、胃癌显示积极疗效。在我国，2015年底，君实生物成为首家pd-1单抗获批临床的企业；2016年1月，百济神州的pd-1单抗bgb-a317通过fda的新药研究申请审评，获准在美国开展临床试验；2月19日，恒瑞医药开发的注射用shr-1210(pd-1单克隆抗体)获得药物临床试验批件，主要适应症为实体瘤；2月22日，沃森生物发布公告称，其子公司嘉和生物研发的抗pd-1单抗(杰诺单抗注射液)产品临床研究申请获得受理，主要的潜在适应症包括各种血癌及黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等多种实体瘤。截止2016年3月，国内已有两家pd-1单抗药物获得了临床试验批件，另有两家正在受理中。药厂之间激烈的竞争表明了对该类药物高度认同，pd-1抑制剂可能成为医药史上一个重要的里程碑。美国国家癌症研究所(nci)将pd-1列为140种癌症免疫治疗途径和分子中的第二最有前景的潜在靶点。由于免疫疗法有较明显的免疫毒性，如皮炎、大肠炎、垂体炎等，这种副作用与免疫应答程度直接相关，很难通过剂量调整避免。pd-1单抗nivolumab、mk-3475都报道了肺炎这一严重不良反应，因此严格的药物筛选程序非常重要。但由于人类生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上，而人源化动物模型则能很好地“复制”人类某些功能，这种模型通常被用做人类疾病体内研究的活体替代模型。人源化动物模型的应用很广泛，比如在肿瘤、艾滋病、传染病、人类退化性疾病、血液病研究领域等都有很强的适用性。目前已有一些pd-1基因相关的动物模型，如nihimura等人早在2001年已经制备了pd-1敲除的balb/c小鼠，这些模型主要用于研究pd-1基因的功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究。鉴于pd-1基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的药效试验更有效并提高研发成功率，针对现有技术的不足和缺陷，特提出本发明。技术实现要素：本发明的目的是提供一种pd-1基因修饰人源化非人哺乳动物模型。本发明的第二发明目的在于提出该pd-1基因修饰人源化非人哺乳动物的制备方法。本发明的第三发明目的在于提出该模型的应用。为了实现本发明的目的，采用的技术方案为：本发明提供一种制备pd-1基因修饰人源化动物模型的方法，所述方法包括：1)构建打靶载体：从基因组dna经pcr方法扩增获得同源臂，与待引入的hpd-1片段连接至打靶载体；2)构建sgrna：根据靶位点设计并选择sgrna，将sgrna连接至载体质粒并进行体外转录；3)将打靶载体，转录的sgrna转入到胚胎细胞，移植至假孕动物体内；4)对得到的嵌合体动物进行基因型鉴定，筛选基因成功敲进的阳性动物；进一步与野生型动物交配，获得f1代杂合子；f1代杂合子之间交配后获得纯合子。基于上述技术方案，本发明提供一种pd-1基因修饰人源化的动物模型，所述动物为非灵长类哺乳动物，其基因组中含有人pd-1基因片段，能正常表达pd-1功能蛋白，且表达的蛋白含有人pd-1蛋白的功能域。所述的pd-1基因修饰是针对pd-1基因第二外显子进行的基因修饰。进一步地，所述非灵长类哺乳动物为啮齿类动物。更进一步，所述啮齿类动物为小鼠。优选地，所述小鼠的品系为c57bl/6。本发明提供的pd-1基因修饰人源化的动物模型，其pd-1基因的第11053-11385位核苷酸用人dna片段进行替代，保留包括跨膜区在内的其他小鼠pd-1区域；所述人dna片段如seqidno：21所示。在本发明的一个实施例中，提供的pd-1基因修饰人源化的动物模型，其pd-1基因的第11053-11385位核苷酸用人dna片段进行替代，保留第二外显子左右边缘14/13bp和包括跨膜区在内的其他小鼠pd-1区域；所述人dna片段如seqidno：21所示。优选的，所述动物模型由上述方法制备而成。本发明提供一种人源化小鼠pd-1基因的dna序列，dna序列编码的蛋白含有人pd-1蛋白的功能域。本发明提供一种人源化小鼠pd-1基因的dna序列，是小鼠pd-1基因的第11053-11385位核苷酸用人dna片段进行替代，保留包括第二外显子左右边缘各14/13bp和跨膜区在内的其他小鼠pd-1区域，所述人dna片段如seqidno：21所示或与该片段具有80％及以上同源性的dna片段，该人源化小鼠pd-1基因的dna序列含有seqidno：14所示的核苷酸序列或与该人源化小鼠pd-1基因的dna序列具有80％及以上同源性的dna片段。优选的，用于扩增该人源化小鼠pd-1基因的dna序列的上下游引物序列如seqidno:22-23所示。进一步，所述的人源化小鼠pd-1基因的dna序列，其cds序列如seqidno:15所示或与seqidno:15具有80％及以上同源性的片段，其mrna序列如seqidno:16所示或与seqidno:16具有80％及以上同源性的片段，其编码的蛋白序列如seqidno：17所示或其特异性氨基酸片段，且功能不变。本发明提供了一种上述人源化小鼠pd-1基因的dna序列在构建pd-1基因修饰人源化的动物模型中的用途。优选的，所述小鼠pd-1基因的第二外显子的第11053-11385位核苷酸用人dna片段进行替代，且保留包括跨膜区在内的其他小鼠pd-1区域，所述人dna片段如seqidno：21所示，该人源化小鼠pd-1基因的dna序列含有seqidno：14所示的核苷酸序列。进一步地，在本发明具体实施例中，是在小鼠pd-1基因的第11053-11385位核苷酸用人dna片段进行替代，左右边缘各保留14/13bp。进一步地，所述用途是将含有人源化小鼠pd-1基因的dna序列的表达载体与cas9mrna，小鼠pd-1基因第二外显子的sgrna质粒的体外转录产物注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产pd-1基因修饰人源化小鼠模型。本发明还提供一种特异性靶向小鼠pd-1基因第二外显子的sgrna，其靶位点序列如seqidno:3或seqidno:8所示。优选的，合成序列如seqidno:3所示靶位点的上下游单链序列分别如seqidno:9-10所示；合成序列如seqidno:8所示靶位点的上下游单链序列分别如seqidno:11-12所示。本发明还提供一种含有上述sgrna的dna序列的crispr/cas9打靶载体。本发明还提供了上述sgrna或上述crispr/cas9打靶载体在制备pd-1基因修饰动物模型中的应用。在本发明中，提供一种制备pd-1基因修饰人源化的动物模型的方法，包括以下步骤：(1)将本发明上述的人源化小鼠pd-1基因的dna序列、3’同源臂和5’同源臂连接至质粒上，构建人源化小鼠pd-1基因第二外显子的同源重组表达载体；所述5’同源臂如seqidno:18所示，所述3’同源臂如seqidno:24所示；(2)构建小鼠pd-1基因第二外显子的sgrna的质粒；(3)将步骤(2)的体外转录产物与步骤(1)的表达载体以及和cas9mrna注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，移植入受体母鼠生产pd-1基因修饰人源化小鼠模型。优选的，步骤(1)中，是以野生型c57bl/6小鼠基因组dna为模板pcr扩增5’同源臂片段和3’同源臂片段，扩增的引物对序列分别如seqidno:19-20和seqidno:25-26所示；所述质粒为pv-4g。优选的，步骤(2)小鼠pd-1基因第二外显子的sgrna的质粒是将上述sgrna连接至pt7-sgrna质粒获得。本发明还提供一种上述方法制备得到的pd-1基因修饰人源化的动物模型。本发明还听过一种上述pd-1基因修饰人源化的动物模型在制备双基因或多基因人源化动物模型中的应用。本发明还提供一种制备双基因或多基因人源化动物模型的方法，所述双基因或多基因人源化动物模型由上述任一pd-1基因修饰人源化的动物模型制备而成。优选的，利用上述携带有人源化修饰pd-1基因的动物模型通过交配或进一步的基因编辑方法制备获得的双基因或多基因人源化动物模型。本发明还提供一种双基因或多基因人源化动物模型，所述双基因或多基因人源化动物模型由上述制备双基因或多基因人源化动物模型的方法制备而成。本发明还提供一种分离的细胞或组织，所述细胞或组织分离自上述任一pd-1基因修饰人源化的动物模型或者上述任一的双基因或多基因人源化动物模型。优选的，所述组织是脾脏，所述细胞是脾细胞。本发明还提供上述任一动物模型、或上述的人源化小鼠pd-1基因的dna序列、或上述针对小鼠pd-1基因第二外显子的sgrna、或其crispr/cas9打靶载体、或上述分离的细胞或组织在pd-1调节剂、pd-l1调节剂或药物研发中的应用或在pd-1、pd-l1信号传导机理研究中的应用或在肿瘤学研究方面的应用。本发明还提供一种细胞或组织，所述细胞或组织是pd-l1基因人源化的细胞或组织。优选的，所述细胞或组织为双基因或多基因人源化的细胞或组织。本发明还提供上述动物模型或者分离的细胞或组织与pd-l1基因人源化的细胞或组织联合使用时在pd-1或pd-l1调节剂或药物研发中的应用、在pd-1或pd-l1信号传导机理研究中的应用、以及在肿瘤学研究方面的应用。本发明还提供上述动物模型或者上述分离的细胞或组织单独使用或者与上述pd-l1基因人源化的细胞或组织联合使用时在评估靶向pd-1/pd-l1药物有效性或者筛选靶向pd-1/pd-l1药物中的应用。本发明还提供上述动物模型或者上述分离的细胞或组织单独使用或者与上述pd-l1基因人源化的细胞或组织联合使用时在评估靶向pd-1/pd-l1药物和其他药物联用的有效性或者筛选靶向pd-1/pd-l1药物和其他药物联用的组合药物的应用。优选的，上述应用中，所述靶向pd-1/pd-l1药物为治疗肿瘤的药物。优选的，所述的药物为单抗、双抗或多抗以及其它大分子、小分子药物。本发明还提供上述动物模型或者上述分离的细胞或组织单独使用或者与上述pd-l1基因人源化的细胞或组织联合使用时在筛选用于人pd-1/pd-l1信号通路调节剂中的应用。本发明还提供一种评估靶向pd-1/pd-l1药物有效性的方法，单独利用上述动物模型或者上述分离的细胞或组织或者联合利用上述动物模型或者上述分离的细胞或组织与上述pd-l1基因人源化的细胞或组织对药物进行评估。本发明还提供一种评估靶向pd-1/pd-l1药物和其他药物联用的有效性的方法，单独利用上述动物模型或者上述分离的细胞或组织或者联合利用上述动物模型或者上述分离的细胞或组织与上述pd-l1基因人源化的细胞或组织对靶向pd-1/pd-l1药物进行评估。本发明还提供一种筛选靶向pd-1/pd-l1药物的方法，单独利用上述动物模型或者上述分离的细胞或组织或者联合利用上述动物模型或者上述分离的细胞或组织与上述pd-l1基因人源化的细胞或组织对药物进行筛选。本发明还提供一种筛选靶向pd-1/pd-l1药物和其他药物联用的组合药物的方法，单独利用上述动物模型或者上述分离的细胞或组织或者联合利用上述动物模型或者上述分离的细胞或组织与上述pd-l1基因人源化的细胞或组织对所述组合药物进行筛选。优选的，上述方法中，所述靶向pd-1/pd-l1药物为治疗肿瘤的药物。优选的，所述的药物为单抗、双抗或多抗，以及其它生物或化学类药物。本发明还涉及来自基因修饰动物的精子、卵细胞、受精卵、胚胎、子代、细胞或组织，及上述生物材料在pd-1/pd-l1信号机理研究及在pd-1/pd-l1调节剂药物毒理研究和pd-1/pd-l1调节剂的筛选开发等临床前实验中的应用。本发明提供一种携带有人源化修饰pd-1基因的小鼠，其基因组中含有人pd-1基因片段，能正常表达pd-1功能蛋白，且表达的蛋白含有人pd-1蛋白的功能域。进一步地，上述携带有人源化修饰pd-1基因的小鼠，其pd-1基因的第二外显子的第11053-11385位核苷酸用人pd-1基因的dna片段进行替代，左右边缘各保留14/13bp，且保留包括跨膜区在内的其它小鼠pd-1区域；所述人dna片段如seqidno：21所示。本发明提供了上述动物模型或携带有人源化修饰pd-1基因的小鼠在制备双基因或多基因人源化动物模型的应用。利用上述动物模型或携带有人源化修饰pd-1基因的小鼠通过交配或进一步的基因编辑方法制备获得的双基因或多基因人源化动物模型也属于本发明的保护范围。进一步地，上述动物模型或由其制得的双基因或者多基因人源化动物模型在药物研发中的应用或在肿瘤学研究中的应用属于本发明的保护范围。所述的药物为单抗、双抗或多抗，以及其它生物或化学类药物。本发明的特点在于：1)本发明的动物模型，是通过dna序列同源重组的方式，其pd-1基因的第2外显子部分地被人为替换成人源pd-1基因第2外显子。2)本发明的动物模型能在动物体内表达含有人pd-1蛋白功能域的pd-1蛋白。采用本方法能最大程度减少人源化可能造成的因基因剪切、编辑造成的影响；保留包括跨膜区在内的其它小鼠pd-1基因功能区域，避免基因人源化造成小鼠表达pd-1蛋白以及涉及pd-1蛋白生理功能的异常。附图说明图1：5’端靶位点sgrna(sgrna1-sgrna4)和3’端靶位点sgrna(sgrna5-sgrna8)活性检测结果，其中con为阴性对照，pc为阳性对照，blank为空白对照。图2：pt7-sgrna质粒图谱示意图。图3：tv-pd重组载体的酶切电泳结果，图中1和2分别指2个tv-pd克隆。图4：为首建鼠鼠尾pcr鉴定结果，其中，wt为野生型小鼠，nc为阴性对照，m为标记，图中1、2、3分别指代实施例9的三只f0小鼠的鼠尾pcr鉴定结果。图5：为f1代小鼠pcr结果，其中wt为野生型，nc为阴性对照,m为标记。图6：为f1代小鼠southernblot结果，其中m为标记,wt为野生型。图7：为杂合小鼠细胞流式分析结果。图8：流式分析结果，其中，取野生型c57bl/6小鼠和b-hpd-1纯合子小鼠，分别用抗鼠cd3抗体刺激脾脏内t细胞激活，再用抗鼠pd-1抗体mpd-1pe(图a、b)和抗人pd-1抗体hcd47fitc(图c、d)，进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析可见：与对照组(图a、b)相比，可在b-hpd-1纯合子小鼠脾脏内，检测到表达人pd-1蛋白的细胞；而在c57bl/6小鼠的脾脏内，未检测到表达人pd-1蛋白的细胞。图9：rt-pcr检测结果，其中，+/+为野生型c57bl/6小鼠，h/h为b-hpd-1纯合子小鼠；gapdh为内参对照。图10：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-hpd-1小鼠体内，并利用人pd-1抗体keytruda进行抗肿瘤药效试验，g1溶剂对照组和g2keytruda治疗组的实验动物平均体重增长无明显差异。图11：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-hpd-1小鼠体内，并利用人pd-1抗体keytruda进行抗肿瘤药效试验，g2治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于g1对照组，且具有显著差异。图12：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-hpd-1小鼠体内，并利用不同剂量的人pd-1抗体keytruda进行抗肿瘤药效试验(0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg)，g1-g5各组实验动物平均体重增长无显著差异。图13：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-hpd-1小鼠体内，并利用不同剂量的人pd-1抗体keytruda进行抗肿瘤药效试验(0.3mg/kg、1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg)，g2-g5治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于g1对照组，且具有显著差异。图14：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1(pdl1基因人源化的mc38细胞)植入b-hpd-1小鼠体内，并利用人pd-l1抗体tecentriq进行抗肿瘤药效试验，试验组与对照组的实验动物平均体重增长无显著差异。图15：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠体内，并利用人pd-l1抗体tecentriq进行抗肿瘤药效试验，治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于对照组，且具有明显差异。图16：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠体内，并利用不同剂量的人pd-l1抗体tecentriq进行抗肿瘤药效试验(3mg/kg和10mg/kg)，g1-g4各组实验动物平均体重增长无显著差异。图17：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠体内，并利用不同剂量的人pd-l1抗体tecentriq进行抗肿瘤药效试验(3mg/kg和10mg/kg)，g2-g4治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于g1对照组，且具有明显差异。图18：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠体内，并利用cisplatin、keytruda和tecentriq中的1种或2种联用进行抗肿瘤药效试验，g1-g4各组实验动物平均体重增长无明显差异。图19：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠体内，并利用cisplatin、keytruda及2种药物联用进行抗肿瘤药效试验，g2-g6各治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于对照组，且cisplatin与keytruda联用治疗组(g4)的小鼠荷瘤体积明显小于单独使用cisplatin(g2)或keytruda(g3)治疗组，表明联合用药的疗效优于cisplatin或keytruda单独使用的疗效。图20：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠体内，并利用cisplatin、tecentriq及2种药物联用进行抗肿瘤药效试验，治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于对照组，且cisplatin与tecentriq联用治疗组(g6)的小鼠荷瘤体积明显小于单独使用cisplatin(g2)或tecentriq(g3)，表明联合用药的疗效优于cisplatin或keytruda单独使用的疗效。图21：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠体内，使用阳性对照药tecentriq或两种抗人pd-l1抗体pdl1-ab1、pdl1-ab2中的1种进行抗肿瘤药效试验，g1-g4各组实验动物平均体重增长无显著差异。图22：将小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1植入b-hpd-1小鼠体内，使用阳性对照药tecentriq或两种抗人pd-l1抗体pdl1-ab1、pdl1-ab2中的1种进行抗肿瘤药效试验，其中使用pdl1-ab1抗体治疗(g3)与tecentriq治疗组(g2)小鼠肿瘤体积大小差别不大，且g2、g3组与对照组(g1)的瘤体积相比均具有显著的差异(p＜0.05)；而使用pdl1-ab2抗体治疗(g4)的小鼠肿瘤体积明显大于tecentriq治疗组(g2)及pdl1-ab1抗体治疗(g3)，表明在相同的给药剂量和频次下，抗人pdl1-ab1抗体与阳性对照品tecentriq药效相似，在抑制肿瘤生长上效果相当，而抗人pdl1-ab2抗体药效不如tecentriq或pdl1-ab1抗体。图23：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-hpd-1小鼠体内，使用5种抗人pd-1抗体进行抗肿瘤药效试验，g1-g6各组实验动物平均体重增长无明显差异。图24：将小鼠结肠癌细胞mc38植入b-hpd-1小鼠体内，使用5种抗人pd-1抗体进行抗肿瘤药效试验，所有g2-g6治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积呈现不同程度的缩小和/或消失，表明5种抗人pd-1单抗均具有良好的抑瘤作用。图25：流式分析结果，其中，取c57bl/6小鼠和双重人源化ctla-4/pd-1杂合子，分别用抗鼠cd3抗体刺激脾脏内t细胞激活，再用鼠源ctla-4抗体mctla-4apc(图a、b、c)或人源ctla-4抗体hctla-4pe(图d、e、f)，或鼠源pd-1抗体mpd-1pe(图g、h、i)或人源pd-1抗体hpd-1fitc(图j、k、l)，和鼠源t细胞表面抗体mtcrβ对t细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，可在双重人源化ctla-4/pd-1杂合子的杂合鼠脾脏内，表达人ctla-4和pd-1蛋白的细胞；而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人ctla-4或pd-1蛋白的细胞。具体实施方式本申请实施例所用的生化试剂为：ecori，ecorv，hindiii，kpni,bglii酶购自neb，货号分别为r3101m，r3195m，r3104m，r3142m,r0144m；xtramaxiplusef购自macherey-nagel，货号为740426；卡那霉素购自amresco,货号为0408；ambion体外转录试剂盒购自ambion，货号am1354；aio试剂盒,uca试剂盒来源百奥赛图公司，货号分别为bcg-dx-004，货号bcg-dx-001；cas9mrna来源sigma，货号cas9mrna-1ea；小鼠结肠癌细胞mc38购自上海酶研生物技术有限公司；大肠杆菌top10感受态细胞购自tiangen公司，货号为cb104－02；anti-mousepd-1来源biolegend，货号为135210；cisplatin来源hospiraaustraliaptyltd.；鼠cd3抗体来源bd，货号为563123；mpd-1_pe来源biolegend，货号为109104；hpd-1fitc来源biolegend，货号为329904；mtcrβpercp来源biolegend，货号为109228；mctla-4apc来源biolegend，货号为106310；hctla-4pe来源biolegend，货号为349906。实施例1pd-1基因sgrna的设计靶序列决定了sgrna的靶向特异性和诱导cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgrna表达载体的前提。设计并合成识别5’端靶位点(sgrna1-sgrna4)、3’端靶位点(sgrna5-sgrna8)的向导rna序列。以小鼠为例，根据pd-1基因的功能和序列特征，5’端靶位点和3’端靶位点均位于小鼠pd-1基因的第二外显子上，各sgrna在pd-1上的靶位点序列如下：sgrna-1靶位点序列(seqidno：1)：5’-agggacctccagggcccattggg-3’sgrna-2靶位点序列(seqidno：2)：5’-cagaggtccccaatgggccctgg-3’sgrna-3靶位点序列(seqidno：3)：5’-gtagaaggtgagggacctccagg-3’sgrna-4靶位点序列(seqidno：4)：5’-ccctcaccttctacccagcctgg-3’sgrna-5靶位点序列(seqidno：5)：5’-gcaccccaaggcaaaaatcgagg-3’sgrna-6靶位点序列(seqidno：6)：5’-ggagcagagctcgtggtaacagg-3’sgrna-7靶位点序列(seqidno：7)：5’-gttaccacgagctctgctccagg-3’sgrna-8靶位点序列(seqidno：8)：5’-gcaaaaatcgaggagagccctgg-3’实施例2sgrna的筛选利用uca试剂盒检测实施例1筛选得到的多个向导sgrna的活性，从结果可见向导sgrna具有不同活性，检测结果参见图1。从中优先选择2个，分别是sgrna3和sgrna8，进行后续实验。合成sgrna的上下游单链，见表1：表1sgrna3和sgrna8序列列表实施例3pt7-sgrna质粒构建pt7-sgrna质粒来源：pt7-sgrna载体图谱，参见图2。该质粒骨架来源takara，货号3299。由质粒合成公司合成含有t7启动子(taatacgactcactatagg)及sgrnascaffold的片段dna(见seqidno：13)并通过酶切(ecori及bamhi)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。实施例4pt7-pd-3和pt7-pd-8重组表达载体的构建将表1中列出的sgrna3和sgrna8的上游单链5’端加上tagg，下游单链5’端加上aaac，上下游单链退火后分别连接至pt7-sgrna质粒(质粒先用bbsi线性化)，获得表达载体pt7-pd-3和pt7-pd-8，连接反应体系见表2：表2连接反应体系sgrna退火产物1μl(0.5μm)pt7-sgrna载体1μl(10ng)t4dnaligase1μl(5u)10×t4dnaligasebuffer1μl50％peg40001μlh2o补至10μl反应条件为：室温连接10-30min，转化至30μltop10感受态细胞中，然后取200μl涂布于kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有kan抗性的lb培养基(5ml)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pt7-pd-3和pt7-pd-8进行后续实验。实施例5序列设计将小鼠pd-1基因(geneid:18566)第二外显子的第11053-11385位核苷酸用人dna片段(seqidno:21)进行替代，最终得到改造后的人源化小鼠pd-1基因的dna序列(嵌合pd-1基因dna)如seqidno:14所示，seqidno:14仅列出涉及改造部分的dna序列，其中219-551bp区域为人源片段。按照上述操作，将小鼠pd-1基因上的第二外显子上用人dna片段进行替代，最终获得人源化小鼠，具体的：人源化小鼠pd-1基因的cds序列和mrna序列分别如seqidno：15和seqidno：16所示；seqidno：15(869bp)，其中第91-423位为人源片段，seqidno：16(1972bp)，其中第154-486位为人源片段：人鼠嵌合pd-1蛋白序列如seqidno：17所示，其中第31-141氨基酸区域为人源片段。实施例6载体构建根据上述实验方案，设计3段同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：以野生型c57bl/6小鼠基因组dna为模板pcr扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段；以人基因组dna为模板pcr扩增获得人dna片段。5’端同源臂(1770bp)：ncbi登录号为nc_000067.6的第94041502-94043271位核苷酸(seqidno:18),上游引物(seqidno:19)；下游引物(seqidno:20)。人源dna片段(333bp)：ncbi登录号为nc_000002.12的第241852634-241852966位核苷酸(seqidno:21)：上游引物(seqidno:22)，下游引物(seqidno:23)。3’同源臂(1733bp)：ncbi登录号为nc_000067.6的第94039436-94041168位核苷酸(seqidno:24)；上游引物(seqidno:25)，下游引物(seqidno:26)。通过aio试剂盒将5’端同源臂片段、3’端同源臂片段和人源dna片段连接至试剂盒配备的tv-4g质粒上，最终获得载体tv-pd。实施例7载体验证随机挑选实施例6的2个tv-pd克隆，使用2组限制性内切酶对克隆进行酶切验证，其中，ecori+ecorv应出现1812bp+5527bp，hindiii+kpni应出现270bp+574bp+1091bp+5704bp。酶切结果参见图3，质粒1、2的酶切结果均符合预期，表明这2个编号的质粒酶切验证正确结果。其中编号2的质粒经测序公司测序验证正确。实施例8显微注射及胚胎移植取c57bl/6小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的实施例4制得的pt7-pd-3、pt7-pd-8质粒的体外转录产物(使用ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和cas9mrna，tv-pd质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到c57bl/6背景的首建鼠(即founder鼠，为f0代)。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。应用本方法得到的免疫节点人源化小鼠命名为b-hpd-1。实施例9基因改造人源化小鼠的鉴定1、f0代基因型鉴定分别使用两对引物对实施例8得到的f0代b-hpd-1小鼠的鼠尾基因组dna进行pcr分析，引物位置l-gt-f位于5’同源臂左侧，r-gt-r位于3’同源臂右侧，r-gt-f和l-gt-r均位于2号外显子上，5’端上游引物：l-gt-f(seqidno:27)，下游引物：l-gt-r(seqidno:28)。3’端上游引物：r-gt-f(seqidno:29)，下游引物：r-gt-r(seqidno:30)。pcr反应体系(20μl)如表3所示：表310×缓冲液2μldntp(2mm)2μlmgso4(25mm)0.8μl上游引物(10μm)0.6μl下游引物(10μm)0.6μl鼠尾基因组dna200ngkod-plus-(1u/μl)0.6μlpcr扩增反应条件如表4所示：表4如果重组载体插入位置正确，则应只有1条pcr条带，5’端引物产物长度应为1956bp，3’端引物产物长度应为2245bp。在获得的24只f0代小鼠中共有3只经鉴定为阳性小鼠。3只小鼠的pcr鉴定结果见图4。2、f1代基因型鉴定将f0鉴定为阳性的小鼠与野生型小鼠交配得到f1代小鼠。对f1代鼠尾基因组dna进行pcr分析。pcr体系、反应条件及引物同f0代基因型鉴定。f1代小鼠pcr实验结果见图5，显示有6只f1代小鼠为阳性小鼠，具体编号为：f1-1、f1-2、f1-3、f1-5、f1-7、f1-8。进一步的，应用southernblot方法对pcr确认为阳性的6只小鼠(f1-1，f1-2，f1-3，f1-5，f1-7，f1-8)进行确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组dna，选用kpni、bglii酶分别消化基因组，转膜，杂交。探针p1、p2分别位于3’同源臂外侧及人源化片段上。探针合成引物分别为：p1-f(seqidno:31)，p1-r(seqidno:32)；p2-f(seqidno:33)，p2-r(seqidno:34)。制备成功的基因工程小鼠经探针杂交分别产生2.7kb或3.7kb大小的条带，而野生型的c56bl/6小鼠基因组只有7.3kb或3.7kb的条带，不会有杂交条带产生。实验结果显示杂交条带大小均与预期相符，证实有4只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入，编号分别为f1-1，f1-2，f1-3，f1-5；编号为f1-7和f1-8的2只小鼠通过southernblot显示存在随机插入。southernblot检测结果见图6。这表明使用本发明方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的b-hpd-1人源化基因工程小鼠。3、人源化小鼠的表达情况分析取实施例8得到的f1代小鼠，取其t淋巴细胞(cd3+)，分别用anti-mousepd-1和anti-humanpd-1抗体进行流式分析。从流式分析结果(见图7)看，anti-humanpd-1与anti-mousecd3两个抗体染色得到的双阳性细胞比例在92％，表明本方法制备得到的pd-1基因修饰人源化小鼠可以表达人pd-1蛋白。进一步的，将实施例8得到的f1代小鼠互相交配，得到f2代pd-1基因人源化纯合子。选取1只pd-1基因人源化纯合子小鼠(8周龄)，另取1只野生型c57bl/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠cd3抗体，24h后脱颈安乐死后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入pbs溶液中和裂解反应，离心弃上清后用pbs清洗细胞1次，分别进行facs检测和rt-pcr检测。facs检测：用鼠源pd-1抗体mpd-1pe和鼠源t细胞表面抗体mtcrβ及人源pd-1抗体hpd-1fitc和鼠源t细胞表面抗体mtcrβ对t细胞胞外蛋白同时进行染色，用pbs清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果(如图8)显示，与未经刺激和经过鼠cd3抗体刺激脾脏中t细胞激活后的c57bl/6小鼠相比，人源pd-1抗体可以检测到人源化小鼠脾脏内表达人pd-1蛋白的细胞；而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人pd-1蛋白的细胞。rt-pcr检测：提取野生型c57bl/6小鼠和b-hpd-1纯合子小鼠脾脏细胞总rna，利用逆转录试剂盒逆转录成cdna，利用引物：mpd-1rt-pcrf3：(seqidno:35)，和mpd-1rt-pcrr3：(seqidno:36)扩增大小为297bp的鼠pd-1片段；利用引物hpd-1rt-pcrf3(seqidno:37)，和hpd-1rt-pcrr3(seqidno:38)扩增大小为297bp的人pd-1片段。pcr反应体系20μl，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用gapdh作为内参。实验结果显示(见图9)，野生型c57bl/6小鼠活化细胞中可检测到鼠pd-1的mrna表达，b-hpd-1纯合子小鼠活化细胞中可检测到人pd-1的mrna表达。实施例10b-hpd-1基因人源化动物模型体内药效验证本实施例选择已经被广泛验证的2种针对人pd-1/pd-l1信号通路的已上市药品进行人源化动物模型的体内药效验证，分别是默沙东(merck&co)的keytruda(pembrolizumab，人源化单克隆抗体)和罗氏旗下基因泰克(genentech)的tecentriq(atezolizumab，全人源化单克隆抗体)。取b-hpd-1纯合小鼠(4-6周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞mc38或mc38-hpdl1(即pd-l1基因人源化mc38细胞)，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组。治疗组随机选择上述2种抗体中的1种以及不同的给药剂量(0.3-25mg/kg)，对照组注射等体积的空白溶剂。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束试验。具体的实验方案如下：实验1keytruda抗体药效预实验(n＝6/组)：小鼠皮下接种mc38细胞(5×105/100μlpbs)后，治疗组腹腔注射25mg/kg的抗人pd-1抗体keytruda，对照组注射相同体积的空白溶剂；给药频率为每3天给药1次，共给药6次；实验2keytruda抗体不同剂量药效实验：小鼠皮下接种mc38细胞(5×105/100μlpbs)，治疗组(n＝6/组)腹腔注射不同剂量的抗人pd-1抗体keytruda(0.3-10mg/kg)，对照组(n＝10/组)注射相同体积的空白溶剂；给药频率为每3天给药1次，共给药6次；实验3tecentriq抗体药效预实验(n＝7/组)：皮下接种mc38-pdl1(5×105/100μlpbs)，治疗组腹腔注射3mg/kg的抗人pd-l1抗体tecentriq，对照组注射相同体积的空白溶剂；给药频率为每周给药3次，共给药2周；实验4tecentriq抗体不同剂量药效实验(n＝5/组)：皮下接种mc38-pdl1(2×105/100μlpbs)，治疗组腹腔注射1-10mg/kg的抗人pd-l1抗体tecentriq，对照组注射相同体积的空白溶剂；给药频率为每2天给药1次，共给药8次；表5、6、7、8中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后10-25天时的肿瘤体积、实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(p值)。整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重均出现增长。所有实验治疗组和对照组小鼠体重(图10、12、14、16)在整个实验周期内均无明显区别，但从量瘤结果上看(图11、13、15、17)，所有对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与其对照组相比，肿瘤体积均出现不同程度的缩小和/或消失，可见在使用2种针对人pd-1/pd-l1信号通路的已上市药品中任何一种治疗后，明显的抑制了小鼠体内的肿瘤生长。具体对每项试验进行评估分析。实验1(见表5)中对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点(第26天)时均存活且体重增长良好，治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异，表明动物对keytruda耐受良好。对照组所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，而在实验终点时，治疗组6只小鼠中有2只小鼠在实验终点肿瘤消失。对照组平均肿瘤体积为3168±606mm3，而治疗组平均肿瘤体积为111±77mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，且与对照组的肿瘤体积相比具有显著差异(p＜0.05)，tgitv为102％。由此证明按照所述的给药方式，抗人pd-1抗体keytruda在b-hpd-1小鼠体内对肿瘤具有明显的抑制作用(tgitv＞60％)，具有较好的治疗和抑制肿瘤生长能力，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。表5实验2(见表6)中对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点(第32天，为分组后第24天)时均存活且体重增长良好，治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对keytruda耐受良好。与实验1类似，对照组所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，而所有治疗组24只小鼠中，有7只小鼠在实验终点肿瘤消失。在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为1589±652mm3，治疗组在10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg、0.3mg/kg剂量水平下的平均肿瘤体积分别为223±270mm3、277±397mm3、201±186mm3、437±515mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，且与对照组的肿瘤体积相比均具有显著差异(p＜0.05)。整体上看给药3周后得到最佳的治疗效果，停药后低剂量的治疗组出现明显的肿瘤生长。tgitv分别为92.4％、89.0％、94.0％、78.2％，表明不同剂量的抗人pd-1抗体keytruda对肿瘤具有明显的抑制作用(tgitv＞60％)且在b-hpd-1小鼠体内表现出不同疗效。表6实验3(见表7)中对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点(第20天)时均存活且体重增长良好，治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对tecentriq耐受良好。对照组所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，但在该剂量下治疗组并未出现治愈小鼠(即未出现肿瘤消失小鼠)。在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为824±315mm3，治疗组平均肿瘤体积为237±89mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，tgitv为79.7％。由此证明按照所述的给药方式，抗人pd-l1抗体tecentriq在b-hpd-1小鼠体内对肿瘤具有明显的抑制作用(tgitv＞60％)，表现出较强的抑制肿瘤生长能力，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。表7实验4(见表8)中对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点(第33天，即，分组后第24天)时均存活且体重出现增长，治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对tecentriq耐受良好。与实验3类似，对照组所有小鼠在实验过程中肿瘤持续生长，而所有治疗组15只小鼠中，有3只小鼠在实验终点肿瘤消失。在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为2464±1914mm3，治疗组在10mg/kg、3mg/kg、1mg/kg剂量水平下的平均肿瘤体积分别为219±326mm3、1028±963mm3、1044±432mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组。tgitv分别为97.2％、93.7％、61.2％，表明不同剂量的抗人pd-l1抗体tecentriq对肿瘤具有明显的抑制作用(tgitv＞60％)，剂量高的治疗效果越好。由此证明抗人pd-l1抗体tecentriq在b-hpd-1小鼠体内表现出的疗效不同。表8上述研究结果表明广泛使用的2种人pd-1/pd-l1抗体对b-hpd-1小鼠体内的肿瘤生长有明显的抑制和/或消除作用，由此证明人源化pd-1动物模型可被用于体内评估靶向pd-1/pd-l1药物的有效性，以及评估靶向pd-1/pd-l1的治疗效果。实施例11b-hpd-1基因人源化动物模型用于联合用药的药效检测临床研究证明，化疗药物对人体多种实体瘤有明显的效果，具有抗瘤谱广、作用强、与多种抗肿瘤药协同作用且无交叉耐药等特点。单克隆抗体联合化疗药在肿瘤治疗中是临床广泛应用的方法。本实施例选择有代表性的人pd-1抗体keytruda和人pd-l1抗体tecentriq与一线化疗药cisplatin联用，以验证b-hpd-1小鼠可用于针对人pd-1/pd-l1信号通路的抑制剂与其它药物的联合用药方面的研究。取b-hpd-1纯合小鼠(4-6周龄)，右侧皮下接种5×105小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1(同实施例10)后，待肿瘤体积约100mm3后随机分为6个对照组或治疗组(n＝7/组)。治疗组随机选择注射上述3种药物中的1种或2种，给药剂量为0.1-10mg/kg，对照组注射空白溶剂。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束实验。具体的给药或给药组合、剂量、给药方式和频率如表9所示。表9从测试结果上看，6组小鼠的体重变化(图18)在整个实验周期内均无明显区别，但从量瘤结果上看(图19、20)，对照组(g1)小鼠的肿瘤在实验周期内持续生长，5个治疗组(g2至g6)小鼠与对照组相比，肿瘤体积均出现不同程度的缩小，表明经过不同药物或药物联用治疗后，小鼠体内肿瘤生长受到明显抑制。具体对每项实验进行评估分析。表10中列出了主要数据和分析结果，具体包括分组时(接种后第8天)和分组10天后的肿瘤体积、实验结束时(接种后第25天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(tgitv)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(p值)。其中，使用cisplatin(g2)单独治疗小鼠的存活情况最差，死亡2只小鼠；其次是cisplatin与keytruda联用治疗组(g4)或与tecentriq联用治疗组(g6)，均死亡1只小鼠。而对照组(g1)或使用抗体的治疗组(g3、g5)在实验终点时均存活。在实验终点时，对照组(g1)平均肿瘤体积为1716±789mm3，单独使用cisplatin治疗组(g2)平均肿瘤体积为612±510mm3，单独使用keytruda治疗组(g3)平均肿瘤体积为1267±619mm3，cisplatin与keytruda联用治疗组(g4)平均肿瘤体积为496±160mm3，单独使用tecentriq治疗组(g5)平均肿瘤体积为1234±977mm3，cisplatin与tecentriq联用治疗组(g6)平均肿瘤体积为427±148mm3。可见cisplatin与keytruda联用治疗组(g4)的小鼠荷瘤体积明显小于单独使用cisplatin(g2)或keytruda(g3)；cisplatin与tecentriq联用治疗组(g6)的小鼠荷瘤体积明显小于单独使用cisplatin(g2)或tecentriq(g5)。实验结果表明化疗药cisplatin虽然具有一定的肿瘤抑制作用，但具有一定毒性，可导致小鼠死亡。此外，tgitv值也表明上述两种单克隆抗体和化疗药cisplatin联用的疗效优于单克隆抗体或化疗药单独使用的疗效。同时使用抗人pd-1抗体药keytruda或抗人pd-l1抗体药tecentriq，可以更高效的抑制肿瘤细胞的生长。表10以上实施例已证实b-hpd-1小鼠模型对现有的多种抗人pd-1/pd-l1抑制剂和化疗药物或联合用药，均有响应并表现出肿瘤生长抑制的剂量相关性。以下实施例将选择多个抗人pd-1/pd-l1抑制剂，以进一步的验证b-hpd-1小鼠可作为体内研究的活体替代模型，用于人pd-1/pd-l1信号通路调节剂的筛选、评估和治疗。实施例12b-hpd-1基因人源化动物模型用于抗人pd-1/pd-l1调节剂的筛选试验1：取b-hpd-1纯合小鼠(4-6周龄)，右侧皮下种5×105小鼠结肠癌细胞mc38-hpdl1(同实施例10)后，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择阳性对照药tecentriq或两种抗人pd-l1抗体中的1种，给药剂量均为3mg/kg，对照组注射空白溶剂。给药方式：腹腔注射，每2天给药1次，共给药8次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束实验。表11中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后10天时的肿瘤体积、实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(p值)。表11整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好，所有治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对所述3种抗体耐受良好。所有实验治疗组和对照组小鼠体重(图21)在整个实验周期内均无明显区别，但从量瘤结果上看(图22)，所有对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积呈现不同程度的缩小和/或消失，表明两种抗人pd-l1单抗具有不同的抑瘤作用，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。在实验终点时，对照组(g1)平均肿瘤体积为409±131mm3，tecentriq治疗组(g2)为75±113mm3，pdl1-ab1抗体治疗组(g3)为101±128mm3，pdl1-ab2抗体治疗组(g4)为232±88mm3，使用pdl1-ab1抗体治疗(g3)与tecentriq治疗组(g2)小鼠肿瘤体积大小差别不大，且g2、g3组与对照组(g1)的瘤体积相比均具有显著的差异(p＜0.05)，tgitv分别为112.2％、103.3％，而使用pdl1-ab2抗体治疗(g4)的小鼠肿瘤体积明显大于tecentriq治疗组(g2)及pdl1-ab1抗体治疗(g3)，表明在相同的给药剂量和频次下，抗人pdl1-ab1抗体与阳性对照品tecentriq药效相似，在抑制肿瘤生长上效果相当，而抗人pdl1-ab2抗体药效不如tecentriq或pdl1-ab1抗体。本实验证明了b-hpd-1小鼠可用于筛选靶向人pd-l1的药物(如，抗体)及体内药效检测。试验2：取b-hpd-1纯合小鼠(4-6周龄)，皮下接种小鼠结肠癌细胞mc38(5×105)，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝6/组)。治疗组随机选择5种抗人pd-1抗体中的1种，给药剂量均为10mg/kg，对照组注射空白溶剂。给药方式：腹腔注射，每3天给药1次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死。表12中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后10天时的肿瘤体积、实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(tumorgrowthinhibitionvalue，tgitv)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(p值)。表12整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好，且所有治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异，表明动物对所述5种抗体耐受良好。所有实验治疗组和对照组小鼠体重(图23)在整个实验周期内均无明显区别，但从量瘤结果上看(图24)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积呈现不同程度的缩小和/或消失，表明5种抗人pd-1单抗具有不同的抑瘤作用，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。证明了b-hpd-1小鼠可用于筛选靶向人pd-1的药物(如，抗体)及体内药效检测。实施例13双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定利用本方法或制得的b-hpd-1小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例8中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，可选择b-hpd-1小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到pd-1人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的b-hpd-1小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到pd-1人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。以双重人源化ctla-4/pd-1小鼠的生成为例。由于小鼠ctla-4与pd-1基因位于同一条染色体上(1条染色体)，在实施例8显微注射时，选择b-hctla-4小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化ctla-4/pd-1小鼠。选取1只双重人源化ctla-4/pd-1杂合子(6周龄)，另选2只野生型c57bl/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠cd3抗体，28h后脱颈安乐死后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入pbs溶液中和裂解反应，离心弃上清后用pbs清洗细胞1次，然后用鼠源ctla-4抗体mctla-4apc(图25a、25b、25c)或人源ctla-4抗体hctla-4pe(图25d、25e、25f)，或鼠源pd-1抗体mpd-1pe(图25g、25h、25i)或人源pd-1抗体hpd-1fitc(图25j、25k、25l)，和鼠源t细胞表面抗体mtcrβ对t细胞胞外蛋白同时进行染色，用pbs清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果如图25显示，与未经刺激和经过鼠cd3抗体刺激脾脏中t细胞激活后的c57bl/6小鼠相比，人源ctla-4抗体和人源pd-1抗体可以检测到人源化ctla-4/pd-1杂合子小鼠脾脏内表达人ctla-4和pd-1蛋白的细胞；而在c57bl/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人ctla-4或pd-1蛋白的细胞。以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。序　列　表<110>北京百奥赛图基因生物技术有限公司<120>一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用<130>pb710044n<160>38<170>patentinversion3.5<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列<400>1agggacctccagggcccattggg23<210>2<211>23<212>dna<213>人工序列<400>2cagaggtccccaatgggccctgg23<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列<400>3gtagaaggtgagggacctccagg23<210>4<211>23<212>dna<213>人工序列<400>4ccctcaccttctacccagcctgg23<210>5<211>23<212>dna<213>人工序列<400>5gcaccccaaggcaaaaatcgagg23<210>6<211>23<212>dna<213>人工序列<400>6ggagcagagctcgtggtaacagg23<210>7<211>23<212>dna<213>人工序列<400>7gttaccacgagctctgctccagg23<210>8<211>23<212>dna<213>人工序列<400>8gcaaaaatcgaggagagccctgg23<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9tagaaggtgagggacctcc19<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列<400>10ggaggtccctcaccttcta19<210>11<211>19<212>dna<213>人工序列<400>11caaaaatcgaggagagccc19<210>12<211>23<212>dna<213>人工序列<400>12gggctctcctcgatttttg19<210>13<211>132<212>dna<213>人工序列<400>13gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaat60agcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgct120tttaaaggatcc132<210>14<211>679<212>dna<213>人工序列<400>14atgctgaaggaagagccctgcttgttggaggttacttattcacaacctacaagaagctac60aagctcctaggtagggggaactgcttacgatattctgccctggaatgggtctgagagcac120attcctctccagggggttcagaaaagatgtcagaaagggtgtacaggctccttcctcaca180gctctttgttcttctgcatttcagaggtccccaatgggccctggaacccccccaccttct240ccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctcca300acacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggaca360agctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtca420cacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgaca480gcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcc540tgcgggcagagctcgtggtaacaggtgaggctagtagaacctacgtgggcaattccttcc600tgcccagagacctcttaggctctctgccatggctctgcctagagccttgacgacactgcc660cctctccctgtggaaatcc679<210>15<211>867<212>dna<213>人工序列<400>15atgtgggtccggcaggtaccctggtcattcacttgggctgtgctgcagttgagctggcaa60tcagggtggcttctagaggtccccaatgggccctggaacccccccaccttctccccagcc120ctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttcacctgcagcttctccaacacatcg180gagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagccccagcaaccagacggacaagctggcc240gccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggactgccgcttccgtgtcacacaactg300cccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagggcccggcgcaatgacagcggcacc360tacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcgcagatcaaagagagcctgcgggca420gagctcgtggtaacagagagaatcctggagacctcaacaagatatcccagcccctcgccc480aaaccagaaggccggtttcaaggcatggtcattggtatcatgagtgccctagtgggtatc540cctgtattgctgctgctggcctgggccctagctgtcttctgctcaacaagtatgtcagag600gccagaggagctggaagcaaggacgacactctgaaggaggagccttcagcagcacctgtc660cctagtgtggcctatgaggagctggacttccagggacgagagaagacaccagagctccct720accgcctgtgtgcacacagaatatgccaccattgtcttcactgaagggctgggtgcctcg780gccatgggacgtaggggctcagctgatggcctgcagggtcctcggcctccaagacatgag840gatggacattgttcttggcctctttga867<210>16<211>1972<212>dna<213>人工序列<400>16tgagcagcggggaggaggaagaggagactgctactgaaggcgacactgccaggggctctg60ggcatgtgggtccggcaggtaccctggtcattcacttgggctgtgctgcagttgagctgg120caatcagggtggcttctagaggtccccaatgggccctggaacccccccaccttctcccca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