导致单性结实坐果的经修饰的基因的制作方法

本发明涉及经修饰的基因，其能够诱导单性结实。本发明还涉及经修饰的基因在植物中诱导单性结实的用途，涉及获得经修饰的基因的方法，并且涉及鉴定这样的经修饰的基因的标记的用途。本发明还涉及具有能够诱导单性结构的经修饰的基因的植物，以及涉及获得此类植物的方法并且涉及获得单性果实的方法。通常在柱头授粉和随后胚珠受精之后在植物上形成果实。导致种子成形(seedset)和果实发育的授粉和受精的成功由复杂的过程调节，其中各种内源因素如激素、碳水化合物和各种酶发挥重要作用。已知涉及该机制的关键激素是例如细胞分裂素、脱落酸、乙烯、植物生长素、菜籽类固醇和赤霉素。每种激素的相关性在不同植物种之间差异很大。种子成形和果实发育是基础的和紧密相连的植物过程。因此，大多数情况下，果实形成需要受精作为启动的触发因素，控制和指导这些过程的内源因素正紧密相互作用。这种依赖性最有可能的原因在于果实的主要功能是在种子和胚的发育过程中保护它们。此外，果实的发育需要大量的能量，如果没有种子发育，这将是生物学上的浪费。另外，当例如可食用的果实被动物和人类吃掉时，果实可以作为促进成熟种子传播的方式。除了影响种子成形和果实发育的内源因素外，外源或环境因素也起着重要的作用。温度、干旱、大量水分、湿度、日长和营养物质的可获得性以及昆虫和疾病的存在可能会影响正常的花发育、配子形成、授粉、受精以及果实和种子发育。如果任何这些因素都不是最佳的，那么依赖于可获利产量的果实数量的种植者可能会面临收入的减少。由于大多数作物缺乏授粉、受精和/或种子发育，不会导致果实生长，早期果实发育期间的有利条件对获得最佳产量至关重要。在几种作物中，已经尝试获得没有种子的果实，因为这通常是消费者欣赏的非常理想的特征。此外，获得无籽果实的可能性对于种植者而言也是有利的，因为他们对环境状况的依赖越来越小。无籽果实也可能是加工业的主要优点，因为在加工过程中不需要从果实中除去种子。显然，无籽果实的发育并不是一个容易达成的目标，因为这些果实缺乏受精和种子形成，这是启动果实发育的常见触发因素。然而，在一些作物中，这一目标已经达成。对于一些作物，可以通过生长调节剂如植物生长素、细胞分裂素或赤霉酸的外源施用来诱导单性果实的发育。但是，这具有各种负面的方面，因为它增加成本，可能导致果实变形或其他缺陷，并不总是被消费者所欣赏。另外，这种外源诱导的单性结实只能在某些作物中起作用。获得无籽果实的另一种方法是使用三倍体，这是例如香蕉和西瓜中的常见方法。然而，这使得培育复杂化，因为需要营养繁殖(香蕉)或使用四倍体亲本(西瓜)。另外，在西瓜中需要授粉诱导果实发育。获得无籽果实的另一个选择是使用或修饰作物的单性结实的遗传能力，这是在没有授粉或受精的情况下坐果(setfruit)的能力。在黄瓜、柑橘和某些种类的葡萄中已成功开发，并且在番茄中也是可能的。当具有兼性单性结实能力的植物柱头授粉时，果实仍然会发生种子成形(setseed)，但在没有授粉的情况下，就会发育成无籽果实。在具有专性单性结实的植物中，即便授粉也不会导致种子成形。当具有单性结实的目的是获得没有种子的果实，而不是在困难的环境条件下获得果实时，必须发现阻止授粉的手段。例如通过使用全雌植物、自交不亲和性或雄性不育来达到阻止授粉。在某些作物中，开发无籽果实的愿望是高度优先的，但到目前为止，还没有能够通过利用遗传基础来实现这一愿望。这些作物之一是甜瓜(cucumismelo)，其包括许多果实类型。甜瓜植物显示各种性别表现表型，从全雌性到全雌雄同株，其中最常见的是雌雄同株的和雄全同株的。遗憾的是，与相关种黄瓜(cucumissativus)不同，没有发现天然的单性结实。但是不能将黄瓜和甜瓜相互杂交以例如从黄瓜将单性结实渐渗入甜瓜。本发明的目的是提供在植物中诱导单性结实的遗传基础。在得到本发明的研究期间，产生了显示单性结实坐果(fruitset)的突变体甜瓜植物。发现这种单性结实是pin4基因中突变的结果。因此，本发明涉及经修饰的pin4基因，其野生型如seqidno.1所示，编码seqidno.5的蛋白质，或者其野生型编码与seqidno.5具有至少80％的序列相似性的蛋白质，作为修饰的结果，所述经修饰的pin4基因编码包含氨基酸改变的蛋白质，并且当经修饰的蛋白质存在于植物中时，该经修饰的蛋白质能够诱导单性结实坐果。氨基酸改变是如与蛋白质的野生型氨基酸序列相比。在一个实施方案中，所编码的野生型蛋白质的序列相似性按照增加的优先次序为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。本领域技术人员熟悉计算序列相似性的方法。使用序列同一性和相似性(sias)工具(其可以在imed.med.ucm.es/tools/sias访问)适当地计算序列相似性。对于相似性计算，考虑到所述位点上图中所示的氨基酸的默认相似性，使用基于其物理化学性质的氨基酸分组。本发明还涉及经修饰的pin4基因，其野生型编码如seqidno.5或seqidno.12或seqidno.13或seqidno.14或seqidno.15或seqidno.16所示的蛋白质，所述经修饰的pin4基因编码经修饰的蛋白质，作为修饰的结果，该经修饰的蛋白质在蛋白质结构的细胞内环中包含氨基酸改变，并且当经改变的蛋白质存在于植物中时，该经改变的蛋白质能够诱导单性结实坐果。pin-formed(pin)蛋白家族是一组植物生长素外排转运蛋白，其调节外排自细胞的植物生长素，因此对植物发育中各种过程期间植物生长素的时间和空间分布至关重要。pin蛋白家族已经在各种作物中进行了研究，显然pin基因参与不同的发育过程，包括胚胎发生、枝和根的形态发生以及向性反应(tropicresponse)。显示pin基因的直向同源物的沉默或下调可以在不同作物种中具有不同的作用。番茄中rnai介导的slpin3和slpin4的共沉默对植物的营养表型产生强烈的影响，而对果实发育没有重大影响(pattisonandcatala,theplantjournal(2012)70,585-598.evaluatingauxindistributionintomato(solanumlycopersicum)throughananalysisofthepinandaux/laxgenefamilies.blackwellpublishingltd.)。另一项研究表明，slpin4(其为番茄子房和果实中最高表达的pin基因)表达的下调导致专性或兼性的单性结实(mounetetal,journalofexperimentalbotany,2012.down-regulationofasingleauxineffluxtransportproteinintomatoinducesprecociousfruitdevelopment。可在www.jxb.oxfordjournals.org在线获得)。然而，一项较早的研究表明，拟南芥(arabidopsis)中的atpin1或atpin3突变体(其为拟南芥子房中最高表达的pin基因)并没有导致单性结实表型。甜瓜是其中不能通过植物生长素的外源施用而容易地诱导单性结实坐果的作物。因此，预计植物生长素外排调节剂中的单一突变不会直接导致诱导单性结实坐果。根据本发明鉴定的突变非常出乎意料地显示出非常好的单性结实坐果。因此，本发明提供了经修饰的pin4基因，当其存在于基因组中时，所述经修饰的pin4基因导致其编码蛋白质中的氨基酸改变，当经修饰的蛋白质存在于植物中时，所述经修饰的蛋白质导致诱导单性结实。在本申请中，术语“修饰”或“经修饰的”是指野生型pin4基因的编码序列中的改变，其导致野生型基因的经修饰或经改变的形式。编码序列中的改变进而导致编码蛋白质中的氨基酸改变，并因此导致经修饰的pin4蛋白。如本文所用，“野生型”是指其会在自然界中存在的生物、株/品系(strain)、基因、特征或性状的形式，并且与例如突变形式或经修饰的形式形成对比。pin蛋白可以分为两种，通常称为“长”和“短”pin蛋白。pin蛋白的共同结构特征是存在通过细胞内亲水性环分开的两个疏水性跨膜结构域。环的长度决定了pin的类型，因而与“短”pin蛋白相比，“长”pin蛋白的环要长得多。跨膜结构域的结构和序列在所有pin蛋白质中是高度保守的。然而，环的序列和结构显示出更多的变异，尽管也可以在环中鉴定氨基酸残基的保守片段(stretch)。这种保守和变异是将pin蛋白分类归并成八组的基础。pin4属于“长”pin蛋白类型，并且分类归并于组7中，pin3和pin7也属于改组(kreceketal,genomebiology2009,10:249.thepin-formed(pin)proteinfamilyofauxintransporters.biomedcentralltd.。可在genomebiology.com/2009/10/12/249在线获得)。一般来说，pin4蛋白的细胞内环起始于约氨基酸位置150，并结束于约氨基酸位置500。seqidno.5和特别是seqidno.12-16的细胞内环起始于位置153。seqidno.5和12的细胞内环结束于位置496。seqidno.13的细胞内环结束于位置501，seqidno.14的细胞内环结束于位置509，seqidno.15的细胞内环结束于位置510，而seqidno.16的细胞内环结束于位置513。在得到本发明的研究过程中，在甜瓜的pin4基因中鉴定了许多ems诱导的snp突变。鉴定的snp中的5个导致蛋白质的氨基酸改变，并且一个导致终止密码子(表1)。表1：pin4的snp突变和对所编码的pin4蛋白序列的影响。位置如同在甜瓜seqidno.1(cmpin4基因组dna(gdna)野生型)、seqidno.2(cmpin4编码dna序列(cds)野生型)和seqidno.5(cmpin4蛋白野生型)的序列中。在温室中进行包含这些和其他snp突变的甜瓜植物的表型分型(实施例2)。授粉得到阻止，能够观察到单性结实坐果。最初观察到，表1中列出的经诱导的snp中的两种在没有授粉的情况下导致单性结实坐果。在具有id320的植物(其在对应于cds的位置497的gdna的位置997上包含c至t的snp)和具有id431的植物(其在对应于cds的位置1240的gdna的位置1740上包含g至a的snp)中发现了单性结实坐果。在随后的表型分型中，在具有id363的植物(其在对应于cds的位置884的gdna的位置1384上包含c至a的snp)中也发现了单性结实坐果(表1；图1，seqidno.3和4，以及seqidno.17)。所述c至t的snp导致野生型cmpin4蛋白的位置166上的脯氨酸(p)至亮氨酸(l)的氨基酸改变。所述g至a的snp导致野生型cmpin4蛋白的位置414上的谷氨酸(e)至赖氨酸(k)的氨基酸改变。所述c至a的snp导致野生型cmpin4蛋白的位置295上的丝氨酸(s)至酪氨酸(y)的氨基酸改变(图2，seqidno.5-7和seqidno.18)。在一个实施方案中，本发明提供经修饰的pin4基因，作为修饰的结果在pin4蛋白的细胞内环中具有氨基酸改变，经改变的蛋白质导致诱导植物中单性结实。本发明还涉及所述经修饰的pin4基因的经修饰的蛋白质。在一个实施方案中，蛋白质中的氨基酸改变是导致pin4蛋白环的结构修饰的改变，经修饰的蛋白质结构导致诱导植物中单性结实。预期经修饰的蛋白质结构会影响蛋白质的功能性，从而导致诱导单性结实。在具体实施方案中，蛋白质中的氨基酸改变是从不带电或带负电的氨基酸向带正电的氨基酸的改变。在另一个实施方案中，蛋白质中的氨基酸改变是从不带电的非疏水性氨基酸到疏水性氨基酸的改变。某些氨基酸置换产生保守的改变，这意味着它们导致功能上等同的蛋白质。可以基于化学性质(例如残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性或两性性质的相似性)进行保守性氨基酸置换，在这种情况下所得蛋白质可以仍然正常发挥作用。氨基酸置换可能发生在不显著影响蛋白质结构或功能的蛋白质区域。相反，发生在对于蛋白质的结构和/或功能必不可少的十分保守或不变位置处的氨基酸置换，或不共有保守性化学性质的氨基酸的置换(例如疏水的vs.带电的vs.极性的)，可能导致非保守性氨基酸改变。在本发明的研究期间，所鉴定的并导致单性结实坐果的蛋白质修饰包括蛋白质结构的细胞内环中的氨基酸改变。也位于蛋白质环中、似乎会导致保守性改变的其他两个氨基酸置换并没有导致诱导单性结实。cmpin4蛋白的位置166处从p到l的氨基酸改变导致在该位置处高度保守性氨基酸的变化。该氨基酸位于环结构的开始处，并且已知脯氨酸是蛋白质结构测定的重要因素。在该位置的氨基酸改变很可能导致蛋白质结构的改变，更具体地说在这种情况下导致细胞内环的结构中的改变。cmpin4蛋白的位置295处从s到y的氨基酸改变导致在该区域高度保守的氨基酸片段末端处保守性氨基酸的修饰。该修饰是从极性不带电氨基酸到疏水性氨基酸的改变。此外，cmpin4蛋白质的蛋白质位置414处从e到k的氨基酸改变与来自表1的其他氨基酸改变是不同的，因为发现该修饰中涉及的氨基酸具有带有相反电荷的残基。作为其结果，该位置处氨基酸的电荷从负(e)变为正(k)。环中或该区域中的电荷改变也很可能对pin4蛋白质的细胞内环的3d结构有影响。环是pin蛋白的主要部分，其建立与底物或其他蛋白质的相互作用以在其涉及的各种发育过程中发挥其功能。预期这种结构中的微小改变不会直接导致基因表达或活性的下调或沉默。然而，环结构中的改变很可能影响蛋白质的功能，例如在底物识别或与下游过程中的其它蛋白质的相互作用中。因此，不希望受到理论的约束，因此预期在鉴定的突变体中，该环结构中的改变已导致蛋白质功能的变化，这种变化已经导致诱导单性结实。例如，蛋白质功能的变化可能导致植物生长素在子房中的积累，从而刺激果实发育。在氨基酸中，赖氨酸(k)、组氨酸(h)和精氨酸(r)带正电。带负电的氨基酸是谷氨酸(e)和天冬氨酸(d)；所有其他氨基酸都不带电。当pin4蛋白的细胞内环内的带负电的氨基酸(即e或d)或不带电的氨基酸被改变成带正电的氨基酸(即k、h或r)时，预期这会导致蛋白质环内的结构改变。结构改变影响蛋白质功能，其在本发明的植物中导致诱导单性结实。在一个实施方案中，本发明的蛋白质的氨基酸改变通过pin4基因中的单一snp获得，并且特别是从脯氨酸(p)到亮氨酸(l)的改变，或者是从谷氨酸(e)到赖氨酸(k)的改变，或者是从丝氨酸(s)到酪氨酸(y)的改变。如前所述，跨膜结构域的结构在所有pin蛋白中都是高度保守的。然而，环的序列和结构也显示出保守性片段。不同作物中pin4直向同源物的鉴定和pin蛋白的多重序列比对已经揭示了在本发明中修饰的氨基酸对于所有已知的直向同源pin蛋白确实是高度保守的(结果未显示)，并且特别是对于所有pin4蛋白质。进一步检查seqidno.5的位置的区域显示所有直向同源pin4蛋白的相应区域含有qnge(表2，seqidno.8)或qngd(seqidno.9)氨基酸片段，这意味着位置414或直向同源蛋白中的相应位置上的电荷总是为负的。该片段中从e或d到带正电的氨基酸、优选从e到k(seqidno.10)或从d到h(seqidno.11)的氨基酸改变将因此导致蛋白质这一区域中三级结构的改变。表2：pin4野生型以及导致单性结实的经修饰的氨基酸序列片段在pin4蛋白的环中的保守氨基酸片段qngeseqidno.8qngdseqidno.9导致单性结实的经修饰的氨基酸片段qngkseqidno.10qnghseqidno.11因此，本发明在一个实施方案中涉及在细胞内环的高度保守的qnge或qngd氨基酸片段中具有从e到k或从d到h的氨基酸改变的pin4蛋白，当经改变的蛋白质存在于植物中时，该经改变的蛋白质导致诱导单性结实。qnge或qngd片段优选如同发现于seqidno.5的位置411-414，其中e位于位置414，或在具有seqidno.12-16(图3)的直向同源物的相应位置上。相应的位置如下：seqidno.12的位置411-414；seqidno.13的位置413-416；seqidno.14的位置417-420；seqidno.15的位置413-416；seqidno.16的位置416-419。因此，那些蛋白质中e或d的位置分别涉及seqidno.12中的位置414；seqidno.13中的位置416；seqidno.14中的位置420；seqidno.15中的位置416；seqidno.16中的位置419(表3)。在另一个实施方案中，本发明涉及脯氨酸(p)的非保守性氨基酸置换，优选seqidno.5的cmpin4蛋白的位置166或如seqidno.12-16所示的直向同源蛋白的位置166的脯氨酸。优选地，该保守的脯氨酸被亮氨酸或任何其它将改变编码的pin4蛋白的结构和/或功能的非保守性氨基酸改变所置换。本领域技术人员熟悉对于给定氨基酸将是非保守性氨基酸改变的置换。seqidno.5的位置295突变s至y的氨基酸区域的进一步分析表明，在该区域的直向同源pin4蛋白质序列中，发现几乎相同的氨基酸片段以任意sa(在seqidno.5、12和13中)或者任意ca(seqidno.14、15和16中)结尾。在seqidno.5、12和13中，在位置295处发现了丝氨酸(s)。在seqidno.14、15和16中，在蛋白质的位置290处发现了半胱氨酸(c)。在一个实施方案中，本发明涉及导致在seqidno.5、12或13的位置295处的丝氨酸(s)；或在seqidno.14、15或16位置290处的半胱氨酸(c)的非保守性氨基酸置换的突变。该置换优选用具有不同化学性质的氨基酸，例如疏水性或带电的氨基酸。在具体实施方案中，突变导致用酪氨酸(y)的置换。表3：导致单性结实坐果的pin4蛋白和突变位置实例本发明首次将pin4基因本身的遗传修饰与单性结实坐果的诱导联系起来。虽然在本研究过程中鉴定出的pin4突变说明了上述cmpin4基因突变与本发明性状之间的成因作用，这些肯定不是导致本发明性状的pin4基因的仅有的突变，因此本发明不限于这些具体的突变，而是扩展到所有其它修饰，特别是导致在植物中表达时具有相同的单性结实坐果作用的pin4基因本身的dna序列中的突变。本发明可广泛适用于其基因组中具有cmpin4基因的功能同源物(即执行相同或相似生物学功能的同源物)的所有植物种和作物。可以在许多作物中鉴定pin4直向同源物(即其他种中的pin4基因)，其方法是本领域已知的。在本研究中，使用基本局部比对搜索工具(basiclocalalignmentsearchtool，blast)程序来比较甜瓜相对于其他植物基因组序列的pin4dna和蛋白质序列。这导致了许多候选pin4直向同源基因的鉴定。通过blastx或blastp，作为对甜瓜pin4蛋白序列的相互最佳命中，鉴定了一些植物种的直向同源pin4蛋白序列。通过该方法鉴定了pin4直向同源物的蛋白质序列。使用clustal对蛋白质序列的多重序列比对证实这些是直向同源pin4蛋白(图4)。在一个实施方案中，本发明涉及甜瓜、黄瓜、西瓜、番茄、茄子或辣椒的pin4基因的经修饰的形式，由此pin4基因的经修饰的形式导致经修饰的pin4蛋白。特别地，本发明涉及甜瓜的经修饰的pin4基因。一旦直向同源pin4基因的dna序列及其编码的pin4蛋白已知，则该信息可用于使用本文所述的方法调节或修饰由所述基因编码的蛋白质。在一个实施方案中，本发明涉及包含本文公开的经修饰的pin4基因的植物，该植物显示由于存在经修饰的pin4蛋白而产生的单性结实坐果。经修饰的pin4基因可以杂合或纯合形式存在。在一个实施方案中，包含本发明的经修饰的pin4基因和/或经修饰的pin4蛋白并且显示单性结实坐果的植物是以下任意种的植物：甜瓜、黄瓜、西瓜、番茄、茄子或辣椒。优选地，本发明的植物是甜瓜植物。任选地，如本文所述的pin4基因和/或pin4蛋白的修饰可以彼此组合，或与相同基因或另一基因中的另一种修饰组合以获得单性结实表型。涉及本发明植物的如本文所用的单性结实或单性结实坐果是无需授粉而发生的坐果。在授粉后，本发明的植物优选确实在果实中发育有活力的种子。本发明的单性结实是兼性单性结实的形式，因为它允许一授粉就产生种子，这是有利的。单性结实坐果的能力意味着，当花没有授粉时植物可以形成单性果实，而在授粉后可以发育成具有种子的常规果实。可以各种方式阻止授粉。从雌雄同株(或“完美”)花以及从雄花，花药可以进行去雄。雄花还可以部分或完全去除以得到花药的非功能性。或者，可以使用或诱导雄性不育，其可以是遗传性雄性不育、细胞质雄性不育、位置或功能雄性不育，或任何导致雄性不育的其它替代方式。对于全雌(gynoecious即all-female)植物的雌花，必须注意，附近没有存在具有有活力花粉的相同种的植物，和/或周围没有授粉昆虫。在具体情况下，雌花或植物可以封闭或生长在受保护的环境中，使得花粉不能到达柱头以导致授粉和受精。在具有分开的雄花和雌花的雌雄同株植物中，雌花可以被覆盖或封闭以阻止授粉，或者雄花可以去雄或去除。本发明进一步提供了一种包含如本文所公开的经修饰的pin4基因和pin4蛋白的甜瓜植物，其中，雌花在没有授粉的情况下坐果。在具体实施方案中，在完全开花之前，花药或雄花不发育或发育不全。在一个实施方案中，本发明涉及包含经修饰的pin4基因的甜瓜植物，其中所述修饰产生经修饰的pin4蛋白，特别是在细胞内环中具有非保守性修饰的pin4蛋白，所述修饰导致单性结实坐果的能力。在一个实施方案中，本发明涉及甜瓜植物，作为pin4基因中seqidno.2的位置497或位置1240或位置884的snp，特别是位置497处的c至t的snp、或位置1240处的g至a的snp、或位置884处的c至a的snp的结果，所述甜瓜植物能够单性结实坐果。在一个实施方案中，本发明涉及甜瓜植物，作为具有seqidno.5的位置166或位置295或位置414处的修饰，特别是由seqidno.6表示的位置166处的p至l的修饰、或由seqidno.18表示的位置295处的s至y的修饰、或由seqidno.7表示的位置414处的e至k的修饰的pin4蛋白的结果，所述甜瓜植物能够单性结实坐果。本发明还涉及本发明的经修饰的pin4基因在植物中、特别是在以下种的植物：甜瓜、黄瓜、西瓜、番茄、茄子或辣椒中、更特别是在甜瓜植物中诱导单性结实的用途。经修饰的pin4基因可以从包含经修饰的pin4基因的植物渐渗入缺乏经修饰的pin4基因但具有其他期望性状的植物中，当植物性亲和(sexuallycompatible)时使用杂交，任选地与有助于有活力的种子发育或者促进发育成植物的技术组合。本发明的经修饰的pin4基因的用途包括通过将基因从包含经修饰的pin4基因并具有单性结实坐果的能力的供体植物渐渗入缺乏经修饰的pin4基因的受体植物中的用途。经修饰的pin4基因的渐渗导致在受体植物中单性结实坐果的能力。在具体实施方案中，可以使用标准育种技术从包含本文公开的经修饰的pin4基因的甜瓜植物将经修饰的pin4基因渐渗入缺乏经修饰的pin4基因的甜瓜植物。从携带经修饰的pin4基因的植物中获得本发明的单性结实性状的植物的选择开始于f1或来自受体植物和供体植物之间的杂交的任何其它代，适当地使用基于对性状内在的pin4基因的修饰的分子标记。本领域技术人员熟悉产生并使用分子标记来鉴定此类修饰。在具体实施方案中，合适的分子标记的实例是鉴定根据seqidno.1的甜瓜的pin4基因中的snpc997>t997或snpg1740>a1740或snpc1384>a1384的标记。这样的标记可以是包含待鉴定的snp的snp标记，或本领域技术人员可以基于性状内在的基因组的修饰来设计的任何其它分子标记。用于鉴定基因组变异或修饰的其他常规使用的分子标记是例如但不限于rflp、sslp、aflp、rapd、vntr、ssr、str、dart和rad标记。本发明还涉及分子标记用于鉴定pin4基因中的修饰的用途，所述修饰导致植物中单性结实坐果的能力，优选用于鉴定seqidno.2的位置497或位置1240或位置884处的snp的标记，或者用于鉴定导致seqidno.5的位置166或位置414或位置295处的氨基酸置换的snp，或者用于鉴定导致seqidno.12-16的对应位置处的氨基酸置换的snp的标记。这样的标记可以是包含待鉴定的snp的分子标记，或者当待鉴定的修饰的位置已知时，本领域技术人员可以容易地设计的另一标记。在具体实施方案中，本发明涉及基于或包含cmpin4基因的snpc997>t997或snpg1740>a1740或snpc1384>a1384的标记的用途，或基于或包含如本文所鉴定的直向同源基因(编码seqidno.12-16的蛋白质)相应位置上相应的snp。或者，经修饰的pin4基因的选择开始于f2或任何杂交或回交的任意进一步的代。f2中植物的选择可以任选地基于单性结实坐果的观察从表型分型上完成以及通过使用直接或间接检测性状内在pin4基因的修饰的分子标记来完成。当杂合或纯合存在导致诱导单性结实坐果时，具有经修饰的pin4基因的植物的选择也可以开始于f3或更后的代。杂交任选地可以随后进行胚拯救技术或导致成功组合和渐渗的其它技术，所述技术是本领域技术人员已知的。本发明还涉及由本发明的植物产生的果实，所述植物包含如本文公开的经修饰的pin4基因。果实适宜地是无籽果实(其在没有授粉的情况下在本发明的植物上发育得到的)或者有籽果实(其在授粉后在本发明的植物上发育得到的)。该果实的种子仍然包含本发明的经修饰的pin4基因，因此也构成本发明的一部分。如本文所使用的，无籽果实是在没有授粉的情况下发育得到的果实，因此在果实中没有形成有活力的种子。在一些情况下，可以观察到一些不发育的种子，但是由于这些不是受精的，因为没有发生授粉，这些不是正常发育的种子，并且当播种时不会萌发。本发明还涉及生产无籽果实、特别是无籽甜瓜果实的方法，包括提供具有导致单性结实坐果的能力的经修饰的pin4基因的植物，种植所述植物，以及使得果实在没有授粉的情况下发育。生产的果实和果实的部分(任选以加工形式的)也是本发明的一部分。本发明还涉及本发明的植物的用途，所述植物包含用于生产无籽果实、特别是用于生产无籽甜瓜果实的经修饰的pin4基因。本发明还涉及包含作为繁殖材料来源的经修饰的pin4基因的本发明植物的用途。本发明还涉及包含经修饰的pin4基因的本发明植物在植物育种中的用途。本发明还涉及所要求保护的植物的细胞。这样的细胞可以是分离形式，也可以是完整植物或其部分的一部分，然后仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞含有导致诱导单性结实的经修饰的pin4基因。本发明植物的每个细胞携带导致诱导单性结实的遗传信息。本发明这样的细胞还可以是可再生的细胞，其可用于再生本发明的新植物。本发明还涉及所要求保护的植物的组织。组织可以是未分化的组织或已经分化的组织。未分化的组织是例如茎尖、花药、花瓣、花粉，并且可以用于微体繁殖以获得生长成本发明的新植物的新的小植物。组织也可以从本发明的细胞生长。根据其另一方面，本发明涉及种子，其中可从种子生长的植物是本发明的植物，其包含导致诱导单性结实的经修饰的pin4基因。本发明还涉及可以在授粉后获得的所要求保护的植物的种子。种子含有经修饰的pin4基因，当植物从种子生长时，使得该植物成为本发明的植物。本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织和种子的后代，后代包含导致诱导单性结实的经修饰的pin4基因。这样的后代本身可以是植物、细胞、组织或种子。如本文所用，词“后代”意指来自与本发明植物的杂交的第一个和所有进一步的后代，所述植物具有导致单性结实坐果的能力的经修饰的pin4基因。“后代”还涵盖携带本发明经修饰的pin4基因并具有本发明的性状的植物，并且通过营养繁殖(propagation或multiplication)从本发明的其它植物或植物后代获得。本发明的后代适当地包含经修饰的pin4基因和经修饰的pin4蛋白质和本发明的性状。本文所用的本发明性状是由于存在经修饰的pin4基因和/或经修饰的pin4蛋白而在没有授粉的情况下单性结实坐果的能力。因此，本发明进一步涉及适用于有性生殖的所要求保护的植物的部分。此类部分例如选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚囊和卵细胞。此外，本发明涉及适用于营养繁殖的所要求保护的植物的部分，其特别是插条、根、茎、细胞、原生质体。如上所述的植物的部分被认为是繁殖材料。从繁殖材料生产的植物包含导致单性结实坐果的能力的经修饰的pin4基因。根据其另一方面，本发明提供了携带本发明的经修饰的pin4基因的植物的组织培养物，其也是繁殖材料。组织培养物包含可再生细胞。这种组织培养物可以从植物的任何部分，特别是叶、花粉、胚、子叶、下胚轴、分生细胞、根、根尖、花药、花、种子和茎来选择或衍生。组织培养物可以再生成携带本发明的经修饰的pin4基因的植物，再生植物表达本发明的性状，也是本发明的一部分。本发明还涉及杂交种子(hybridseed)和生产这种杂交种子的方法，包括使第一亲本植物与第二亲本植物杂交并收获所得杂交种子，其中所述第一亲本植物和/或所述第二亲本植物具有经修饰的pin4基因。所得到的包含本发明的经修饰的pin4基因并显示本发明性状的杂交植物也是本发明的植物。在一个实施方案中，包含纯合或杂合的经修饰的pin4基因的本发明植物是自交系(inbredline)、杂交子(hybrid)、二倍体化单倍体(doubledhaploid)的植物或分离群体的植物。本发明还涉及用于生产具有导致单性结实坐果的能力的经修饰的pin4基因的植物的方法，其通过使用包含经修饰的pin4基因的种子用于生长所述植物。本发明还涉及种子生产的方法，包括从本发明的种子种植植物，允许植物通过允许授粉产生种子并收获这些种子。通过杂交或自交适当地进行种子的生产。优选地，如此产生的种子具有在其长成的植物中单性结实坐果的能力。在一个实施方案中，本发明涉及通过使用在其基因组中携带导致单性结实坐果的能力的经修饰的pin4基因的植物材料的组织培养来生产具有经修饰的pin4基因的植物的方法。本发明还涉及通过使用在其基因组中携带导致单性结实坐果的能力的经修饰的pin4基因的植物材料的营养繁殖来生产具有经修饰的pin4基因的植物的方法。本发明还提供了通过使用二倍体化单倍体生成技术以从包含经修饰的pin4基因的植物产生二倍体化单倍体系来生产具有经修饰的pin4基因的植物的方法。在一个实施方案中，本发明涉及生产能够单性结实坐果的植物的方法，其包括修饰seqidno.1的cmpin4基因，或修饰编码具有在seqidno.12-16中发现的任何序列的蛋白质的所述pin4基因的直向同源物，其中所述修饰导致编码蛋白质中的氨基酸置换，并且经修饰的蛋白质导致诱导单性结实坐果。经修饰的蛋白质适当地在蛋白质的细胞内环中具有修饰。所述修饰可以导致蛋白质的细胞内环的修饰结构和/或蛋白质功能性的改变，其为植物提供单性结实坐果的能力。可以通过诱变引入pin4基因的修饰。诱变包括通过一种或多种化学化合物，例如甲磺酸乙酯(ems)、亚硝基甲基脲、羟胺、原黄素、n-甲基-n-亚硝基胍、n-乙基-n-亚硝基脲、n-甲基-n-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、氨基甲酸酯、苯酚和环氧乙烷，和/或物理手段，例如紫外线照射、快中子暴露、x射线、γ辐照，和/或通过插入遗传元件，例如转座子、t-dna、逆转录病毒元件。诱变还包括通过同源重组、基于寡核苷酸的突变诱导，锌指核酸酶(zfn)、转录激活物样效应核酸酶(talen)或成簇的规律间隔的短回文重复序列(crispr)系统来更具体地靶向引入至少一个修饰。在一个实施方案中，本发明涉及包含如本文所公开的经修饰的pin4基因的植物，其中通过使用tilling获得和/或鉴定经修饰的pin4基因。在一个实施方案中，经修饰的pin4基因是外源pin4基因，其可以通过反式基因化方法(transgenicmethod)或顺式基因化方法(cisgenicmethod)引入植物。使用本发明的经修饰的pin4基因来生产能够单性结实坐果的植物包括通过反式基因化或顺式基因化方法引入经修饰的外源pin4基因。附图图1：甜瓜(cucumismelo)的pin4基因的野生型gdna(seqidno.1)和cds(seqidno.2)序列。seqidno.3显示了在甜瓜的位置497(gdna的位置997)处具有c至t的snp的cds。seqidno.4显示了在甜瓜的位置1240(gdna的位置1740)处具有g至a的snp的cds。seqidno.17显示了在甜瓜的位置884(gdna的位置1384)处具有c至a的snp的cds。图2：甜瓜的pin4蛋白的野生型蛋白质序列(seqidno.5)。seqidno.6给出在位置166上具有p至l氨基酸改变的经修饰的蛋白质。seqidno.7给出在位置414上具有e至k氨基酸改变的经修饰的蛋白质。seqidno.18给出在位置295上具有s至y氨基酸改变的经修饰的蛋白质。图3：直向同源cmpin4蛋白的蛋白质序列：seqidno.12：黄瓜(cucumissativus)；seqidno.13：西瓜(citrulluslanatus)；seqidno.14：辣椒(capsicumannuum)；seqidno.15：茄子(solanummelongena)；seqidno.16：番茄(solanumlycopersicum)。图4：经比对的pin4蛋白质序列：甜瓜(cucumismelo)(甜瓜)-seqidno.5；黄瓜(cucumissativus)(黄瓜)-seqidno.12；西瓜(citrulluslanatus)(西瓜)-seqidno.13；辣椒(capsicumannuum)(辣椒)-seqidno.14；茄子(solanummelongena)(茄子)-seqidno.15；番茄(solanumlycopersicum)(番茄)-seqidno.16。下面的符号在比对的下方使用：*--该列中的所有残基都相同:--观察到保守的置换.--观察到半保守的置换--没有匹配(空格)图5：具有经修饰的pin4基因的甜瓜植物产生的无籽甜瓜果实。图5a显示切成两半的果实；图5b显示了无籽果实的切片。图6：野生型pin4蛋白的序列同一性和序列相似性：甜瓜(cucumismelo)(甜瓜)-seqidno.5；黄瓜(cucumissativus)(黄瓜)-seqidno.12；西瓜(citrulluslanatus)(西瓜)-seqidno.13；辣椒(capsicumannuum)(辣椒)-seqidno.14；茄子(solanummelongena)(茄子)-seqidno.15；番茄(solanumlycopersicum)(番茄)-seqidno.16。使用考虑缺口的方法计算序列同一性；序列相似性基于具有相似性质的氨基酸的分组。有关这两个选项，请参见sias方法。实施例实施例1通过ems诱导甜瓜中的snp突变在甜瓜植物群中诱导snp突变，其目的是获得单性结实的甜瓜果实。将约10000个甜瓜基因型种子分成两批，用不同的ems剂量处理。对于其中一批，使用1.0％的剂量，而另一批使用1.5％的ems。种子萌发，从其中选出77个，制作插条(cutting)用于进一步分析。进行表型分型(实施例2)，并获得dna样品用于经诱导的突变的进一步表征和验证。许多经诱导的突变的表征显示，经诱导的snp突变中六个snp突变位于pin4基因中(表1)。基于这些突变，开发snp标记用于进一步分析。实施例2采用pin4突变对甜瓜植物进行表型分型在温室中观察到具有由ems诱导的突变的植物的插条。该表型分型试验的目的是确定单性结实坐果的存在。因此，阻止了雌花授粉。在突变事件的两个事件中第一表型分型试验(由植物编号320和431(表1)鉴定，其中每个事件由具有相同突变的若干插条表示)中，观察到单性结实坐果。单性结实果实显示出合理的大小，并且具有从9到15的非常好的白利糖度。果实正常成熟并具有与原始亲本相当的味道。非授粉果实没有种子。此外，在通常种子腔的位置没有观察到空腔(图5)。突变体植物的进一步表型分型还鉴定了由编号363(表1)鉴定的植物的插条中的单性结实坐果。经鉴定的植物的雌花似乎正常发育。这些植物的雄性花则败育或者没有正常发育。用来自原始亲本的花粉授粉后，则发育成具有种子的果实，表明这些突变体植物具有兼性单性结实。实施例3辣椒中的pin4突变辣椒植物群也被ems处理。对dna进行取样并进行特异性分析，以鉴定辣椒的pin4基因中的突变。鉴定出许多突变，其导致如seqidno.14所示的capin4蛋白的细胞内环的氨基酸改变(图3；表4)。辣椒植物中经修饰的蛋白质的存在导致单性结实。表4：辣椒中的pin4的snp突变及其对所编码的pin4蛋白的作用当前第1页12