手性毒性筛选方法与流程

本发明涉及通过在体外或体内产生和筛选立体定向手性硫代磷酸酯变体文库中具有降低的毒性的化合物来鉴定具有降低的毒性的立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸变体的方法。
背景技术：
：koziolkiewicz等人(nar1995,24；5000-5005)公开了15merdna硫代磷酸酯寡核苷酸，其中硫代磷酸酯键是[全-rp]构型或[全-sp]构型，或非对映异构体的无规混合物。发现[all-rp]与杂交体或[全-sp]寡核苷酸相比，“更容易受到”rna酶h依赖性降解，并被发现具有更高的双链体热稳定性。建议在实际应用中，[全rp]寡核苷酸应在3’末端被[sp]硫代磷酸酯保护。stec等人(j.am.chem.soc.1998,120；7156–7167)报道了5’-dmt-脱氧核糖核苷3’-o-(2-硫代-“螺”-4,4-五亚甲基-1,2,3-氧杂硫杂磷杂环戊烷)的新的单体，用于经由氧杂硫杂磷杂环戊烷方法进行ps-寡核苷酸的立体控制的合成。karwowski等人(bioorganic&med.chem.letts.200111；1001-1003)使用氧杂硫杂磷杂环戊烷方法进行lna二核苷硫代磷酸酯的立体控制的合成。r立体异构体二核苷酸易被蛇毒磷酸二酯酶水解。krieg等人(oligonucleotides13；491-499)研究了cpgps-寡核苷酸的免疫刺激是否取决于其p手性的手性。与sp寡核苷酸相比，cpgpsrp寡核苷酸显示出更高的mapk活化和iκb降解的诱导。没有证据表明不同的立体异构体寡核苷酸的差异摄取。rp寡核苷酸具有较短的持续时间(少于48小时)，可能是由于快速降解。对于免疫刺激，建议具有rp手性的cpg寡核苷酸用于快速短期使用，并且sp寡核苷酸用于长期效应。levin等人第七章antisensedrugtechnology2008；183–215评论了硫代磷酸酯手性，证实硫代磷酸酯dna寡核苷酸的手性大大影响其药代动力学，特别是由于sp立体异构体的外切核酸酶抗性。据报道，由于在3’和5’末端的2’修饰阻止外切核酸酶降解，硫代磷酸酯手性的pk效应在第二代aso中不显著，但是具有rp末端残基的单个分子可能更对外切核酸酶更敏感→即对于较长的半衰期，具有末端sp残基的分子可能具有更长的半衰期。wavelifesciencesposter(tides,may3–62014,sandiego):基于双雄烯中524,288种可能的不同立体异构体的计算，他们阐明了7种立体异构体相对于，其在tm，rnaseh募集，亲脂性，代谢稳定性，体内功效和比活性方面显著不同。wan等人，nucleicacidsresearch，2014年11月14日(高级出版物)公开了31种反义寡核苷酸，其中间隙区的手性是使用dna-氧氮杂磷酸肽方法进行控制的(okaetal.,j.am.chem.soc.2008；16031–16037.)，并得出结论，在间隙体(gamper)的间隙区域中控制ps手性对于相对于立体随机psaso的混合物的治疗应用没有显著的益处。wan等人进一步提到与手性psaso的合成和表征相关联的增加的复杂性和成本，减小了其效用。swayze等人，2007，nar35(2)：687-700报道，lna反义化合物提高效力，但在动物中引起显著的肝毒性。wo2008/049085报道了在lna侧翼区域中包含2’-o-moe的lna混合翼间隙体，其显然降低了某些lna化合物的毒性，但显著降低了效力。wo2014/012081和wo2014/010250提供用于合成寡核苷酸的手性试剂。wo2015/107425报道了手性限定的寡核苷酸的手性设计，并报道某些手性限定的化合物可以改变rnaseh切割模式。发明概述本发明提供了降低反义寡核苷酸序列(母体寡核苷酸)的毒性的方法，包括以下步骤a.产生立体定向寡核苷酸变体(子寡核苷酸)文库，其保留母体寡核苷酸的核心核碱基序列，b.筛选在步骤a中产生的文库在细胞中的体外或体内毒性，c.鉴定文库中存在的一种或多种立体定向的变体，其与母体寡核苷酸相比在细胞中具有降低的毒性。其中，任选地重复该方法(重复筛选)，例如使得通过该方法鉴定的一种或多种立体定向变体在下一轮筛选方法中用作母体寡核苷酸。术语立体定向的可与本文中术语立体限定的互换。本发明提供了降低硫代磷酸酯寡核苷酸(母体)序列的毒性的方法，包括以下步骤：a.提供在体内或体外具有毒性表型的立体非定向的硫代磷酸酯寡核苷酸(母体)，b.产生立体定向的硫代磷酸寡核苷酸文库(子代)文库，其保留母体间隙体寡核苷酸的核心核碱基序列，c.在体内或体外毒性测定中筛选在步骤b中产生的文库，d.鉴定与立体非定向的硫代磷酸酯寡核苷酸相比具有降低的毒性的一种或多种立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸。在一些实施方案中，可以重复使用本发明的方法。本发明的方法可以进一步包括制造具有降低的毒性的一种或多种立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸的另外的后续步骤。在一些实施方案中，后续制造的规模大于1g，例如超过10g。在一些实施方案中，用于体内或体外筛选步骤(b)的寡核苷酸的合成以小于1g，例如小于0.5g，例如小于0.1g的规模进行。子寡核苷酸(即步骤b的文库的成员)或通过该方法鉴定的减少毒性的子寡核苷酸是母体寡核苷酸的立体定向变体，即它们包含与母体不同的至少一种立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在本发明的方法中，在步骤b)中产生的文库中的每个成员包含与母体不同的至少一种立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，该方法还包括确定立体定向寡核苷酸变体文库或存在于步骤c)或d)中鉴定的文库中的一种或多种立体定向化合物的体外或体内效力的步骤。在一些实施方案中，本发明的方法提供了立体定向的硫代磷酸酯lna寡核苷酸，其包含lna核苷和随后的(3’)核苷之间的至少一种立体选择性硫代磷酸酯键。这样的lna寡核苷酸可以例如是如本文所述的lna间隙体。术语“立体定向的”与在本文中的立体限定的可互换使用。立体定向的硫代磷酸酯键也可以称为立体选择性或立体特异性硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸长度为10-20个核苷酸，例如长度为10-16个核苷酸。包含至少一种lna核苷的寡核苷酸可以在本文中称为lna寡核苷酸或lna寡聚体。本发明提供了与具有相同核碱基序列和化学修饰(除了立体定向的硫代磷酸酯键之外)的非立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸相比，在体内或体外具有降低的毒性的立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸。在一些实施方案中，非立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸/立体定向的寡核苷酸可以是间隙体，例如lna-间隙体。为了比较毒性，立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸保留存在于母体寡核苷酸中的修饰和未修饰的核苷的模式。本发明还提供包含如本文所述的寡聚体的缀合物，其包含共价连接到本发明的寡聚体上的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(“缀合部分”)。本发明提供包含如本文所述的寡聚体或缀合物和药学上可接受的溶剂(例如水或盐水)，稀释剂，载体，盐或佐剂的药物组合物。还提供了包含本文所述的寡聚体的药物和其它组合物。还提供了下调细胞或组织中靶核酸，例如rna，例如mrna或微小rna表达的方法，包括在体外或体内使所述细胞或组织与有效量的本文所述的一种或多种寡聚体，缀合物或组合物接触。还公开了通过对怀疑具有或易于受到与rna表达或过表达有关的疾病或病症的动物(非人动物或人)施用治疗或预防有效量的本文所述的一种或多种寡聚体，缀合物或药物组合物，治疗所述非人动物或人的方法。本发明提供了抑制(例如，通过下调)在细胞或组织中靶核酸的表达的方法，所述方法包括在体外或体内使细胞或组织与有效量的一种或多种寡聚体，缀合物或其药物组合物接触，以实现靶核酸表达的下调的步骤。在一些实施方案中，本文所述的lna寡核苷酸包含lna核苷和随后的(3’)核苷之间的至少一个立体选择性硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，如本文所述的lna寡核苷酸包含至少一种立体定向的硫代磷酸酯核苷酸对，其中立体定向的硫代磷酸酯核苷酸对的核苷之间的核苷间键为rp构型或rs构型，并且其中立体定向的硫代磷酸酯核苷酸对的至少一个核苷是lna核苷酸。在一些实施方案中，立体定向的硫代磷酸酯核苷酸对的另一种核苷不是dna，例如核苷类似物，例如另外的lna核苷或2’取代的核苷。本发明还提供了在寡核苷酸中使用立体定向的硫代磷酸酯核苷间键，其中与不包含立体特异的硫代磷酸酯核苷酸间键的相同寡核苷酸相比，所述寡核苷酸具有降低的毒性。本发明还提供了立体控制(也称为立体特异性)硫代磷酸酯单体(例如亚磷酰胺)用于合成减少毒性的寡核苷酸(立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸)的用途。本发明还提供已被发现可预测寡核苷酸(例如lna寡核苷酸)的体内毒性的体外毒性测定法。提供了合适的肝毒性或肾毒性测定法。应当认识到，这种测定法的用途不限于立体定向的寡核苷酸，而是在本发明的另一方面，通常适用于寡核苷酸，例如包括lna寡核苷酸的反义寡核苷酸(例如，β-d-氧基lna或(s)cet)和包含2’-取代的核苷的寡核苷酸，间隙体寡核苷酸，例如本文所述的寡核苷酸。本发明提供了体外原代肝细胞测定法来确定寡核苷酸(例如lna寡核苷酸)(例如可能的)肝毒性的用途。本发明提供了一种用于预测寡核苷酸(例如lna寡核苷酸)的(例如可能的)体内肝毒性的方法，所述方法包括以下步骤：将所述寡核苷酸在体外施用于原代肝细胞细胞群，例如小鼠或大鼠原代肝细胞(其例如可以通过肝脏灌注获得)或人原代肝细胞，在寡核苷酸的存在下温育细胞，例如1-7天之间，例如2-4天，例如3天的时间，随后测量体外细胞毒性的至少一种生物标志物，例如本文所述的生物标志物，例如，通过测量释放到培养基中的乳酸脱氢酶(ldh)的量和/或细胞atp水平的测定。适当地，细胞atp水平的降低指示肝毒性寡核苷酸，释放到培养基中的ldh的升高指示肝毒性寡核苷酸。本发明提供了体外测定法来测定寡核苷酸(例如lna寡核苷酸)(例如可能地)肝毒性的用途。本发明提供了体外测定法来测定寡核苷酸(例如lna寡核苷酸)(例如可能的)肾毒性的用途。适当地，可以使用哺乳动物肾皮质上皮细胞，例如人肾皮质上皮细胞，其可任选地永生化，例如，可以使用htert1，如rptec/tert1(可得自atcc，例如(crl-4031tm)或rptec-tert1(evercytegmbh,austria)。本发明提供了一种用于预测寡核苷酸(例如lna寡核苷酸)的(例如可能的)体内肾毒性的方法，所述方法包括以下步骤：在体外向哺乳动物肾皮质上皮细胞(例如人或大鼠原代近端小管上皮细胞，例如rptec-tert1)群体施用寡核苷酸，在寡核苷酸存在下温育细胞，例如1-21天，如2-16天，如4-12天，如6-10天，如9天，随后测量至少一种体外细胞毒性标志物，例如如本文所述的那些标志物，例如通过测定细胞atp水平。适当地，细胞atp水平的降低指示肾毒性寡核苷酸。适当地将寡核苷酸例如，在pbs中施用于细胞培养物，以实现1-100μm，例如5-50μm，例如10或30μm的最终浓度。应当认识到，在一些实施方案中，用于预测体内毒性(例如肾毒性或肝毒性)的方法可用于鉴定体外或体内毒性降低的母体寡核苷酸的立体定向变体。附图图1：本发明的一些lna寡核苷酸的示意图。该图显示了具有15个核苷间硫代磷酸酯键的3-10-3间隙体寡核苷酸。翼区x’和y’中的核苷间键可以如本文所述，例如可以是无规的rp或sp的硫代磷酸酯键。图1的表部分提供了母体化合物(p)，其中间隙区y’的所有核苷间键也随机掺入rp或sp硫代磷酸酯键(m)，并且在化合物1-10中，一个硫代磷酸酯键被立体定向为rp硫代磷酸酯核苷间键(r)。图2：根据图1，除了化合物1-10中，硫代磷酸酯键之一被立体定向为sp硫代磷酸酯核苷间键(s)。图3：将lna寡核苷酸(其中3种硫代磷酸酯核苷间键以s(化合物#10)或r(化合物#14)构型固定)的肝毒性潜力(alt)与非对映异构体的母体混合物(化合物#1)(所有核苷键为r和s构型的混合物)的alt进行比较。图4：肝脏，肾脏和脾脏中的寡核苷酸含量。图5：用各自lna处理3天的细胞的上清液中ldh水平和细胞内atp水平的变化。48小时后评估靶标敲减(myd88)。图6：原代肝细胞的体外毒性筛选：用各自的lna处理3天的细胞的上清液中ldh水平和细胞内atp水平的变化。数据是平均值，表示为％载体对照(对于#56，n＝4，实验一式三份，对于所有其他lna，n＝2，实验一式三份)。图7：肾近端小管细胞中的体外毒性筛选：用10μm和30μm的lnamyd88立体变体处理9天后测定的ptec-tert1的活力(细胞atp)。发明详述本发明的方法提供了用于调节诸如抑制细胞中靶核酸的立体特异性寡聚化合物(本文中也称为寡聚体或寡核苷酸)。寡聚体可以是反义间隙体寡核苷酸。使用本发明的方法鉴定或制造的寡聚体具有降低的体外或体内毒性，例如降低的肾毒性或降低的肝毒性。在本发明的上下文中，术语“立体定向的”是指寡核苷酸，其中存在于寡核苷酸的至少一个硫代磷酸酯核苷间键具有定向的立体化学，即rp或sp。在一些实施方案中，立体定向的寡核苷酸中的所有硫代磷酸酯核苷间键可以是立体定向的，即每个硫代磷酸酯核苷间键独立地选自由rp和sp硫代磷酸酯核苷间键组成的组。通常，寡核苷酸硫代磷酸酯作为rp和sp硫代磷酸酯键的无规混合物(也称为外消旋混合物)合成。在本发明中，提供了间隙体硫代磷酸酯寡核苷酸，其中间隙区寡核苷酸的至少一个硫代磷酸酯键是立体定向的，即在寡核苷酸样品中存在的至少75％，例如至少80％，或至少85％，或至少90％或至少95％，或至少97％，例如至少98％，例如至少99％，或(基本上)所有寡核苷酸分子是rp或sp。这样的寡核苷酸可以称为立体定向的，立体选择性的或立体特异性的：它们包含至少一个立体特异性的硫代磷酸酯键。术语立体定向的和立体特异性/立体选择性的在本文中可以互换使用。术语立体定向的，立体选择性的和立体特异性的可用于描述硫代磷酸酯核苷间键(rp或sp)，或可用于描述包含这种硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸。应当认识到，立体定向的寡核苷酸可以在任何一个位置包含少量的备选立体异构体，例如，wan等人2014年11月报道了在nar中报道的间隙体的98％的立体选择性。优点体内和体外优化本发明提供了用于优化寡核苷酸，例如用于体内(例如药理学)应用的通过基因行走鉴定的寡核苷酸的方法。特别地，本发明的方法可用于降低寡核苷酸(序列)的体外或体内毒性，以及用于合成和制备寡聚体，所述寡聚体具有降低的毒性和任选的其它增强的有益性质，例如靶特异性，错配鉴别，血清蛋白结合，生物分布，rna酶h募集，功效和细胞摄取。减少的毒性本发明提供了降低反义寡核苷酸序列(母体寡核苷酸)的毒性的方法，包括以下步骤a.产生立体定向的寡核苷酸变体(子寡核苷酸)文库，其保留母体寡核苷酸的核心核碱基序列，b.筛选在步骤a中产生的文库在细胞中的体外或体内毒性，c.鉴定文库中存在的一种或多种立体定向变体，其与母体寡核苷酸相比在细胞中具有降低的毒性。在一些实施方案中，毒性(步骤b)在体内测定。在一些实施方案中，毒性在体外测定。在一些实施方案中，母体寡核苷酸是在体外或体内被确定为肝毒性的寡核苷酸。通过本发明的方法鉴定的子寡核苷酸与母体寡核苷酸相比具有降低的毒性，例如降低的肝毒性。在一些实施方案中，降低的毒性降低了肝毒性。可以在体内，例如在小鼠中评估寡核苷酸的肝毒性。体内肝毒性测定法通常基于测定肝损伤的血清标志物，如alt，ast或ggt。超过正常水平上限三倍的水平被认为指示体内毒性。可以使用例如单次30mg/kg剂量的寡核苷酸在小鼠中评估体内毒性，7天后进行毒性评估(7天体内毒性测定)。用于细胞毒性的合适标志物包括升高的ldh或细胞atp的降低，并且这些标志物可用于在体外测定细胞毒性，例如使用原代细胞或细胞培养物。为了测定肝毒性，可以使用小鼠或大鼠肝细胞，包括原代肝细胞。肝细胞毒性合适的标志物包括升高的ldh或细胞atp的减少。如果可用，可以使用原代的灵长类动物例如人肝细胞。在哺乳动物肝细胞如小鼠肝细胞中，ldh的升高指示毒性。细胞atp的减少指示毒性，例如肝毒性。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸具有降低的体外肝毒性，如在原代小鼠肝细胞细胞中使用实施例8中提供的测定法测定的。在一些实施方案中，降低的毒性降低了肾毒性。可以通过使用包括血清肌酸酐水平升高或kim-1(肾损伤标记物-1)mrna和/或蛋白质升高的肾脏损伤标记物在体内评估肾毒性。适当地，可以使用小鼠或啮齿动物。体外肾损伤测定可用于测量肾毒性，并且可以包括kim-1mrna/蛋白的升高或细胞atp的变化(减少)。在一些实施方案中，ptec-tert1细胞可用于在体外测定肾毒性，例如通过测量细胞atp水平。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸具有降低的体外肾毒性，如在ptec-tert1细胞中测定的，例如使用实施例9中提供的测定法。可用于评估毒性的其它体外毒性测定包括胱天蛋白酶测定和细胞活力测定，例如，mts测定。在一些实施方案中，本发明的减少的毒性寡核苷酸包含至少一种立体定向的rp核苷酸间连接，例如至少2,3或4个立体定向的rp核苷酸间键。实施例说明了包含在体外和体内具有降低的肝毒性的立体定向的rp核苷酸间键的化合物。在一些实施方案中，至少一个立体定向的rp核苷酸间键存在于lna间隙体的间隙区内。在一些实施方案中，本发明的减少的毒性寡核苷酸包含至少一种立体定向的sp核苷酸间键，例如至少2,3或4个立体定向的sp核苷酸间键。实施例说明具有降低的肾毒性的化合物，其包含至少一个立体定向的sp核苷间键。在一些实施方案中，至少一个立体定向的sp核苷酸间键存在于lna间隙体的间隙区内。本发明提供了立体控制的(也可以称为立体特异性的或立体特异性)亚磷酰胺单体用于合成减少毒性的寡核苷酸，例如，减少的肝毒性或减少的肾毒性寡核苷酸的用途。在一些实施方案中，立体控制的亚磷酰胺单体是lna立体控制的亚磷酰胺单体。在一些实施方案中，立体控制的亚磷酰胺单体是dna立体控制的亚磷酰胺单体。在一些实施方案中，立体控制的亚磷酰胺单体是2’修饰的立体控制的亚磷酰胺单体，例如2’甲氧基乙基立体控制的亚磷酰胺rna单体。在某些实施方案中，立体控制的亚磷酰胺单体可以是氧杂氮杂磷酰胆碱(oxazaphospholine)单体，例如dna-氧杂氮杂磷酰胆碱lna-氧杂氮杂磷酰胆碱单体。本发明的单体可用于在体外或体内降低lna寡核苷酸的肝毒性。可以使用模式小鼠系统测定lna肝毒性，参见例如ep1984381。本发明的单体可用于降低lna寡核苷酸的肾毒性。lna肾毒性可以使用模式大鼠系统确定，并且通常通过使用kim-1生物标志物来确定(参见例如wo2014118267)。本发明的单体可用于降低体内lna寡聚体的免疫原性。根据ep1984381，具有4’-ch2-o-2’基的lna是特别有毒性的。本发明的寡核苷酸可具有改善的核酸酶抗性，生物稳定性，靶亲和力，rna酶h活性和/或亲脂性。因此，本发明提供了增强体内寡聚体的活性和改善寡聚体的药理学和/或毒理学特征的方法。在一些实施方案中，与等效的非立体选择性lna寡核苷酸相比，lna寡核苷酸具有降低的毒性，例如降低的体内肝毒性，例如使用实施例6中提供的测定法测量，或降低的体外肝毒性，例如使用实施例8中提供的测定法测量，或降低的肾毒性，例如使用实施例9中提供的测定法测量。还可以使用本领域已知的其它方法，例如胱天蛋白酶测定法和原代肝细胞毒性测定法(例如实施例8))评估降低的毒性。rna酶h募集如实施例所阐明，在一些实施方案中，本发明的立体定向的寡核苷酸与其它非立体定向的寡核苷酸(母体寡核苷酸)相比具有增强的rna酶h募集活性。实际上，本发明人惊奇地发现，通常，将立体定向的硫代磷酸酯核苷间键引入rna酶h募集lna寡核苷酸，例如，lna间隙体寡核苷酸导致增强的rna酶h募集活性，高达母体(非立体定向的)的30倍。因此，本发明提供了一种立体控制(也称为立体特异性)亚磷酰胺单体的用途，用于合成与其他方面相同的非立体定向的寡核苷酸相比具有增强的rna酶h募集活性的寡核苷酸。本发明还可以包括增强反义寡核苷酸序列(母体寡核苷酸)对于rna靶标的rna酶h募集活性的方法，包括以下步骤：a.产生立体定向的寡核苷酸变体(子寡核苷酸)文库，其保留母体寡核苷酸的核心核碱基序列，b.筛选在步骤a中产生的文库针对rna靶标的体外rna酶h募集活性，c.鉴定文库中存在的一种或多种立体定向变体，其与母体寡核苷酸相比具有增强的rna酶h募集活性。d.任选地制造步骤c中鉴定的至少一种立体定向的变体。将认识到，该方法可以与降低根据本发明的寡核苷酸的毒性的方法组合。本发明提供了与其他方面相同的非立体定向lna寡核苷酸(或母体寡核苷酸)相比具有增强的rna酶h募集活性的lna寡核苷酸。具有增强的rna酶h募集活性的lna寡核苷酸可进一步具有降低的体外或体内毒性，例如降低的肝毒性或降低的肾毒性。其他方面相同的非立体定向的lna寡核苷酸(例如母体寡核苷酸)是具有相同的核碱基序列和化学修饰，而不是立体定向的硫代磷酸酯键的非立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸。将会认识到，非立体定向的lna寡核苷酸可以在除硫代磷酸酯核苷酸间键以外的化合物部分中例如，在核苷内包括立体定向的中心。在lna寡核苷酸中使用手性限定的硫代磷酸酯连接令人惊奇地导致rna酶h活性的增加。当间隙区域包含立体定向的rp和sp核苷间键时，可以看出这一点。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的间隙区包含至少2个rp和至少2个sp立体定向的核苷间键。在一些实施方案中，其间隙区域(包括与翼区域相邻的核苷间键)内的rp与sp立体定向核苷间键的比例在约0.25至约0.75之间。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的间隙区包含至少2个连续的核苷间键，其是立体定向的rp或sp核苷间键。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸的间隙区包含至少3个连续的核苷间键，其是立体定向的rp或sp核苷间键。在一些实施方案中，例如使用实施例7中提供的rna酶h募集测定法，与等同的非立体选择性lna寡核苷酸相比，lna寡核苷酸具有增强的人类rna酶h募集活性。在一些实施方案中，rna酶h活性的增加为等同非立体选择性lna寡核苷酸(例如母体寡核苷酸)的rna酶h活性的至少2倍，例如至少5倍，例如至少10倍。实施例7提供了可用于评估rna酶h活性的合适的rna酶h测定(也称为rna酶h募集)。已经发现，利用lna间隙体化合物发现rna酶h活性的显著改善，其中间隙区域包含rp和sp核苷间键，并且在一些实施方案中，间隙区可以包含至少两个rp核苷间键和至少两个sp核苷间键，例如至少三个rp核苷间键和/或至少三个sp核苷间键。已经发现，用其中间隙区域的核苷间键被立体定向的lna间隙体化合物发现了rna酶h活性的显著改善。因此，在一些实施方案中，存在至少一种立体选择性硫代磷酸酯lna寡核苷酸，其在lna核苷和随后的(3’)核苷之间包含至少一个立体选择性硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，区域x’和/或z’内的核苷酸间键中的至少一个是rp核苷间键。在一些实施方案中，寡聚体或x’区中的最5’的核苷间键是sp核苷间键。在一些实施方案中，侧翼区x’和z’包含至少一个sp核苷间键和至少一个rp核苷间键。在一些实施方案中，寡聚体或z’区的3’核苷间键是sp核苷间键。在一些实施方案中，本发明的立体定向的寡核苷酸与其它非立体定向的寡核苷酸或母体寡核苷酸相比具有改善的效力。特异性和错配辨别如实施例所示，在一些实施方案中，与其他方面非立体定向的寡核苷酸(或母体寡核苷酸)相比，本发明的立体定向的寡核苷酸可具有增强的错配鉴别(或增强的靶特异性)。实际上，本发明人惊奇地发现立体定向的硫代磷酸酯核苷间键引入rna酶h募集lna寡核苷酸，例如lna间隙体寡核苷酸，可以导致增强的错配鉴别(或靶特异性)。因此，本发明提供了与其它方面相同的非立体定向的寡核苷酸相比，用于合成具有增强的错配鉴别(或靶特异性)的寡核苷酸的立体控制硫代磷酸酯单体的用途。因此，本发明可以进一步包括增强细胞中rna靶的反义寡核苷酸序列(母体寡核苷酸)的错配鉴别(或靶特异性)的方法，包括以下步骤：a.产生立体定向的寡核苷酸变体(子寡核苷酸)文库，其保留母体寡核苷酸的核心核碱基序列，b.筛选在步骤a中产生的文库针对rna靶的活性及其对存在的至少一种其它rna的活性，c.鉴定文库中存在的一种或多种立体定向变体，其与母体寡核苷酸相比具有降低的针对至少一种其它rna的活性。将认识到，该方法可以与降低根据本发明的寡核苷酸的毒性的方法组合。针对至少一种其它rna的降低的活性可以被确定为预期靶标/非预期靶标(至少一种其它rna)的活性比例。该方法还可以与用于增强rna靶标的反义寡核苷酸序列(母体寡核苷酸)的rna酶h募集活性的方法组合，以鉴定具有增强的rna酶h募集活性和增强的错配鉴别(即增强的靶向特异性)的本发明的寡核苷酸，和降低的体外或体内毒性。本发明提供了与其他方面相同的非立体定向lna寡核苷酸(或母体寡核苷酸)相比具有增强的错配鉴别(或增强的靶特异性)的lna寡核苷酸。具有增强的错配鉴别(或增强的靶特异性)的lna寡核苷酸还可以具有降低的体外或体内毒性，例如降低的肝毒性降低或降低的肾毒性，以及任选地增强的rna酶h募集活性。本发明提供了与其他方面相同的非立体定向的lna寡核苷酸(或母体寡核苷酸)相比具有降低的体内或体外毒性和增强的rna酶h募集活性和增强的错配鉴别(或增强的靶特异性)的lna寡核苷酸。因此，本发明提供了立体控制/立体控制的(也可以称为立体定向或立体特异性)亚磷酰胺单体用于合成与其他方面相同的非立体定向的寡核苷酸相比具有降低的毒性，增强的错配鉴别(或靶特异性)和增强的rna酶h募集活性的寡核苷酸的用途。在一些实施方案中，立体控制亚磷酰胺单体是lna立体控制(立体特异性)亚磷酰胺单体。在一些实施方案中，立体控制亚磷酰胺单体是dna立体控制亚磷酰胺单体。在一些实施方案中，立体控制(立体特异性)亚磷酰胺单体是2’修饰的立体控制(立体特异性)亚磷酰胺单体，例如2’甲氧基乙基立体控制(立体特异性)亚磷酰胺rna单体。立体控制(立体特异性)亚磷酰胺单体在某些实施方案中可以是氧杂氮杂磷酰胆碱单体，例如dna-氧杂氮杂磷酰胆碱lna-氧杂氮杂磷酰胆碱单体。在一些实施方案中，立体控制(立体特异性)亚磷酰胺单体可以包含选自a，t，u，c，5-甲基-c或g核碱基的核碱基。生物分布本发明提供了改变反义寡核苷酸序列(母体寡核苷酸)的生物分布的方法，包括以下步骤a.产生立体定向的寡核苷酸变体(子寡核苷酸)文库，其保留母体寡核苷酸的核心核碱基序列，b.为它们的生物分布筛选在步骤a中产生的文库，c.鉴定与母体寡核苷酸相比，存在于文库中的具有改变(例如优选的)生物分布的一种或多种立体定向变体，d.任选地制造步骤c中鉴定的一种或多种立体定向变体。上述方法可以与减少本文公开的毒性的方法结合使用。认识到在一些实施方案中，母体寡核苷酸可以是不同立体异构形式的混合物，因此本发明的方法可以包括鉴定具有一种降低的毒性，以及任选的一种或多种其它改进的性质，例如与母体寡核苷酸相比增强的特异性，改变的生物分布，增强的效力的单个立体定向的寡核苷酸或单个立体异构体(子寡核苷酸)的方法。在一些实施方案中，本发明的或通过本发明的方法鉴定的化合物，具有增强的对肝脏的生物分布。在一些实施方案中，本发明的或通过本发明的方法鉴定的化合物具有增强的肝/肾生物分布比。在一些实施方案中，本发明的或通过本发明的方法鉴定的化合物具有增强的肾/肝生物分布比。在一些实施方案中，本发明的或通过本发明的方法鉴定的化合物具有增强的对肾的生物分布。在一些实施方案中，本发明的或通过本发明的方法鉴定的化合物在肝细胞中具有增强的细胞摄取。在一些实施方案中，本发明的或通过本发明的方法鉴定的化合物在肾细胞中具有增强的细胞摄取。当提及具有增强的功能特征的化合物时，可以关于母体寡核苷酸，例如其他方面相同的非立体定向的寡核苷酸进行增强。虽然生物分布研究通常在体内进行，但是它们也可以在体外系统中进行，例如通过比较不同细胞类型，例如体外肝细胞(例如原代肝细胞)或肾细胞(例如肾上皮细胞，如ptec-tert1细胞)中的细胞摄取。寡核苷酸本发明上下文中的术语“寡聚体”或“寡聚化合物”是指通过两个或多个核苷酸的共价连接形成的分子(即寡核苷酸)。这里，单个核苷酸(单元)也可以称为单体或单元。在一些实施方案中，术语“核苷”，“核苷酸”，“单元”和“单体”可互换使用。应当认识到，当提及核苷酸或单体的序列时，所指的是碱基序列如a，t，g，c或u。术语寡核苷酸与术语寡聚化合物和寡聚体在本文中可互换使用。在一些实施方案中，寡核苷酸长度为10-20个核苷酸，例如10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20个核苷酸。在一些实施方案中，母体和子寡核苷酸是lna寡聚体。在一些实施方案中，lna寡聚体包含lna核苷和随后的(3’)核苷之间的至少一个立体选择性硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，lna寡聚体包含至少一种立体定向的硫代磷酸酯核苷酸对，其中立体定向的硫代磷酸酯核苷酸对的核苷之间的核苷间键为rp构型或rs构型，并且其中核苷酸对的至少一个核苷是lna核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸对的另一核苷酸不是dna，例如核苷类似物，例如另外的lna核苷或2’取代的核苷。在一些实施方案中，寡聚体是立体定向(立体选择性)硫代磷酸酯lna寡核苷酸，其包含lna核苷和后续(3’)核苷之间的至少一个立体选择性硫代磷酸酯键。这样的lna寡核苷酸可以例如是如本文所述的lna间隙体。在一些实施方案中，寡核苷酸包含至少5个或更多个连续核苷的中心区(y’)和包含1-6个lna核苷的5’翼区(x’)和包含lna1-6个核苷的3’翼区(z’)，其中中心区的核苷间键中的至少一个是立体定向的，并且其中中心区包含rp和sp核苷间键。母体寡核苷酸在一些实施方案中，母体寡核苷酸可以是非立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸，即包含不限定硫代磷酸酯键的手性的单个分子的混合物的寡核苷酸，例如外消旋混合物。换句话说，在一些实施方案中，母体寡核苷酸可以仅具有立体未限定的硫代磷酸酯核苷间键(即立体未限定的寡核苷酸)。在一些实施方案中，母体寡核苷酸包含非立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，存在于母体寡核苷酸中的所有核苷间键是非立体定向的核苷间键，例如非立体定向的核苷间硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，母体寡核苷酸可以包含一个或多个立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，母体寡核苷酸的所有硫代磷酸酯核苷间键是立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，通过本发明的方法的较早重复来鉴定母体寡核苷酸。变体文库本发明的方法包括产生母体寡核苷酸变体文库的步骤，其中变体具有与母体寡核苷酸不同的至少一个立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。适当地，变体文库的每个成员具有与母体不同的立体定向的硫代磷酸酯核苷间键的不同模式。在一些实施方案中，子寡核苷酸文库(立体定向的限定的寡核苷酸变体)的每个成员包含至少2个，例如至少3个，例如至少4个立体定向的硫代磷酸酯键，其中剩余的键可以任选地是非立体定向的限定的硫代磷酸酯键。合适地，存在于子寡核苷酸中的所述至少2个，至少3个或至少4个立体特异性的硫代磷酸酯键与母体不同(例如，母体不包含立体定向的硫代磷酸酯核苷间键，或者母体包含不同的立体定向的硫代磷酸酯键，或不同的模式或立体定向的硫代磷酸酯键)。在一些实施方案中，(例如，子)寡聚体中5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,或95％的键是立体定向的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，(例如子)寡聚体中的所有硫代磷酸酯键都是立体定向的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，(例如子)寡聚体的所有核苷间键都是立体定向的硫代磷酸酯键。应当认识到，立体定向(立体特异性)是指在定义的核苷间键处掺入高比例，即至少75％的rp或sp核苷间键。在一些实施方案中，在本发明方法的步骤b)中，立体定向的寡核苷酸变体文库的每个成员可以通过将至少一个立体定向的硫代磷酸酯核苷间键插入母体间隙体的间隙区域来产生。适当地，插入的立体定向硫代磷酸核苷间键与母体的等同核苷间键不同，或者母体在等同位置不包含立体定向的核苷间键。在一些实施方案中，立体定向的寡核苷酸变体文库的每个成员通过将至少一个立体定向的硫代磷酸酯核苷间键插入到间隙体的间隙区域中来产生。在一些实施方案中，立体定向的寡核苷酸变体文库的每个成员通过将至少一个立体定向的硫代磷酸酯核苷间键插入到间隙体的一个或两个翼区中来产生。在一些实施方案中，立体定向的寡核苷酸变体文库的每个成员通过将至少一个立体定向的硫代磷酸酯核苷间键插入到间隙体的一个或两个翼区域中，以及至少一个立体定向的硫代磷酸酯核苷间键插入间隙体的间隙区域来产生。将认识到，在一些实施方案中，子寡聚核苷酸的剩余核苷间键，例如间隙区或间隙体化合物的剩余核苷间键可以与母体相同，或者在一些实施方案中可以不同于母体。在一些实施方案中，步骤b)中产生的子寡核苷酸包括1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个独立的立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，步骤b)中产生的子寡核苷酸的所有硫代磷酸酯核苷间键是立体定向的硫代磷酸核苷间键。在一些实施方案中，步骤b)中产生的子寡核苷酸的所有核苷间键都是立体定向的硫代磷酸核苷间键。在一些实施方案中，立体定向的寡核苷酸变体文库的每个成员包含至少2个，例如至少3个，例如至少4个立体定向的硫代磷酸酯键，其中剩余的键可以任选地是非立体定向的限定的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，存在于立体定向的寡核苷酸变体文库的每个成员中的所有硫代磷酸酯键是立体定向的限定的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，存在于子寡核苷酸或其间隙体区的文库的每个成员中的所有核苷间键都是立体定向的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，立体定向的定义的寡核苷酸变体文库的每个成员保留存在于母体寡核苷酸中的修饰和未修饰的核苷模式，例如反义间隙体寡核苷酸。在一些实施方案中，母体和子寡核苷酸共享相同的核苷修饰模式，例如，母体寡核苷酸的(例如)间隙体设计保留在子寡核苷酸或至少一部分子寡核苷酸中。然而，认识到变体文库可以包含子寡核苷酸，其尽管保留了母体寡核苷酸的整体间隙体设计，但可以包含少数，例如1或2或3或4个核苷，其中母体的糖化学性质已经改变，例如通过使用翼中的备选核苷，例如在翼区域中使用备选的高亲和力核苷，或者在间隙区域中增加或减少或偏移。在一些实施方案中，母体和子寡核苷酸是lna间隙体寡核苷酸。保留核心核碱基序列子寡核苷酸文库包含保留母体化合物的核心核碱基序列的2个或更多个立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸。在一些实施方案中，子寡核苷酸可以与母体寡核苷酸具有相同的长度并保留相同的核碱基序列。然而，设想在一些实施方案中，子寡核苷酸可以被截短，例如通过除去5’和/或3’末端核苷酸，或者在一些实施方案中可以在5’/或3’末端具有额外的核苷酸。由于将一个或多个lna核苷插入到间隙区域中将增加对rna靶的亲和力，所以去除一个或多个末端高亲和力核苷如lna核苷允许维持寡核苷酸对rna靶的亲和力。设想在一些实施方案中，子寡核苷酸文库可以包含具有不同侧翼区的变体，一些被截短，一些具有另外的核苷，一些具有一个或两个偏移的核苷(如针对rna靶测量)的序列，一些在侧翼中具有额外的高亲和力核苷，因此文库是具有异质性硫代磷酸酯核苷间键的立体定向的硫代磷酸酯寡核苷酸的复杂文库，从而允许同时选择与母体相比具有降低的毒性的子寡核苷酸。母体和子寡核苷酸共享核心核碱基序列。通常的核心核碱基序列通常至少10个核碱基长，例如至少11个，至少12个，至少13个，至少14个，至少15个，或至少16个核碱基长，并且在一些实施方案中可以是母体寡核苷酸的相同核碱基序列。在一些实施方案中，母体和(至少一部分)子寡核苷酸在寡核苷酸的整个长度上具有相同的核碱基序列。然而，可以设想，在一些实施方案中，一部分子寡核苷酸可以包含额外的5’或3’核苷酸，例如和另外的1,2或3个5’或3’核苷酸。另外或备选地，在一些实施方案中，一部分子寡核苷酸可以相对于母体而被截短，例如，可能在5’或3’端包含1,2或3nt截短。在一些实施方案中，(部分)子寡核苷酸的的核碱基序列的另外的核碱基或截短是单个核碱基添加或截短。在一些实施方案中，当与靶序列比对时，子寡核苷酸或其一部分与母体寡核苷酸相比可能偏移单个核碱基或2或3个核碱基(实际上是一端截短，和另一端添加)。另外的核苷酸保留与靶核酸序列的互补性。间隙体寡核苷酸在一些实施方案中，母体寡核苷酸和子寡核苷酸是间隙体寡核苷酸。间隙体寡核苷酸被广泛用于通过反义机制抑制细胞中的靶rna如mrna或病毒rna(并且因此也可以称为反义间隙体寡核苷酸)。间隙体寡核苷酸包含能够或募集rna酶h(间隙区)的至少5个连续核苷酸的区域，例如dna核苷酸的区域，例如，6-14个dna核苷酸，其侧翼为5’和3’区域，所述区域包含增强亲和力的修饰的核苷，如lna或2’取代的核苷酸。在一些实施方案中，侧翼区可以是长度为1-8个核苷酸。在一些实施方案中，母体和子寡核苷酸是间隙体寡核苷酸，其包含至少5个或更多个连续核苷(例如至少5个连续dna核苷)的中心区(y’)，和包含具有1-6个高亲和力核苷类似物，例如lna核苷的5’翼区(z’)和包含1-6个高亲和力核苷类似物(例如lna1-6核苷)的3’翼区(z’)。lna间隙体寡核苷酸是在翼区中包含至少一个lna核苷酸的寡核苷酸，并且例如可以包含在5’和3’翼区中的至少一个lna。在一些实施方案中，子寡核苷酸是间隙体，其中中心区的核苷间键中的至少一个是立体定向的，并且其中中心区包含rp和sp核苷间键。间隙体寡核苷酸可以包含能够募集rna酶h的至少5个或更多个连续核苷的中心区域(y’)和包含1-6个lna核苷的5’翼区(x’)和包含lna1-6个核苷的3’翼区(z’)。合适的区域y’可以具有6,7,8,9,10,11,12,13或14(例如6-12)连续核苷酸，例如dna核苷酸，并且与区域y’相邻的区域x’和z’的核苷酸是lna核苷酸。在一些实施方案中，x’和z’区域具有1-6个核苷酸，其至少一个在每个侧翼(x’和z’)中是lna。在一些实施方案中，区域x’和区域z’中的所有核苷酸都是lna核苷酸。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸包含lna和dna核苷。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸可以是混合的翼lna间隙体，其中一个翼区(或每个翼中的至少一个lna)中的至少一个lna核苷被2’取代的核苷如2’moe核苷替代。在一些实施方案中，lna间隙体在翼区域中不包含2’取代的核苷。区域x’-y’-z’的核苷酸的连续核苷酸序列中的核苷酸之间的核苷间键可以全部是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，在子寡核苷酸(以及任选的母体)中，中心区的核苷间键中的至少一个是立体定向的，并且其中中心区包含rp和sp核苷间键。在一些实施方案中，在子寡核苷酸(和任选的母体)中，区域y’内的核苷间键都是立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，在子寡核苷酸(以及任选的母体)中，区域x’和y’内的核苷间键是立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，在子寡核苷酸(和任选的母体)中，区域x’和y’之间以及区域y’和z’之间的核苷间键是立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，在子寡核苷酸(和任选的母体)中，区域x’-y’-z’的连续核苷内的所有核苷间键都是立体定向的硫代磷酸酯核苷间键。在寡核苷酸的间隙区域中引入至少一个立体定向的硫代磷酸酯键可以用于调节寡核苷酸的生物学特征，例如它可以调节毒性特征。在一些实施方案中，子寡核苷酸(和任选的母体)中的间隙区域中的2,3,4或5个硫代磷酸酯键是立体定向的。在一些实施方案中，间隙区域中剩余的核苷间键不是立体定向的：它们作为寡核苷酸种类群体中的rp和sp的外消旋混合物存在。在一些实施方案中，在子寡核苷酸(和任选的母体)中，寡核苷酸中的剩余的核苷间键不是立体定向的。在一些实施方案中，在子寡核苷酸(和任选的母体)中，间隙区域中的所有核苷间键都是立体定向的。本文中的间隙区域(称为y’)是能够募集rna酶h的核苷酸区域，并且可以例如是至少5个连续dna核苷的区域。在一些实施方案中，寡聚体间隙区域中的键的1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13或14个是立体选择性硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡聚体(如间隙体)中5％,10％,15％,20％,25％,30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,或95％的键是立体选择性的硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡聚体中的所有硫代磷酸酯键都是立体选择性硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，寡聚体的所有核苷间键都是立体定向的硫代磷酸酯键。功效通过本发明的方法鉴定的子寡核苷酸可以作为本发明方法的一部分进行测试，以确定它们是有效的反义寡核苷酸，例如它们能够抑制其靶核酸。因此，本发明的方法可以包括筛选子寡核苷酸文库(例如在步骤b之前，期间或之后)的另外的步骤，以获得其在调节，例如抑制它们的靶标中的功效。备选地，本发明的方法可以包括测试所选具有降低的毒性的立体定向的变体以确定其作为反义寡核苷酸的功效的额外步骤。在一些实施方案中，通过寡核苷酸募集rna酶h的能力来确定功效，或者在一些实施方案中可以是在体外或在一些实施方案中在体内调节细胞中靶标表达的能力。应当认识到，毒性降低的所选择的子寡核苷酸不必维持母体寡核苷酸的体外或体内效力，但优选它们是具有降低的毒性的有效的反义寡核苷酸。适当地，当在体内评价时，可以提高寡核苷酸的治疗指数。治疗指数通常计算为最大耐受剂量(mtd)(例如，对于肝脏毒性是正常上限的三倍)除以ed50。为了实验目的，假定靶序列存在于小鼠中，可以在7天的小鼠研究中测定小鼠中mtd和ed50。如果小鼠中的序列保守是不利的，则可以使用其它模式物种，例如，大鼠，猴，狗或猪。在一些实施方案中，在步骤c中鉴定的所选择的子寡核苷酸保留母体的至少25％，例如至少50％，例如至少75％，例如至少90％的体外(例如ic50)或体内(例如ed50或ec50)的效力。在一些实施方案中，在步骤c中鉴定的所选择的子寡核苷酸具有与母体相似的体外(例如ic50)或体内(例如ed50或ec50)效力(即，+/-10％)或与母体相比具有增强的体外(例如ic50)或体内(例如ed50或ec50)效力。应在表达预期靶标的靶细胞中评价ic50或ed50。在一些实施方案中，步骤c中鉴定的子寡核苷酸具有改善的母体化合物的ec50值。在一些实施方案中，步骤c中鉴定的子寡核苷酸保留母体化合物相似的ec50值(即+/-10％)。在一些实施方案中，步骤c中鉴定的子寡核苷酸具有改善的母体化合物的ec50值。在一些实施方案中，步骤c中鉴定的子寡核苷酸具有不高于两倍(2x)，或者在一些实施方式中三倍(3x)的母体化合物的ec50值(即+/-10％)。在一些实施方案中，步骤c中鉴定的子寡核苷酸保留ec50值不大于母体化合物的倍。lna在一些实施方案中，母体和子寡核苷酸是lna寡核苷酸，即它们包含至少一种lna核苷。lna单体(也称为双环核酸，bna)是核糖，其中在核糖环的2’和4’位之间存在双基。2’-4’双基也称为桥。已知当掺入寡核苷酸时，lna单体增强寡核苷酸与互补dna或rna序列的结合亲和力，通常以解链寡核苷酸/靶标双链体所需温度(tm)的升高来测量或计算。lna寡聚体包含至少一种“锁定核酸”(lna)核苷，例如核苷，其包含在2’和4’位置之间的共价桥(也称为自由基)(2’-4’桥)。lna核苷也称为“双环核苷”。lna寡聚体通常是单链反义寡核苷酸。在一些实施方案中，lna寡聚体包含或为间隙体。在一些实施方案中，寡聚体中存在的核苷类似物全部为lna。在各种实施方案中，本发明的化合物不包含rna(单元)。在一些实施方案中，寡聚体具有单个连续序列，其是线性分子或作为线性分子合成。因此，寡聚体可以是单链分子。在一些实施方案中，寡聚体不包含与相同寡聚体(即双链体)内的等同区域互补的至少3,4或5个连续核苷酸的短区域。在一些实施方案中，寡聚体可以不是(基本上)双链的。在一些实施方案中，寡聚体基本上不是双链的，例如不是sirna。在一些实施方案中，寡聚化合物不是具有(基本上)互补寡核苷酸的双链体形式——例如，不是sirna。靶标寡核苷酸的靶通常是选择的核酸，寡核苷酸能够在生理条件下与所述核酸进行杂交。对于反义治疗，靶核酸以医学病症指示。靶核酸可以是例如mrna或微小rna(术语靶基因所涵盖)。这样的寡核苷酸被称为反义寡核苷酸。方法中使用或通过本发明方法制备的合适的寡核苷酸(寡聚体)能够下调(例如减少或去除)靶核酸(也称为靶基因)的表达。在这方面，它们可以影响靶基因的抑制，通常在哺乳动物如人细胞中。在一些实施方案中，寡聚体与靶核酸结合并与正常表达水平相比，实现表达抑制至少10％或20％，更优选地，与正常表达水平(例如在不存在寡聚体或缀合物的情况下的表达水平)相比至少30％,40％,50％,60％,70％,80％,90％或95％的抑制。在一些实施方案中，当使用0.04到25nm，例如0.8到20nm浓度的本发明化合物时，可以看到这种调节。在相同或不同的实施方案中，表达的抑制小于100％，例如小于98％的抑制，小于95％的抑制，小于90％的抑制，小于80％的抑制，例如小于70％抑制。表达水平的调节可以通过测量蛋白质水平来确定，例如，通过诸如sds-page的方法，然后使用针对靶蛋白产生的合适的抗体进行蛋白质印迹。或者，可以例如通过northern印迹或定量rt-pcr测量mrna的水平来确定表达水平的调节。当通过mrna水平测量时，当使用适当剂量(例如0.04到25nm，例如0.8到20nm浓度)时，下调的水平在一些实施方案中，通常为不存在本发明化合物，缀合物或组合物时的正常水平的10-20％的水平。因此，寡核苷酸可用于在表达靶蛋白和/或rna的细胞中下调或抑制靶蛋白和/或靶rna的表达，所述方法包括将根据本发明的寡聚体或缀合物施用于所述细胞以下调或抑制所述细胞中靶蛋白或rna的表达。适当地，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞。在一些实施方案中，在体外可能发生施用。在一些实施方案中，施用可以在体内发生。寡聚体可以包含或由连续核苷酸序列组成，所述连续核苷酸序列对应于靶核酸中存在的核苷酸序列的反向互补序列。在确定本发明的寡聚体(或其区域)和核酸的靶区域之间的“互补性”程度时，“互补性”(也称为“同源性”或“同一性”)的程度表示为在寡聚体(或其区域)的序列和与其最佳比对的靶区域(或靶区域的反向互补序列)的序列之间百分比同一性(或百分比同源性)。通过计算2个序列之间相同的比对碱基的数目除以寡聚体中的连续单体的总数，并乘以100来计算百分比。在这样的比较中，如果存在空位，则优选这样的空位仅仅是错配，而不是区域，在所述区域中空位中的单体数目在本发明的寡聚体与靶区域之间不同。如本文所用，术语“同源的”和“同源性”可与术语“同一性”和“同一的”互换。术语“对应于”和“对应”是指寡聚体(即核碱基或碱基序列)或连续核苷酸序列(第一区域)的核苷酸序列和另外序列的等同连续核苷酸序列之间的比较，所述另外序列选自i)核酸靶标的反向互补序列的子序列，例如编码靶蛋白的mrna。wo2014/118267提供了具有治疗相关性的许多靶mrna以及可以使用本发明进行优化的寡聚体序列(参见例如表3，ncbigenbank参考文献如wo2014/118257中所公开)。表3术语“相应的核苷酸类似物”和“相应的核苷酸”旨在表明核苷酸类似物中的核苷酸和天然存在的核苷酸是相同的。例如，当核苷酸的2-脱氧核糖单元与腺嘌呤连接时，“相应的核苷酸类似物”含有与腺嘌呤连接的戊糖单元(不同于2-脱氧核糖)。本文所用的术语“反向互补”，“反向互补的”和“反向互补性”可以与术语“互补”，“互补的”和“互补性”互换。长度寡聚体可以组成为或包含7-30，例如7-26或8-25，如9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25个核苷酸长，如10-20个核苷酸长的连续核苷酸序列。在一些实施方案中，lna寡聚体的长度为10-16个核苷酸，例如12,13或14个核苷。在一些实施方案中，寡聚体包含或组成为总共10-22，例如12-18，例如13-17或12-16，例如13,14,15,16个连续核苷酸长度的连续核苷酸序列。在一些实施方案中，寡聚体包含或组成为总共10,11,12,13或14个连续核苷酸长度的连续核苷酸序列。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体由不超过22个核苷酸，例如不超过20个核苷酸，例如不超过18个核苷酸，例如15,16或17个核苷酸组成。在一些实施方案中，本发明的寡聚体包含少于20个核苷酸。应当理解，当给出寡聚物或连续核苷酸序列长度的范围时，其包括该范围内提供的上限和下限长度，例如从10-30(或在10-30之间)包括10和30。在一些实施方案中，寡聚体的长度小于20，例如小于18，例如16nts或更少或15或14nts或更少。lna寡聚体通常长度小于20。在一些实施方案中，寡聚体包含或组成为长度为总共10,11,12,13或14个连续核苷酸的连续核苷酸序列。在一些实施方案中，根据本发明的寡聚体由不超过22个核苷酸，例如不超过20个核苷酸，例如不超过18个核苷酸，例如15,16或17个核苷酸组成。在一些实施方案中，本发明的寡聚体包含少于20个核苷酸。应当理解，当给出寡聚物或连续核苷酸序列长度的范围时，其包括该范围内提供的上限和下限长度，例如从10-30(或在10-30之间)包括10和30。筛选方法本发明提供降低立体非特异性的硫代磷酸酯寡核苷酸序列的毒性的方法，包括以下步骤：a.提供在体内或体外具有毒性表型的立体非特异性的硫代磷酸酯寡核苷酸(母体)，b.产生一个立体特异性的硫代磷酸酯寡核苷酸文库(孩子)，保留母体间隙体寡核苷酸的核心核碱基序列，c.在体内或体外毒性测定中筛选在步骤b中产生的文库以d.鉴定与立体非特异性的硫代磷酸酯寡核苷酸相比具有降低的毒性的一种或多种立体特异性的硫代磷酸酯寡核苷酸。立体特异的硫代磷酸酯寡核苷酸可以是如本文所公开的本发明的寡核苷酸。在一些实施方案中，母体寡核苷酸是间隙体寡核苷酸，例如本文公开的lna间隙体寡核苷酸。在一些实施方案中，立体特异的硫代磷酸酯寡核苷酸文库包含至少2个，例如至少5个，或至少10个，或至少15个或至少20个立体特异的硫代磷酸酯寡核苷酸。筛选方法还可以包括筛选子寡核苷酸至少一个其他功能参数的步骤，例如rna酶h募集活性，rna酶h切割特异性，靶特异性，靶结合亲和力和/或体内或体外效力的一种或多种。因此，本发明的方法可用于降低与母体寡核苷酸相关的毒性。可以在体外或体内评价寡核苷酸的毒性。体外测定包括胱天蛋白酶测定(参见例如wo2005/023995中公开的胱天蛋白酶测定)或肝细胞毒性测定(参见例如soldatowetal.,toxicolres(camb).2013jan1；2(1):23–39.)。体内毒性通常在临床前筛选中被鉴定，例如在小鼠或大鼠中。体内毒性可以是肝毒性，其通常通过分析血清中的肝转氨酶水平来测量，例如，alt和/或ast，或者可以例如是肾毒性，其可以通过测量肾毒性的分子标记物，例如血清肌酸酐水平或肾损伤标记物mrna，kim-1的水平来测定。因此，通过筛选方法鉴定的所选择的子寡核苷酸因此是更安全的有效反义寡核苷酸。具有立体定向的硫代磷酸酯键的间隙区如wan等人所报道，与硫代磷酸酯键的随机外消旋混合物相比，在间隙体中引入完全rp或完全sp间隙区几乎没有什么好处。本发明基于惊人的益处，即引入至少一种立体定向的硫代磷酸酯键可以实质性改善寡核苷酸的生物学性质，例如，降低的毒性。这可以通过引入一个或多个，例如，2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13或14个立体定向的硫代磷酸酯键，或通过立体限定间隙区域中的所有硫代磷酸酯键来实现。在一些实施方案中，中心区(y’)只有1,2,3,4或5个核苷间键是立体选择性硫代磷酸酯键，而剩余的核苷间键是无规rp或sp。在一些实施方案中，中心区(y’)的所有核苷间键都是立体选择性硫代磷酸酯键。在一些实施方案中，中心区(y’)包含至少5个连续的硫代磷酸酯连接的dna核苷。在一些实施方案中，中心区长度为至少8或9个dna核苷。在一些实施方案中，中心区长度为至少10或11个dna核苷。在一些实施方案中，中心区长度为至少12或13个dna核苷。在一些实施方案中，中心区长度为至少14或15个dna核苷。立体选择性dna基序我们以前已经鉴定了某些dna二核苷酸可能有助于反义寡核苷酸的毒性谱(hagedornetal.,nucleicacidtherapeutics2013,23；302–310)。在本发明的一些实施方案中，可以通过在dna二核苷酸的dna核苷之间引入立体选择性硫代磷酸酯核苷间键来调节反义寡核苷酸(例如本文所述的lna间隙体寡核苷酸)中的dna二核苷酸的毒性，特别是已知促进毒性，例如肝毒性的二核苷酸。在一些实施方案中，通过本发明的方法鉴定的寡核苷酸包含选自cc,tg,tc,ac,tt,gt,ca和gc的dna二核苷酸基序，其中二核苷酸的dna核苷之间的核苷间键是立体定向的硫代磷酸酯键，例如sp或rp硫代磷酸酯核苷间键。通常，这样的二核苷酸可以在间隙体寡核苷酸的间隙区域内，例如lna间隙体寡核苷酸。在一些实施方案中，通过该方法鉴定的寡核苷酸包含至少2个，例如至少3个二核苷酸，其依赖性或独立地选自上述dna二核苷酸基序的列表。rna酶募集应当认识到，寡聚化合物可以通过非rna酶介导的靶mrna的降解起作用，例如通过翻译的空间位阻或其它方法。在一些实施方案中，本发明的寡聚体能够募集内切rna酶(rna酶)，例如rna酶h。优选这样的寡聚体包含连续核苷酸序列(区域y’)，其包含至少6个，例如至少7个连续的核苷酸单元，例如至少8个或至少9个连续的核苷酸单元(残基)，包括7,8,9,10,11,12,13,14,15或16个连续核苷酸，其当与互补靶rna形成双链体时，能够募集rna酶。能够募集rna酶的连续序列可以是如本文所述的间隙体的上下文中所指的区域y’。在一些实施方案中，能够募集rna酶，例如区域y’的连续序列的大小可以更高，例如10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20个核苷酸单位。ep1222309提供了用于确定rna酶h活性的体外方法，其可以用于确定募集rna酶h的能力。使用ep1222309的实施例91-95提供的方法，当被提供有互补rna靶标时，如果以pmol/l/min测量，寡聚体具有使用仅dna寡核苷酸测定的初始速率的至少1％，例如至少5％，如至少10％或20％以上的初始速率，那么寡聚体被认为能够募集rna酶h，所述仅dna寡核苷酸具有相同碱基序列但仅含有dna单体，不含2’取代，在寡核苷酸中的所有单体之间具有硫代磷酸酯连接基团。在一些实施方案中，使用ep1222309的实施例91-95提供的方法，如果寡核苷酸当提供有互补rna靶标和rna酶h时，以pmol/l/min测量的rna酶h初始速率小于使用等同的仅dna寡核苷酸测定的初始速率的1％，例如小于5％，例如小于10％或小于20％，则寡聚体被认为基本上不能募集rna酶h，所述等同的仅dna寡核苷酸没有2’取代，寡核苷酸中所有核苷酸之间具有硫代磷酸连接基团。在其它实施方案中，使用ep1222309的实施例91-95提供的方法，当被提供有互补rna靶标和rna酶h时，如果以pmol/l/min测量，rna酶h初始速率为使用等同的仅dna寡核苷酸测定的初始速率的至少20％，例如至少40％，例如至少60％，例如至少80％，那么寡聚体被认为能够募集rna酶h，所述等同的仅dna寡核苷酸没有2’取代，在寡核苷酸中的所有核苷酸之间具有硫代磷酸酯连接基团。通常，形成连续核苷酸单元的寡聚体的区域当与互补靶rna形成双链体时能够募集由核苷酸单元组成的rna酶，所述核苷酸单元与rna靶标形成dna/rna样双链体。本发明的寡聚体，例如第一区域，可以包含核苷酸序列，其包含核苷酸和核苷酸类似物，并且可以是例如间隙体，头体(headmer)或尾体(tailmer)的形式。“头体”定义为包含区域x’和与其相邻的区域y’的寡聚体，其中区域y’的最5’单体与区域x’的最3’单体连接。区域x’包含非rna酶募集核苷类似物的连续的片段，并且区域y’包含dna单体的连续片段(例如至少7个连续单体)或由rna酶可识别和切割的核苷类似物单体。“尾体”定义为包含区域x’和与其邻接的区域y’的寡聚体，其中区域y的最5’单体连接到区域x’的最3’单体。区域x’包含由rna酶可识别和可切割的dna单体或核苷类似物单体的连续片段(例如至少7个连续单体)，并且区域x’包含非rna酶募集核苷类似物的连续片段。在一些实施方案中，除了增强寡聚体对靶区域的亲和力之外，一些核苷类似物还介导rna酶(例如rna酶h)结合和切割。由于α-l-lna(bna)单体在一定程度上募集rna酶h活性，在一些实施方案中，含有α-l-lna单体的寡聚体的间隙区域(例如，本文所述的区域y’)由可被rna酶h识别和切割的较少的单体组成，并且在混合体构建中引入了更大的灵活性。间隙体设计在一些实施方案中，本发明的寡聚体包含或是lna间隙体。间隙体寡聚体是一种寡聚体，其包含能够募集rna酶，例如rna酶h的连续的核苷酸片段，例如至少5,6或7个dna核苷酸的区域，在本文称为区域y’(y‘)，其中区域y’的5’和3’侧翼均是增强亲和力的核苷酸类似物区域，例如能够募集rna酶的连续的核苷酸片段5’和3’的1-6个增强亲和力的核苷酸类似物-这些区域分别被称为区域x’(x’)和z’(z’)。间隙体的实例公开于wo2004/046160,wo2008/113832,和wo2007/146511中。本发明的lna间隙体寡聚体在区域x’或z’中包含至少一个lna核苷，例如区域x’中至少一个lna核苷和区域z’中至少一个lna核苷酸。在一些实施方案中，能够募集rna酶的单体选自dna单体，α-l-lna单体，c4’烷基化dna单体(参见pct/ep2009/050349和vester等，vesteretal.,bioorg.med.chem.lett.18(2008)2296–2300，其通过引用并入本文)和una(未连接的核酸)核苷酸(参见fluiteretal.,mol.biosyst.,2009,10,1039，通过引用并入本文)。una是解锁的核酸，通常其中核糖的c2–c3c-c键被去除，形成解锁的“糖”残基。优选地，间隙体包含式x’-y’-z’(5’至3’)的(多)核苷酸序列，其中：区域x’(x’)(5’区域)组成为或包含至少一个高亲和力核苷酸类似物，例如至少一个lna单元，例如1-6个增强亲和力的核苷酸类似物，例如lna单元，和区域y’(y’)组成为或包含至少五个连续的核苷酸，其能够募集rna酶(当与互补rna分子形成双链体，例如mrna靶标时)，例如dna核苷酸，和区域z’(z’)(3’区域)组成为或包含至少一个高亲和力核苷酸类似物，如至少一个lna单元，例如1-6个增强亲和力的核苷酸类似物，如lna单元。在一些实施方案中，区域x’包含或由1,2,3,4,5或6个lna单元组成，例如2-5个lna单元，例如3或4个lna单元；和/或区域z’组成为或包含1,2,3,4,5或6个lna单元，例如2-5个lna单元，例如3或4个lna单元。在一些实施方案中，区域x’可以包含1,2,3,4,5或6个2’取代的核苷酸类似物，例如2’moe；和/或区域z’包含1,2,3,4,5或6个2’取代的核苷酸类似物，例如2’moe单元。在一些实施方案中，2’位上的取代基选自f；cf3,cn,n3,no,no2,o-,s-,或n-烷基；o-，s-或n-烯基；o-，s-或n炔基；或o-烷基-o-烷基，o-烷基-n-烷基或n-烷基-o-烷基，其中烷基，烯基和炔基可以是取代或未取代的c1-c10烷基或c2-c10烯基和炔基。2’取代基的实例包括但不限于o(ch2)och3,和o(ch2)nh2,，其中n为1至约10，例如moe,dmaoe,dmaeoe。在一些实施方案中，y’组成为或包含5,6,7,8,9,10,11或12个连续核苷酸，其能够募集rna酶，或6-10，或7-9，如8个连续核苷酸，其能够募集rna酶。在一些实施方案中，区域y’组成为或包含至少一个dna核苷酸单元，例如1-12个dna单元，优选4-12个dna单元，更优选6-10个dna单元，如7-10个dna单元，例如8,9或10个dna单元。在一些实施方案中，区域x’由3或4个核苷酸类似物，例如lna组成，区域x’由7,8,9或10个dna单元组成，并且区域z’由3或4个核苷酸类似物如lna组成。这样的设计包括(x’-y’-z’)3-10-3,3-10-4,4-10-3,3-9-3,3-9-4,4-9-3,3-8-3,3-8-4,4-8-3,3-7-3,3-7-4,4-7-3。wo2004/046160中公开了另外的间隙体设计，其通过引用并入本文。wo2008/113832(其要求通过引用并入本文的美国临时申请60/977,409的优先权)涉及“短体”(shortmer)间隙体寡聚物。在一些实施方案中，这里呈现的寡聚体可以是这样的短体间隙体。在一些实施方案中，寡聚体，例如区域x’由总共10,11,12,13或14个核苷酸单元的连续核苷酸序列组成，其中连续核苷酸序列包含或为式(5’-3’)，x’-y’-z’其中；x’由1,2或3个增强亲和力的核苷酸类似物单元，如lna单元组成；y’由7,8或9个连续核苷酸单元组成，其当与互补rna分子(例如mrna靶)形成双链体时，能够募集rna酶；z’由1,2或3个增强亲和力的核苷酸类似物单元，例如lna单元组成。在一些实施方案中，寡聚体包含总共10,11,12,13,14,15或16个核苷酸单元的连续核苷酸序列，其中连续核苷酸序列包含或为式(5’-3’)，x’-y’-z’其中；x’包括1,2,3或4个lna单元；y’由7,8,9或10个连续核苷酸单元组成，其当与互补rna分子(例如mrna靶)例如dna核苷酸形成双链体时，能够募集rna酶。z’包含1,2,3或4个lna单元。在一些实施方案中，x’由1个lna单元组成。在一些实施方案中，x’由2个lna单元组成。在一些实施方案中，x’由3个lna单元组成。在一些实施方案中，z’由1个lna单元组成。在一些实施方案中，z’由2个lna单元组成。在一些实施方案中，z’由3个lna单元组成。在一些实施方案中，y’由7个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，y’由8个核苷酸单元组成。在一些实施方案中，y’由9个核苷酸单元组成。在某些实施方案中，区域y’由10个核苷单体组成。在某些实施方案中，区域y’由1-10个dna单体组成或包含所述单体。在一些实施方案中，y’包含1-9个dna单元，例如2,3,4,5,6,7,8或9个dna单元。在一些实施方案中，y’由dna单元组成。在一些实施方案中，y’包含处于α-l构型的至少一个lna单元，例如α-l构型中的2,3,4,5,6,7,8或9个lna单元。在一些实施方案中，y’包含至少一个α-l-氧基lna单元，或者其中α-l-构型中的所有lna单元都是α-l-氧基lna单元。在一些实施方案中，存在于x’-y’-z’中的核苷酸数目选自(核苷酸类似物单元-区域y’-核苷酸类似物单元)：1-8-1,1-8-2,2-8-1,2-8-2,3-8-3,2-8-3,3-8-2,4-8-1,4-8-2,1-8-4,2-8-4,or；1-9-1,1-9-2,2-9-1,2-9-2,2-9-3,3-9-2,1-9-3,3-9-1,4-9-1,1-9-4,或；1-10-1,1-10-2,2-10-1,2-10-2,1-10-3,3-10-1。在一些实施方案中，x’-y’-z’中的核苷酸数目选自：2-7-1,1-7-2,2-7-2,3-7-3,2-7-3,3-7-2,3-7-4,和4-7-3。在某些实施方案中，区域x’和y’各自由三个lna单体组成，并且区域y’由8或9或10个核苷单体，优选dna单体组成。在一些实施方案中，x’和z’均由两个lna单元组成，y’由8或9个核苷酸单元，优选dna单元组成。在各种实施方案中，其它间隙体设计包括其中区域x’和/或z’由3,4,5或6个核苷类似物，例如含有2’-o-甲氧基乙基-核糖糖(2’-moe)的单体或含有2’-氟脱氧核糖糖的单体组成的那些，y’由8,9,10,11或12个核苷，如dna单体组成，其中区域x’-y’-z’具有3-9-3,3-10-3,5-10-5或4-12-4单体。wo2007/146511a2(其通过引用并入本文中)公开了其他的间隙体设计。在本文报道的间隙体设计中，间隙区域(y’)可以包含一个或多个立体定向的硫代磷酸酯键，并且间隙区域的剩余的核苷间键可以例如是非立体定向的核苷间键，或者也可以是立体定向的硫代磷酸酯键。核苷酸间键通过本发明的方法鉴定的寡聚体包含至少一个立体定向的硫代磷酸酯键。虽然用于治疗性用途的大多数化合物使用硫代磷酸酯核苷酸间键，但是可能使用其它核苷间键。然而，在一些实施方案中，本发明的寡聚体的所有核苷间键都是硫代磷酸酯核苷间键。在一些实施方案中，间隙区域中的键均为硫代磷酸酯，并且翼区域的核苷间键可以是硫代磷酸酯或磷酸二酯键。本文所述的寡聚体的核苷单体通过[核苷间]连接基团偶联在一起。适当地，每个单体通过连接基团与3’相邻的单体连接。本领域普通技术人员将理解，在本发明的上下文中，寡聚体末端的5’单体不包含5’连接基团，尽管它可以包含或可以不包含5’末端基团。术语“连接基团”或“核苷酸间键”旨在表示能够共价偶联两个核苷酸的基团。具体和优选的实例包括磷酸基和硫代磷酸酯基。本发明寡聚体的核苷酸或其连续核苷酸序列通过连接基团偶联在一起。每个核苷酸适当地通过连接基团与3’相邻的核苷酸连接。合适的核苷酸间键包括在wo2007/031091中列出的那些，例如wo2007/031091(引入本文作为参考)的第34页第一段所列的核苷酸间键。在一些实施方案中，期望将其核苷酸间键从其正常磷酸二酯修饰为对核酸酶攻击更具抗性的核苷酸键，例如硫代磷酸酯或硼代磷酸酯(boranophosphate)-这两个可被rna酶h切割，也允许降低靶基因的表达中的反义抑制途径。如本文提供的含有核苷酸间键的合适的硫(s)可能是优选的，例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。对于间隙体，寡聚体中的核苷酸间键可以是例如硫代磷酸酯或硼代磷酸酯，以便允许靶向rna的rna酶h切割。通常优选硫代磷酸酯，用于改善核酸酶抗性和其它原因，例如容易制造。wo09124238是指具有通过中性核苷间键连接至3’或5’末端的至少一个双环核苷(lna)的寡聚化合物。因此，本发明的寡聚体可以具有通过中性核苷间键连接至3’或5’末端的至少一个双环核苷，例如一个或多个磷酸三酯，膦酸甲酯，mmi，酰胺-3，甲缩醛或硫代甲缩醛。剩余的键可以是硫代磷酸酯。立体控制的单体立体控制的单体是寡核苷酸合成中使用的单体，其赋予寡核苷酸中的立体定向的硫代磷酸酯核苷间键，即sp或rp。在一些实施方案中，单体可以是亚酰胺，例如亚磷酰胺。因此，在一些实施方案中，单体可以是立体控制/受控的亚酰胺，例如立体控制/受控的亚磷酰胺。在实施例，或在okaetal.,j.am.chem.soc.2008,130,1603116037916031中提供合适的单体。也参见wo10064146，wo11005761，wo13012758，wo14010250，wo14010718，wo14012081和wo15107425。术语立体受控的/立体控制在本文中可互换使用，也可以被称为立体特异性/立体定向单体。因为立体控制的单体因此可以被称为立体控制的“硫代磷酸酯”单体。术语立体控制的和立体控制在本文中可互换使用。在一些实施方案中，立体控制单体在寡核苷酸合成期间与硫代化剂(sulfarizingagent)一起使用时，在新引入的核苷(或生长的寡核苷酸链的5’侧)的3’侧产生立体定向的核苷间键。核苷和核苷类似物在一些实施方案中，术语“核苷类似物”和“核苷酸类似物”可互换使用。本文所用的术语“核苷酸”是指包含糖部分，碱基部分和共价连接基团(连接基团)如磷酸酯或硫代磷酸酯核苷酸间连接基团的糖苷，并且覆盖天然存在的核苷酸，例如dna或rna，以及包含修饰的糖和/或碱基部分的非天然存在的核苷酸，其在本文中也称为“核苷酸类似物”。这里，单个核苷酸(单元)也可以称为单体或核酸单元。在生物化学领域中，术语“核苷”通常用于指包含糖部分和碱基部分的糖苷，因此可以在涉及通过寡聚体的核苷酸之间的核苷酸间键共价连接的核苷酸单元时使用。在生物
技术领域：
，术语“核苷酸”通常用于指核酸单体或单元，因此在寡核苷酸的上下文中可以指碱基-例如“核苷酸序列”，通常指核碱基序列(即糖主链和核苷间键的存在是隐含的)。同样地，特别是在一个或多个核苷间连接基团被修饰的寡核苷酸的情况下，术语“核苷酸”可以指“核苷”，例如可以使用术语“核苷酸”，即使指定核苷之间的连接的存在或性质。如本领域普通技术人员将认识到的，寡核苷酸的5’末端核苷酸不包含5’核苷酸间连接基团，尽管可以包含或可以不包含5’末端基团。非天然存在的核苷酸包括具有修饰的糖部分的核苷酸，例如双环核苷酸或2’修饰的核苷酸，例如2’取代的核苷酸。由于糖和/或碱基部分的修饰，“核苷酸类似物”是天然核苷酸例如dna或rna核苷酸的变体。原则上，类似物可以仅在寡核苷酸的上下文中对天然核苷酸“沉默”或“等同”，即对寡核苷酸工作以抑制靶基因表达的方式没有功能影响。但是，如果例如制造更容易或更便宜，或对储存或制造条件更稳定，或代表标签或标记，则这种“等同”类似物可能仍然是有用的。然而，优选地，类似物将对寡聚体起抑制表达的方式具有功能性作用；例如通过产生对靶的增加的结合亲和力和/或增加的对细胞内核酸酶的抗性和/或增加运输到细胞的容易性。核苷类似物的具体实例由例如，freier&altmann；nucl.acidres.,1997,25,4429-4443anduhlmann；curr.opinionindrugdevelopment,2000,3(2),293-213,和方案1描述：方案1因此，寡聚体可以包含或组成为天然存在的核苷酸的简单序列-优选2’-脱氧核苷酸(在本文中通常称为“dna”)，也可能是核糖核苷酸(本文通常称为“rna”)或这种天然存在的核苷酸和一个或多个非天然存在的核苷酸，即核苷酸类似物的组合。这样的核苷酸类似物可以适当增强寡聚体对靶序列的亲和力。合适的和优选的核苷酸类似物的实例由wo2007/031091提供或在本文参考。在寡聚体(例如lna或2’-取代的糖)中掺入亲和力增强的核苷酸类似物可以使特异性结合的寡聚体的尺寸减小，并且也可以在发生非特异性或异常结合之前降低寡聚体大小的上限。本发明方法的寡聚体是指母体和子寡核苷酸。在一些实施方案中，母体和子寡核苷酸包含至少1个核苷酸类似物。在一些实施方案中，母体和子寡核苷酸包含至少2个核苷酸类似物。在一些实施方案中，母体和子寡核苷酸包含3-8个核苷酸类似物，例如，6或7个核苷酸类似物。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一个是锁定核酸(lna)；例如至少3个或至少4个，或至少5个，或至少6个，或至少7个，或8个核苷酸类似物可以是lna。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物可以是lna。应当认识到，当提及仅由核苷酸组成的优选的核苷酸序列基序或核苷酸序列时，由该序列定义的寡聚体可以包含相应的核苷酸类似物代替所述序列中存在的一个或多个核苷酸，例如lna单元或其他核苷酸类似物，其提高寡聚体/靶双链体的双链体稳定性/tm(即增强亲和力的核苷酸类似物)。核苷酸的这种修饰的实例包括修饰糖部分以提供2’-取代基或产生增强结合亲和力并且还可提供增加的核酸酶抗性的桥接(锁定核酸)结构。优选的核苷酸类似物是lna，例如氧-lna(例如β-d-氧-lna和α-l-氧-lna)和/或氨基-lna(例如β-d-氨基-lna和α-l-氨基-lna)和/或硫代-lna(例如β-d-硫代-lna和α-l-硫代-lna)和/或ena(例如β-d-ena和α-l-ena)。最优选的是β-d-氧-lna。在一些实施方案中，存在于本发明方法的寡聚体内的核苷酸类似物(例如本文提及的区域x’和y’)独立地选自例如2’-o-烷基-rna单元，2’-氨基-dna单元，2’-氟-dna单元，lna单元，阿拉伯核酸(ana)单元，2’-氟-ana单元，hna单元，ina(嵌入核酸-christensen，2002.nucl.acids.res200230：4918-4925，通过引用并入本文)单元和2’moe单元。在一些实施方案中，仅有一种上述类型的核苷酸类似物存在于本发明方法的寡聚体或其连续核苷酸序列中。在一些实施方案中，核苷酸类似物是2’-o-甲氧基乙基-rna(2’moe)，2’-氟-dna单体或lna核苷酸类似物，因此本发明的寡核苷酸可以包含独立地选自这三种类型的类似物的核苷酸类似物，或者可以仅包括从三种类型中选出的一种类型的类似物。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一个是2’-moe-rna，例如2,3,4,5,6,7,8,9或10个2’-moe-rna核苷酸单元。在一些实施方案中，所述核苷酸类似物中的至少一个是2’-氟dna，例如2,3,4,5,6,7,8,9或10个2’-氟-dna核苷酸单元。在一些实施方案中，根据方法发明的寡聚体包含至少一种锁定核酸(lna)单元，例如1,2,3,4,5,6,7或8个lna单元，例如3-7或4到8个lna单元，或3,4,5,6或7个lna单元。在一些实施方案中，所有核苷酸类似物都是lna。在一些实施方案中，寡聚体可以包含β-d-氧-lna和一种或多种以下lna单元：硫代-lna，氨基-lna，氧-lna和/或ena，其为β-d或α-l构型或其组合。在一些实施方案中，所有lna胞嘧啶单元是5’-甲基-胞嘧啶。在本发明的一些实施方案中，寡聚体可以包含lna和dna单元。优选地，lna和dna单元的组合总数为10-25，例如10-24，优选10-20，如10-18，甚至更优选12-16。在本发明的一些实施方案中，寡核苷酸的核苷酸序列，例如连续核苷酸序列由至少一个lna组成，其余的核苷酸单元是dna单元。在一些实施方案中，寡聚体仅包含lna核苷酸类似物和天然存在的核苷酸(例如rna或dna，最优选dna核苷酸)，任选地具有修饰的核苷酸间键如硫代磷酸酯。术语“核碱基”是指核苷酸的碱基部分，并且覆盖天然存在的以及非天然存在的变体。因此，“核碱基”不仅涵盖已知的嘌呤和嘧啶杂环，还包括其杂环类似物和互变异构体。核碱基的实例包括但不限于腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸苷，尿嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤。在一些实施方案中，寡聚体中存在的核碱基中的至少一个是选自5-甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假异胞嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶，6-氨基嘌呤，2-氨基嘌呤，肌苷，二氨基嘌呤和2-氯-6-氨基嘌呤的修饰的核碱基。lna术语“lna”是指被称为“锁定核酸”的双环核苷类似物。它可以指lna单体，或者当在“lna寡核苷酸”的上下文中使用时，lna是指含有一个或多个这样的双环核苷酸类似物的寡核苷酸。lna核苷酸的特征在于核糖糖环的c2’和c4’之间存在连接基团(例如桥)，例如如下所述的双基r4*-r2*所示。在本发明的寡核苷酸化合物中使用的lna优选具有通式i的结构其中对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团；其中x选自-o-,-s-,-n(rn*)-,-c(r6r6*)-，如在某些实施方案中为-o-；b选自氢，任选取代的c1-4-烷氧基，任选取代的c1-4-烷基，任选取代的c1-4-酰氧基，核碱基，包括天然存在和核碱基类似物，dna嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团和配体；优选地，b是核碱基或核碱基类似物；p表示与相邻单体的核苷酸间键或5’-末端基团，此类核苷酸间键或5’-末端基团任选包括取代基r5或同样可应用的取代基r5*；p*表示与相邻单体或3’-末端基团的核苷酸间键；r4*和r2*一起表示由选自-c(rarb)-,-c(ra)＝c(rb)-,-c(ra)＝n-,-o-,-si(ra)2-,-s-,-so2-,-n(ra)-,和>c＝z的1-4个基团/原子组成的二价接头基团，其中z选自-o-,-s-,和-n(ra)-，ra和rb各自独立地选自氢，任选取代的c1-12-烷基，任选取代的c2-12-烯基，任选取代的c2-12-炔基，羟基，任选取代的c1-12-烷氧基，c2-12-烷氧基烷基，c2-12-烯氧基，羧基，c1-12-烷氧基羰基，c1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(c1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单和二(c1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-c1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(c1-6-烷基)氨基-c1-6-烷基-氨基羰基，c1-6-烷基-羰基氨基，脲基，c1-6-烷酰氧基，磺酰基，c1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，c1-6-烷硫基，卤素，dna嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且其中两个偕取代基ra和rb一起可以表示任选取代的亚甲基(＝ch2)，其中对于所有手性中心，不对称基团可以以r或s取向找到；存在的取代基r1*,r2,r3,r5,r5*,r6和r6*各自独立地选自氢，任选取代的c1-12-烷基，任选取代的c2-12-烯基，任选取代的c2-12-炔基，羟基，c1-12-烷氧基，c2-12-烷氧基烷基，c2-12-烯氧基，羧基，c1-12-烷氧基羰基，c1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳基氧基-羰基，杂芳基氧基，杂芳基羰基，氨基，单和二(c1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单-和二(c1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-c1-6-烷基-氨基羰基，单-和二(c1-6-烷基)氨基-c1-6-烷基-氨基羰基，c1-6-烷基-羰基氨基，脲基，c1-6-烷酰氧基，磺酰基，c1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，c1-6-烷硫基，卤素，dna嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报告基团和配体，其中芳基和杂芳基可以被任选取代，并且其中两个偕取代基一起可以表示氧代，硫氧代，亚氨基或任选取代的亚甲基；其中rn选自氢和c1-4-烷基，并且其中两个相邻(非偕)取代基可以表示另外的键，得到双键；并且当存在且不参与双基时，rn*选自氢和c1-4-烷基；及其碱式盐和酸加成盐。对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示由选自c(rarb)-c(rarb)-,c(rarb)-o-,c(rarb)-nra-,c(rarb)-s-,和c(rarb)-c(rarb)-o-的基团组成的双基，其中每个ra和rb可以任选地独立地选择。在一些实施方案中，ra和rb可以任选地独立地选自氢和c1-6烷基，例如甲基，例如氢。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示r-或s-构型的双基o-ch(ch2och3)-(2o-甲氧基乙基双环核酸-sethatal.,2010,j.org.chem)。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示r-或s构型的双基–o-ch(ch2ch3)-(2’o-乙基双环核酸-sethatal.,2010,j.org.chem)。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示r-或s构型的双基–o-ch(ch3)-。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示双基o-nr-ch3--(sethatal.,2010,j.org.chem)。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示双基–o-nr-ch3-(sethatal.,2010,j.org.chem)。在一些实施方案中，lna单元具有选自以下组的结构：在一些实施方案中，r1*,r2,r3,r5,r5*独立地选自氢，卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6-炔基或取代的c2-6炔基，c1-6烷氧基，取代的c1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，c1-6氨基烷基或取代的c1-6氨基烷基。对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团。在一些实施方案中，r1*,r2,r3,r5,r5*是氢。在一些实施方案中，r1*,r2,r3独立地选自氢，卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基或取代的c2-6炔基，c1-6烷氧基，取代的c1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，c1-6氨基烷基或取代的c1-6氨基烷基。对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团。在一些实施方案中，r1*,r2,r3为氢。在一些实施方案中，r5和r5*各自独立地选自h,–ch3,-ch2-ch3,-ch2-o-ch3,和-ch＝ch2。适当地，在一些实施方案中，r5或r5*是氢，其中另一基团(分别为r5或r5*)选自c1-5烷基，c2-6烯基，c2-6炔基，取代的c1-6烷基，取代的c2-6烯基，取代的c2-6炔基或取代的酰基(-c(＝o)-)；其中每个取代基是取代基单取代或多取代的，所述取代基独立地选自卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基，取代的c2-6炔基，oj1,sj1,nj1j2,n3,cooj1,cn,o-c(＝o)nj1j2,n(h)c(＝nh)nj,j2或n(h)c(＝x)n(h)j2其中x为o或s；并且每个j1和j2独立地是h，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基，取代的c2-6炔基，c1-6氨基烷基，取代的c1-6氨基烷基或保护基。在一些实施方案中，r5或r5*是取代的c1-6烷基。在一些实施方案中，r5或r5*是取代的亚甲基，其中优选的取代基包括一个或多个独立地选自f,nj1j2,n3,cn,oj1,sj1,o-c(＝o)nj1j2,n(h)c(＝nh)nj,j2或n(h)c(o)n(h)j2的基团。在一些实施方案中，每个j1和j2独立地为h或c1-6烷基。在一些实施方案中，r5或r5*是甲基，乙基或甲氧基甲基。在一些实施方案中，r5或r5*是甲基。在另一个实施方案中，r5或r5*是亚乙基。在一些实施方案中，r5或r5*是取代的酰基。在一些实施方案中，r5或r5*是c(＝o)nj1j2。对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团。这种5’修饰的双环核苷酸公开在wo2007/134181中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，b是核碱基，包括核碱基类似物和天然存在的核碱基，例如嘌呤或嘧啶或取代的嘌呤或取代的嘧啶，例如本文所述的核碱基，例如选自以下的核碱基：腺嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶，腺嘌呤，尿嘧啶和/或修饰或取代的核碱基，如5-噻唑并-尿嘧啶，2-硫代-尿嘧啶，5-丙炔基-尿嘧啶，2’-硫代胸腺嘧啶，5-甲基胞嘧啶，5-噻唑并-胞嘧啶，5-丙炔基-胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示选自-c(rarb)-o-,-c(rarb)-c(rcrd)-o-,-c(rarb)-c(rcrd)-c(rerf)-o-,-c(rarb)-o-c(rcrd)-,-c(rarb)-o-c(rcrd)-o-,-c(rarb)-c(rcrd)-,-c(rarb)-c(rcrd)-c(rerf)-,-c(ra)＝c(rb)-c(rcrd)-,-c(rarb)-n(rc)-,-c(rarb)-c(rcrd)-n(re)-,-c(rarb)-n(rc)-o-,和-c(rarb)-s-,-c(rarb)-c(rcrd)-s-的双基，其中ra,rb,rc,rd,re,和rf各自独立地选自氢，任选取代的c1-12-烷基，任选取代的c2-12-烯基，任选取代的c2-12-炔基，羟基，c1-12-烷氧基，c2-12-烷氧基烷基，c2-12-烯氧基，羧基，c1-12-烷氧基羰基，c1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基-羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，单和二(c1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单和二((c1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-c1-6-烷基-氨基羰基，单-和二-(c1-6-烷基)氨基-c1-6-烷基-氨基羰基，c1-6-烷基-羰基氨基，脲基，c1-6-烷酰氧基，磺酰基，c1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，c1-6-烷硫基，卤素，dna嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且其中两个偕取代基ra和rb可以一起表示任选取代的亚甲基(＝ch2)。对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团。在另一个实施方案中，r4*和r2*一起表示选自-ch2-o-,-ch2-s-,-ch2-nh-,-ch2-n(ch3)-,-ch2-ch2-o-,-ch2-ch(ch3)-,-ch2-ch2-s-,-ch2-ch2-nh-,-ch2-ch2-ch2-,-ch2-ch2-ch2-o-,-ch2-ch2-ch(ch3)-,-ch＝ch-ch2-,-ch2-o-ch2-o-,-ch2-nh-o-,-ch2-n(ch3)-o-,-ch2-o-ch2-,-ch(ch3)-o-,和–ch(ch2-o-ch3)-o-,和/或,-ch2-ch2-,和-ch＝ch-的双基(二价基团)。对于所有手性中心，不对称基团以r或s取向找到。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示双基c(rarb)-n(rc)-o-,其中ra和rb独立地选自氢，卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基或取代的c2-6炔基，c1-6烷氧基，取代的c1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，c1-6氨基烷基或取代的c1-6氨基烷基，如氢；其中rc选自氢，卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基或取代的c2-6炔基，c1-6烷氧基，取代的c1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，c1-6氨基烷基或取代的c1-6氨基烷基如氢。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示双基c(rarb)-o-c(rcrd)-o-,其中ra,rb,rc,和rd独立地选自氢，卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基或取代的c2-6炔基，c1-6烷氧基，取代的c1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，c1-6氨基烷基或取代的c1-6氨基烷基，例如氢。在一些实施方案中，r4*和r2*形成双基–ch(z)-o-，其中z选自c1-6烷基，c2-6烯基，c2-6炔基，取代的c1-6烷基，取代的c2-6烯基，取代的c2-6炔基，酰基，取代的酰基，取代的酰胺，硫醇或取代的硫代；并且其中每个取代基独立地是被任选被保护的取代基单取代或多取代，所述取代基独立地选自卤素，氧代，羟基，oj1,nj1j2,sj1,n3,oc(＝x)j1,oc(＝x)nj1j2,nj3c(＝x)nj1j2和cn，其中每个j1,j2和j3独立地为h或c1-6烷基，x为o，s或nj1。在一些实施方案中，z是c1-6烷基或取代的c1-6烷基。在一些实施方案中，z是甲基。在一些实施方案中，z是取代的c1-6烷基。在一些实施方案中，所述取代基是c1-6烷氧基。在一些实施方案中，z是ch3och2-。对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团。这种双环核苷酸公开在us7,399,845中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，r1*,r2,r3,r5,r5*是氢。在某些实施方案中，r1*,r2,r3*是氢，r5,r5*中的一个或两个可以不同于上述和wo2007/134181中所述的氢。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示在桥中包含取代的氨基的双基，例如组成为或包含双基–ch2-n(rc)-,其中rc是c1–12烷氧基。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示双基–cq3q4-nor-,其中q3和q4独立地选自氢，卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基或取代的c2-6炔基，c1-6烷氧基，取代的c1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，c1-6氨基烷基或取代的c1-6氨基烷基；其中每个取代基独立地被取代基单取代或多取代，所述取代基独立地选自卤素，oj1,sj1,nj1j2,cooj1,cn,o-c(＝o)nj1j2,n(h)c(＝nh)nj1j2或n(h)c(＝x＝n(h)j2，其中x为o或s；j1和j2各自独立地为h，c1-6烷基，c2-6烯基，c2-6炔基，c1-6氨基烷基或保护基。对于所有手性中心，可以以r或s取向发现不对称基团。这种双环核苷酸公开在wo2008/150729中，其通过引用并入本文。在一些实施方案中，r1*,r2,r3,r5,r5*独立地选自氢，卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基或取代的c2-6炔基，c1-6烷氧基，取代的c1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，c1-6氨基烷基或取代的c1-6氨基烷基。在一些实施方案中，r1*,r2,r3,r5,r5*是氢。在一些实施方案中，r1*,r2,r3是氢并且r5,r5*中的一个或两个可以不同于上述和wo2007/134181中所述的氢。在一些实施方案中，r4*和r2*一起表示双基(二价基团)c(rarb)-o-，其中ra和rb各自独立地为卤素，c1-c12烷基，取代的c1-c12烷基，c2-c12烯基，取代的c2-c12烯基，c2-c12炔基，取代的c2-c12炔基，c1-c12烷氧基，取代的c1-c12烷氧基，oj1sj1,soj1,so2j1,nj1j2,n3,cn,c(＝o)oj1,c(＝o)nj1j2,c(＝o)j1,o-c(＝o)nj1j2,n(h)c(＝nh)nj1j2,n(h)c(＝o)nj1j2或n(h)c(＝s)nj1j2；或ra和rb一起为＝c(q3)(q4)；q3和q4各自独立地为h，卤素，c1-c12烷基或取代的c1-c12烷基；每个取代基独立地是用取代基单取代或多取代的，所述取代基独立地选自卤素，c1-c6烷基，取代的c1-c6烷基，c2-c6烯基，取代的c2-c6烯基，c2-c6炔基，取代的c2-c6炔基，oj1,sj1,nj1j2,n3,cn,c(＝o)oj1,c(＝o)nj1j2,c(＝o)j1,o-c(＝o)nj1j2,n(h)c(＝o)nj1j2或n(h)c(＝s)nj1j2；每个j1和j2独立地是h，c1-c6烷基，取代的c1-c6烷基，c2-c6烯基，取代的c2-c6烯基，c2-c6炔基，取代的c2-c6炔基，c1-c6氨基烷基，取代的c1-c6氨基烷基或保护基。这样的化合物公开在wo2009006478a中，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，r4*和r2*形成双基-q-，其中q是c(q1)(q2)c(q3)(q4),c(q1)＝c(q3),c[＝c(q1)(q2)]-c(q3)(q4)或c(q1)(q2)-c[＝c(q3)(q4)]；q1,q2,q3,q4各自独立的是h，卤素，c1-12烷基，取代的c1-12烷基，c2-12烯基，取代的c1-12烷氧基，oj1,sj1,soj1,so2j1,nj1j2,n3,cn,c(＝o)oj1,c(＝o)-nj1j2,c(＝o)j1,-c(＝o)nj1j2,n(h)c(＝nh)nj1j2,n(h)c(＝o)nj1j2或n(h)c(＝s)nj1j2；每个j1和j2独立地是h，c1-6烷基，c2-6烯基，c2-6炔基，c1-6氨基烷基或保护基；并且任选地，其中当q为c(q1)(q2)(q3)(q4)且q3或q4中的一个为ch3时，q3或q4中的至少一个或q1和q2中的一个不为h。在一些实施方案中，r1*,r2,r3,r5,r5*是氢。对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团。这样的双环核苷酸公开在wo2008/154401中，其通过引用完整并入本文。在一些实施方案中，r1*,r2,r3,r5,r5*独立地选自氢，卤素，c1-6烷基，取代的c1-6烷基，c2-6烯基，取代的c2-6烯基，c2-6炔基或取代的c2-6炔基，c1-6烷氧基，取代的c1-6烷氧基，酰基，取代的酰基，c1-6氨基烷基或取代的c1-6氨基烷基。在一些实施方案中，r1*,r2,r3,r5,r5*是氢。在一些实施方案中，r1*,r2,r3是氢，r5,r5*中的一个或两个可以不同于上述和wo2007/134181或wo2009/067647中的氢(α-l-双环核酸类似物)。其它双环核苷类似物及其在反义寡核苷酸中的用途公开在wo2011115818,wo2011/085102,wo2011/017521,wo09100320,wo10036698,wo09124295&wo09006478中。在某些方面，这些核苷类似物可用于本发明的化合物。在一些实施方案中，本发明的寡核苷酸化合物中使用的lna优选具有通式ii的结构：其中y选自-o-,-ch2o-,-s-,-nh-,n(re)和/或–ch2-；z和z*独立地选自核苷酸间键，rh，端基或保护基；b构成天然或非天然核苷酸碱基部分(核碱基)，并且rh选自氢和c1-4-烷基；ra,rbrc,rd和re任选地独立地选自氢，任选取代的c1-12-烷基，任选取代的c2-12-烯基，任选取代的c2-12-炔基，羟基，c1-12-烷氧基，c2-12-烷氧基烷基，c2-12-烯氧基，羧基，c1-12-烷氧基羰基，c1-12-烷基羰基，甲酰基，芳基，芳氧基羰基，芳氧基，芳基羰基，杂芳基，杂芳氧基-羰基，杂芳氧基，杂芳基羰基，氨基，单-和二(c1-6-烷基)氨基，氨基甲酰基，单和二(c1-6-烷基)-氨基-羰基，氨基-c1-6-烷基-氨基羰基，单和二(c1-6-烷基)氨基-c1-6-烷基-氨基羰基，c1-6-烷基-羰基氨基，脲基，c1-6-烷酰氧基，磺酰基，c1-6-烷基磺酰氧基，硝基，叠氮基，硫烷基，c1-6-烷硫基，卤素，dna嵌入剂，光化学活性基团，热化学活性基团，螯合基团，报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可以任选被取代，并且其中两个偕取代基ra和rb一起可以表示任选取代的亚甲基(＝ch2)；并且rh选自氢和c1-4-烷基。在一些实施方案中，ra,rbrc,rd和re任选地独立地选自氢和c1-6烷基，例如甲基。对于所有手性中心，可以以r或s取向找到不对称基团，例如两个示例性的立体化学异构体包括β-d和α-l同种型，其可以如下所示：具体的示例性lna单元如下所示：术语“硫代-lna”包含锁定的核苷酸，其中上述通式中的y选自s或-ch2-s-。硫代-lna可以同时是β-d和α-l构型。术语“氨基-lna”包含锁定的核苷酸，其中上述通式中的y选自-n(h)-,n(r)-,ch2-n(h)-,和-ch2-n(r)-，其中r选自氢和c1-4-烷基。氨基-lna可以是β-d和α-l-构型。术语“氧-lna”包括锁定的核苷酸，其中通式中的y表示-o-。氧-lna可以同时是β-d和α-l构型。术语“ena”包含锁定的核苷酸，其中上述通式中的y是-ch2-o-(其中–ch2-o-的氧原子相对于碱基b连接在2’-位上)。re是氢或甲基。在一些示例性实施方案中，lna选自β-d-氧-lna，α-l-氧-lna，β-d-氨基-lna和β-d-硫代-lna，特别是β-d-氧-lna。缀合物在上下文中，术语“缀合物”旨在表示通过如本文所述的寡聚体与一个或多个非核苷酸或非多核苷酸部分共价连接(“缀合”)形成的异源分子。非核苷酸或非多核苷酸部分的实例包括大分子试剂如蛋白质，脂肪酸链，糖残基，糖蛋白，聚合物或其组合。通常，蛋白质可以是靶蛋白的抗体。典型的聚合物可以是聚乙二醇。因此，在各种实施方案中，本发明的寡聚体可以包含通常由连续的核苷酸序列组成的多核苷酸区域和另外的非核苷酸区域。当提及由连续核苷酸序列组成的本发明的寡聚体时，该化合物可以包含非核苷酸组分，例如缀合物组分。在本发明的各种实施方案中，寡聚化合物与配体/缀合物连接，所述配体/缀合物可以用于增加寡聚化合物的细胞摄取。wo2007/031091提供合适的配体和缀合物，其通过引用并入本文。本发明还提供了包含如本文所述的本发明化合物和共价连接到所述化合物的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分的缀合物。因此，在本发明化合物由本文公开的特定核酸或核苷酸序列组成的各种实施方案中，化合物还可以包含共价连接到所述化合物上的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(例如不包含一个或多个核苷酸或核苷酸类似物)。(与缀合物部分)缀合可以增强本发明的寡聚体的活性，细胞分布或细胞摄取。这些部分包括但不限于抗体，多肽，脂质部分，例如胆固醇部分，胆酸，硫醚，例如，己基-s-三苯甲基硫醇，硫代胆固醇，脂族链，例如十二烷二醇或十一烷基残基，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或1,2-二-o-十六烷基-外消旋-甘油-3-h-膦酸三乙铵，多胺或聚乙二醇链，金刚烷乙酸，棕榈基部分，十八胺或己基氨基-羰基–羟胆固醇部分。本发明的寡聚体还可以与活性药物物质例如阿司匹林，布洛芬，磺胺药物，抗糖尿病药，抗细菌剂或抗生素缀合。在某些实施方案中，缀合部分是固醇，例如胆固醇。在各种实施方案中，缀合的部分包含或组成为带正电荷的聚合物，例如带正电荷的肽，例如1-50，如2-20，例如3-10个氨基酸残基长，和/或聚环氧烷如聚乙二醇(peg)或聚丙二醇-参见wo2008/034123，其通过引用并入本文。合适地，带正电荷的聚合物，例如聚环氧烷可以通过接头如wo2008/034123中所述的可释放的接头连接到本发明的寡聚体上。举例来说，以下galnac缀合物部分可用于本发明的缀合物：本发明还提供包含本发明的寡聚体的缀合物，其包含共价连接到本发明的寡聚体的至少一个非核苷酸或非多核苷酸部分(“缀合的部分”)。在一些实施方案中，本发明的缀合物通过生物可切割接头共价连接到寡聚体，其可以例如是磷酸二酯连接的核苷酸的区域，例如1-5个po连接的dna核苷(wo2014/076195，通过引用并入本文))。优选的缀合基团包括碳水化合物缀合物，例如galnac缀合物，例如三价galnac缀合物(例如参见wo2014/118267，通过引用并入本文)或亲脂性缀合物，例如固醇，例如，胆固醇(wo2014/076195，通过引用并入本文)。活化的寡聚体本文所用的术语“活化的寡聚体”是指本发明的寡聚体，其与至少一个官能部分共价连接(即官能化)，所述官能部分允许寡聚体与一个或多个缀合部分(即其本身不是核酸或单体的部分)共价连接，以形成本文所述的缀合物。通常，官能部分将包含能够通过例如腺嘌呤碱基的3’-羟基或环外nh2基共价键合到寡聚体的化学基团，优选亲水的间隔基和能够结合到缀合部分的端基(例如，氨基，巯基或羟基)。在一些实施方案中，该端基不被保护，例如是nh2基团。在其它实施方案中，端基例如被任何合适的保护基保护，例如被theodorawgreene和petergmwuts，第3版(johnwiley&sons，1999)中的“protectivegroupsinorganicsynthesis”中所述的那些保护基保护。合适的羟基保护基的实例包括酯如乙酸酯，芳烷基如苄基，二苯基甲基或三苯甲基，以及四氢吡喃基。合适的氨基保护基的实例包括苄基，α-甲基苄基，二苯基甲基，三苯基甲基，苄氧基羰基，叔丁氧基羰基，和酰基如三氯乙酰基或三氟乙酰基。在一些实施方案中，官能部分是自切割的。在其它实施方案中，官能部分是可生物降解的。参见例如美国专利号7,087,229，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施方案中，本发明的寡聚体在5’末端官能化，以使缀合部分与寡聚体的5’末端共价连接。在其它实施方案中，本发明的寡聚体可以在3’末端官能化。在其它实施方案中，本发明的寡聚体可以沿主链或杂环碱基部分官能化。在其它实施方案中，本发明的寡聚体可以在多于一个独立地选自5’末端，3’末端，主链和碱基的位置被官能化。在一些实施方案中，本发明的活化的寡聚体通过在合成过程中掺入共价连接到官能部分上的一个或多个单体来合成。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚体用未被官能化的单体合成，并且在合成完成时将寡聚体官能化。在一些实施方案中，寡聚体用含有氨基烷基接头的受阻酯官能化，其中烷基部分具有式(ch2)w，其中w是1至10，优选约6的整数，其中烷基氨基的烷基部分可以是直链或支链，并且其中官能团经由酯基(-o-c(o)-(ch2)2nh)与寡聚体连接。在其它实施方案中，所述寡聚体用含有(ch2)2-巯基(sh)接头的受阻酯官能化，其中w是1至10，优选约6的整数，其中烷基氨基的烷基部分可以是直链或支链，其中官能团通过酯基(-o-c(o)-(ch2)2sh)与寡聚体连接。在一些实施方案中，巯基活化的寡核苷酸与聚合物部分例如聚乙二醇或肽缀合(通过形成二硫键)。含有上述受阻酯的活化的寡聚体可以通过本领域已知的任何方法，特别是通过pct公开号wo2008/034122及其中实施例中公开的方法合成，其全部内容通过引用并入本文。在其它实施方案中，本发明的寡聚体通过基本上如美国专利号4,962,029和4,914,210所述的官能化试剂将巯基，氨基或羟基引入寡聚体而被官能化，即在一端具有亚磷酰胺的基本上线性试剂，其通过亲水间隔链连接到相对端，该相对端包含被保护或未被保护的巯基，氨基或羟基。这些试剂主要与寡聚体的羟基反应。在一些实施方案中，这种活化的寡聚体具有与寡聚体的5’-羟基偶联的官能化试剂。在其它实施方案中，活化的寡聚体具有与3’-羟基偶联的官能化试剂。在其它实施方案中，本发明的活化的寡聚体具有与寡聚体主链上的羟基偶联的官能化试剂。在另外的实施方案中，本发明的寡聚体用多于一种官能化试剂进行官能化，如美国专利号4,962,029和4,914,210中所述，其全部内容通过引用并入本文。合成这些官能化试剂并将其掺入单体或寡聚体的方法公开在美国专利号4,962,029和4,914,210中。在一些实施方案中，固相结合的寡聚体的5’-末端用二烯基亚磷酰胺衍生物官能化，然后通过diels-alder环加成反应将脱保护的寡聚体与例如氨基酸或肽缀合。在各种实施方案中，将含有2’-糖修饰的单体(例如2’-氨基甲酸酯取代的糖或2’-(o-戊基-n-邻苯二甲酰亚氨基)-脱氧核糖)掺入寡聚体促进缀合部分共价连接到寡聚体的糖。在其它实施方案中，使用试剂例如5’-二甲氧基三苯甲基-2’-o-(e-邻苯二甲酰亚胺基氨基戊基)-2’-脱氧腺苷-3’-n，n-二异丙基-氰基乙氧基亚磷酰胺，制备在一个或多个单体的2’-位上具有含氨基接头的寡聚体。参见例如manoharan,etal.,tetrahedronletters,1991,34,7171。在另外的实施方案中，本发明的寡聚体可以在核碱基上，包括在n6嘌呤氨基上，在鸟嘌呤的环外n2上或在胞嘧啶的n4或5位上具有含有胺的官能部分。在各种实施方案中，这种官能化可以通过使用已经在寡聚体合成中官能化的商业试剂来实现。一些功能部分是可商购的，例如，异双功能和同双功能的连接部分可从pierceco.(rockford,ill.)获得。其它市售的连接基团是均可从glenresearchcorporation(sterling,va.)获得的5’-氨基-修饰剂c6和3’-氨基-修饰剂试剂。5’-氨基-修饰剂c6也可作为aminolink-2从abi(appliedbiosystemsinc.,fostercity,calif.)获得，3’-氨基-修饰剂也可从clontechlaboratoriesinc.(paloalto,calif.)获得。组合物本发明的寡聚体可用于药物制剂和组合物中。合适地，这样的组合物包含药学上可接受的稀释剂，载体，盐或佐剂。pct/dk2006/000512提供了合适和优选的药学上可接受的稀释剂，载体和佐剂，其通过引用并入本文。pct/dk2006/000512(其也通过引用并入本文)中还提供了合适的剂量，制剂，给药途径，组合物，剂型，与其它治疗剂的组合，前药制剂。应用本发明的寡聚体可用作例如诊断，治疗和预防的研究试剂。在研究中，这样的寡聚体可以用于特异性抑制在细胞和实验动物中靶蛋白的合成(通常通过降解或抑制mrna，从而防止蛋白质形成)，从而促进靶标的功能分析或其作为治疗干预的目标的有用性的评价。在诊断中，寡聚体可以用于通过northern印迹，原位杂交或类似技术来检测和定量细胞和组织中的靶标表达。对于治疗，通过施用本发明的寡聚化合物来治疗疑似患有疾病或病症的动物或人，可以通过调节靶标的表达来治疗所述动物或人。还提供了通过施用治疗或预防有效量的一种或多种本发明的寡聚体或组合物来治疗哺乳动物，如治疗人的方法，所述哺乳动物怀疑患有或易于患有与靶标表达相关的疾病或病症。通常以有效量施用本发明的寡聚体，缀合物或药物组合物。本发明还提供了本文所述的本发明化合物或缀合物在制备用于治疗本文所述病症的药物或用于治疗本文所述的病症的方法中的用途。本发明还提供了治疗本文所述的病症的方法，所述方法包括将本文所述的本发明的化合物和/或根据本发明的缀合物和/或根据本发明的药物组合物施用于需要其的患者。医学适应证根据本发明的寡聚体和其它组合物可用于治疗与靶标的突变型的过度表达或表达相关的病症。本发明还提供本发明化合物在制备用于治疗本文所述的疾病，病症或病况的药物中的用途。一般说来，本发明的一个方面涉及一种治疗患有或易受与靶标异常水平有关的病症的哺乳动物的方法，其包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的靶向靶标的寡聚体，所述寡聚体包含一个或更多lna单位。通常以有效量施用本发明的寡聚体，缀合物或药物组合物。实施例序列本文使用的化合物具有以下核碱基序列：actgctttccactctgseqidno1tcatggctgcagctseqidno2gcattggtattcaseqidno3cacattccttgctctgseqidno4gcaagcatcctgtseqidno5实施例1如前所述(okaetal.,j.am.chem.soc.2008130:16031–16037,和wanetal.,nar2014,november,在线出版)进行dna3’-o-氧杂氮杂磷杂环戊烷(3’-oxazaphospholidine)单体的合成lna3’-o-氧杂氮杂磷杂环戊烷单体的合成合成方案如文献(okaetal.,jacs,2008,16031-16037.)中所述合成α-苯基-2-吡咯烷甲醇(p5-l和p5-d)。3-oap-lnatl-3-oap-lnat的合成：将pcl3(735μl,6.30mmol)溶于甲苯(7ml)中，冷却至0℃(冰浴)，逐滴加入p5-l(1.12g，6.30mmol)和nmm(1.38ml，12.6mmol)的甲苯(7ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯(4ml)洗涤，并将滤液在40℃和减压下浓缩(schlenk技术)。将残余物溶于thf(8ml)中并用于下一步骤。向5’-odmt-lna-t(2.40g，4.20mmol)的thf(16ml)溶液中加入net3(4.10ml,29.4mmol)。将反应混合物冷却至-74℃，滴加2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷(oxazaphospholidine)的thf溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时。加入etoac，反应混合物用饱和nahco3(两次)，盐水萃取，用na2so4干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化(洗脱剂己烷/etoac30/70+net36％)。产物分离为白色泡沫1.00g(产率30％)。1h-nmr谱(400mhz):(dmso-d6)δ:11.53(1h,s),7.64(1h,m),7.46-7.41(2h,m),7.40-7.19(12h,m),6.92-6.83(4h,m),5.51(1h,d,j＝6.3hz),5.49(1h,s),4.78(1h,d,j＝7.4hz),4.37(1h,s),3.91(1h,m),3.76-3.67(2h,m),3.72(3h,s),3.71(3h,s),3.50(1h,m),3.41(2h,s),2.90(1h,m),1.60-1.46(2h,m),1.51(3h,s),1.15(1h,m),0.82(1h,m).31p-nmrspectrum(160mhz):(dmso-d6)δ:151.3.lcmsesi(m/z):776.2[m-h]-。d-3-oap-lnat的合成将pcl3(1.05ml,9.0mmol)溶于甲苯(12ml)中，冷却至0℃(冰浴)，并滴加p5-d(1.13g，12mmol)和nmm(2.06ml，24mmol)的甲苯(12ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯洗涤，将滤液在40℃和减压下浓缩(schlenk技术)。将残余物溶于thf(18ml)中并用于下一步骤。向5’-odmt-lna-t(3.44g,6.0mmol)的thf(30ml)溶液中加入net3(5.82ml,42mmol)。将反应混合物冷却至-74℃，滴加2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷的thf溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时。加入etoac，反应混合物用饱和nahco3(两次)，盐水萃取，在na2so4上干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化(洗脱剂己烷//etoac30/70+net36％)。产物分离为白色泡沫1.86g(产率36％)，1h-nmr谱(400mhz):(dmso-d6)δ:11.55(1h,s),7.60(1h,m),7.46-7.41(2h,m),7.39-7.22(12h,m),6.91-6.84(4h,m),5.66(1h,d,j＝6.3hz),5.51(1h,s),4.60(1h,d,j＝7.4hz),4.41(1h,s),3.80-3.70(3h,m),3.72(3h,s),3.71(3h,s),3.48-3.37(3h,m),2.96(1h,m),1.61-1.43(2hm),1.51(3h,s)1.10(1h,m),0.80(1h,m).31p-nmr谱(160mhz):(dmso-d6)δ:152.5.lcmsesi(m/z):776.2[m-h]-。3-oap-lnamecl-3-oap-lnamec的合成将pcl3(110μl,1.25mmol)溶于甲苯(3ml)中，冷却至0℃(冰浴)，滴加p5-l(222mg，1.25mmol)和nmm(275μl，2.5mmol)的甲苯(3ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌45分钟，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯洗涤，并将滤液在40℃下减压浓缩(schlenk技术)。将残余物溶于thf(5ml)中，并用于下一步骤。向5’-odmt-lna-c(338mg,0.50mmol)的thf(2.5ml)溶液加入net3(485μl,3.6mmol)。将反应混合物冷却至-70℃，滴加磷光体2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1.45小时。加入etoac(30ml)，反应混合物用饱和nahco3(2×20ml),盐水(20ml)萃取，用na2so4干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化(洗脱剂：在己烷中的etoac从20％至30％+甲苯10％+net37％)。产品分离为白色泡沫228mg(产率47％)。1h-nmr谱(400mhz):(cd3cn)δ:13.3(1h,brs),8.41-8.25(2h,m),7.88(1h,m),7.59(1h,m),7.54-7.47(4h,m),7.41-7.19(12h,m),6.90-6.79(4h,m),5.62(1h,m),5.58(1h,s),4.79(1h,d,j＝7.5hz),4.47(1h,s),3.93(1h,m),3.86(1h,m),3.75(1h,m),3.76(3h,s),3.75(3h,s),3.60-3.47(3h,m),2.99(1h,m),1.83(3h,d,j＝1.2hz),1.65-1.51(2h,m),1.17(1h,m),0.89(1h,m).31p-nmr谱(160mhz):(cd3cn)δ:153.4.lcmsesi(m/z):881.2[m+h]+。d-3-oap-lnamec的合成将pcl3(1.10ml,12.3mmol)溶于甲苯(10ml)中，冷却至0℃(冰浴)，并滴加p5-d(2.17g，12.3mmol)和nmm(2.70ml，2.5mmol)的甲苯(10ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌45分钟，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯洗涤，并将滤液在40℃下减压浓缩(schlenk技术)。将残余物溶于thf(10ml)中并用于下一步骤。向5-odmt-lna-c(3.38g，5mmol)的thf(20ml)溶液加入net3(4.85ml,35mmol)。将反应混合物冷却至-70℃，滴加磷光体2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1.45小时。加入etoac，反应混合物用饱和nahco3(两次)，盐水萃取，经na2so4干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化(洗脱剂：在己烷中的etoac从20％至30％+甲苯10％+net37％)。产物分离为白色泡沫1.09g(产率23％)。1h-nmr谱(400mhz):(cd3cn)δ:12.8(1h,brs),8.34-8.24(2h,m),7.85(1h,d,j＝1.2hz),7.57(1h,m),7.53-7.45(4h,m),7.41-7.22(12h,m),6.89-6.84(4h,m),5.72(1h,d,j＝6.5hz),5.59(1h,s),4.62(1h,d,j＝8.0hz),4.52(1h,s),3.82(2h,dd,j＝24.48.2hz),3.77(1h,m),3.76(3h,s),3.75(3h,s),3.51(2h,s),3.46(1h,m),3.05(1h,m),1.81(3h,s),1.65-1.47(2h,m),1.12(1h,m),0.85(1h,m).31p-nmr谱(160mhz):(cd3cn)δ:153.5.lcmsesi(m/z):881.2[m+h]+。3-oap-lnaal-3-oap-lnaa的合成将pcl3(184μl,2.1mmol)溶于甲苯(5ml)中，冷却至0℃(冰浴)，滴加p5-l(373mg，2,10mmol)和nmm(463μl，4.20mmol)的甲苯(5ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌45分钟，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯(4ml)洗涤，滤液在40℃下减压浓缩(schlenktechnique)。将残余物溶于thf(5ml)中，并用于下一步骤。向5’-odmt-lna-a(960mg,1.40mmol)的thf(7ml)溶液中加入net3(1.36ml,9.80mmol)。将反应混合物冷却至-70℃，滴加磷光体2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷的溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时。加入etoac(50ml)，反应混合物用饱和nahco3(2×30ml)，盐水(30ml)萃取，经na2so4，干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化(洗脱剂己烷/etoac30/70+net36-7％)。产品分离为白色泡沫455mg(产率35％)。1h-nmr谱(400mhz):(dmso-d6)δ:11.33(1h,s),8.76(1h,s),8.53(1h,s),8.11-8.02(2h,m),7.66(1h,m),7.60-7.53(2h,m),7.44-7.38(2h,m),7.35-7.18(10h,m),7.05-6.99(2h,m),6.89-6.82(4h,m),6.21(1h,s),5.27(1h,d,j＝6.6hz),5.19(1h,d,j＝7.9hz),4.81(1h,s),3.93(2h,dd,j＝29.08.2hz),3.77(1h,m),3.71(6h,s),3.51-3.35(3h,m),2.70(1h,m),1.56-1.34(2h,m),1.10(1h,m),0.73(1h,m).31p-nmr谱(160mhz):(dmso-d6)δ:149.9.lcmsesi(m/z):891.1[m+h]+。d-3-oap-lnaa的合成将pcl30.84ml,9.63mmol)溶于甲苯(12ml)中，冷却至0℃(冰浴)，加入p5-d(1.70g，9.63mmol)和nmm(2.12ml，19.3mmol)的甲苯溶液(12ml)。将反应混合物在室温下搅拌45分钟，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯洗涤，滤液在40℃下以减压浓缩(schlenktechnique)。将残余物溶于thf(12ml)中，并用于下一步骤。向5’-odmt-lna-a(3.77,5.50mmol)的thf(20ml)溶液中加入net3(5.30ml,38.5mmol)。将反应混合物冷却至-70℃，滴加磷光体2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷的溶液。将反应混合物在室温下搅拌4小时。加入etoac，反应混合物用饱和nahco3,盐水萃取,经na2so4干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化(洗脱剂己烷/etoac30/70+net36-7％)。产物分离为白色泡沫1.86g(产率36％)。1h-nmr谱(400mhz):(dmso-d6)δ:11.28(1h,s),8.78(1h,s),8.54(1h,s),8.09-8.04(2h,m),7.67(1h,m),7.60-7.54(2h,m),7.42-7.15(14h,m),6.89-6.82(4h,m),6.21(1h,s),5.58(1h,d,j＝6.7hz),5.02(1h,d,j＝8.1hz),4.89(1h,s),3.96(2h,dd,j＝35.48.2hz),3.71(3h,s),3.70(3h,s),3.53-3.33(4h,m),2.90(1h,m),1.54-1.37(2h,m),0.98(1h,m),0.71(1h,m).31p-nmr谱(160mhz):(dmso-d6)δ:150.6,150.5(2％),150.4.lcmsesi(m/z):891.1[m+h]+。3-oap-lnagd-3-oap-lnag的合成将pcl3(1.09ml,12.4mmol)溶于甲苯(12.5ml)中，冷却至0℃(冰浴)，滴加p5-d(2.20g，12.4mmol)和nmm(2.73ml，27.8mmol)的甲苯溶液(12.5ml)。将反应混合物在室温下搅拌45分钟，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯洗涤，滤液在40℃下以减压浓缩(schlenktechnique)。将残余物溶于thf(19ml)中并用于下一步骤。在合成之前，将5’-odmt-lna-g与甲苯共蒸发，然后与吡啶共蒸发(顺序是必要的)。向5’-odmt-lna-g(3.26g,5.0mmol)在thf(15ml)和吡啶(8ml)中的溶液中加入net3(4.85ml,35.0mmol)。将反应混合物冷却至-70℃，滴加磷光体2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2.5小时。加入etoac，反应混合物用饱和nahco3，盐水萃取，经na2so4干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化(洗脱剂thf在etoac中从10％至20％+net36％)。产物分离为白色泡沫1.49g(产率33％)。1h-nmr谱(400mhz):(dmso-d6)δ:11.42(1h,s),8.56(1h,s),7.95(1h,s),7.49-7.38(2h,m),7.36-7.16(12h,m),6.90-6.83(4h,m),5.96(1h,s),5.58(1h,d,j＝6.7hz),4.99(1h,d,j＝8.2hz),4.76(1h,s),3.96-3.85(2h,m),3.72(6h,s),3.62-3.54(1h,m),3.45(2h,s),3.40-3.33(1h,m),3.08(3h,s),2.99(3h,s),2.93-2.84(1h,m),1.53-1.39(2h,m),1.06-0.97(1h,m),0.79-0.63(1h,m).31p-nmr谱(160mhz):(dmso-d6)δ:151.6.lcmsesi(m/z):858.2[m+h]+。l-3-oap-lnag的合成将pcl3(1.00ml,11.4mmol)溶于甲苯(10ml)中，冷却至0℃(冰浴)，滴加p5-l(2.02g，11.4mmol)和nmm(2.50ml，22.7mmol)的甲苯(10ml)溶液。将反应混合物在室温下搅拌45分钟，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯洗涤，滤液在40℃下以减压浓缩(schlenktechnique)。将残余物溶于thf(7ml)中并用于下一步骤。在合成之前，将5’-odmt-lna-g与甲苯共蒸发，然后用吡啶共蒸发(顺序是必要的)。向5-odmt-lna-g(2.86g，4.54mmol)在thf(20ml)和吡啶(12ml)中的溶液中加入net3(4.40ml,31.8mmol)。将反应混合物冷却至-70℃，滴加磷光体2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷的溶液。将反应混合物在室温下搅拌2.5小时。加入etoac，反应混合物用饱和nahco3，盐水萃取，经na2so4干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化(洗脱剂thf在etoac中从10％至20％+net36％)。产物分离为白色泡沫1.44g(产率34％)。1h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ:11.44(1h,s),8.42(1h,s),7.94(1h,s),7.44-7.38(2h,m),7.34-7.23(10h,m),7.03-6.98(2h,m),5.94(1h,s),5.17(1h,d,j＝6.5hz),5.07(1h,d,j＝7.8hz),4.68(1h,s),3.88(1h,d,j＝8.2hz),3.84(1h,d,j＝8.2hz),3.73(3h,s),3.72(3h,s),3.68(1h,m),3.46-3.36(3h,m),3.05(3h,s),2.95(3h,s),2.77(1h,m),1.55-1.38(2h,m),1.07(1h,m),0.75(1h,m).31p-nmr(160mhz,dmso-d6):δ:148.4.lcmsesi(m/z):858.5[m+h]+；856.5[m-h]-。通用合成描述荧光体2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷的合成：将pcl3(1当量)溶于甲苯中，冷却至0℃(冰浴)，滴加p5-l(1当量)和nmm(2.1当量)的甲苯溶液。将反应混合物在室温下搅拌，然后冷却至-72℃。将沉淀物在氩气下过滤，用甲苯洗涤，滤液在40℃下以减压浓缩(schlenktechnique)。将残余物溶于thf中，并用于下一步骤。向5’-odmt-lna核苷(1当量)在thf中的溶液(在g核苷的情况下为吡啶)，加入net3(7eq)。将反应混合物冷却至-70℃，并滴加磷光体2-氯-1,3,2-氧氮杂磷杂环戊烷(2.5eq)溶液。将反应混合物在室温下搅拌。加入etoac，反应混合物用饱和nahco3，盐水萃取，经na2so4干燥并蒸发。残余物通过柱层析纯化。lna单体的结构图使用okaetal.,j.am.chem.soc.2008；16031-16037公开的方法合成了以下lna-氧杂氮杂磷酰胆碱lna单体。上述lna单体用于寡核苷酸合成，并显示出通过hplc测定的立体控制的亚磷酰胺lna寡核苷酸。实施例2合成以下靶向myd88的lna寡核苷酸。axmcxtxgxcxtxtxtxcxcxaxcxtxmcxtxg(parent#1)(seqidno1)axmcxtxgxcxtxtxtxcxcxaxcxtxmcxtxg(parent#1)axmcxtxgxcstxtxtxcxcxaxcxtxmcxtxg(comp#2)axmcxtxgxcxtxtxtxcscxaxcxtxmcxtxg(comp#3)axmcxtxgxcxtxtxtxcxcxaxcstxmcxtxg(comp#4)axmcxtxgxcrtxtxtxcxcxaxcxtxmcxtxg(comp#5)axmcxtxgxcxtxtxtxcrcxaxcxtxmcxtxg(comp#6)axmcxtxgxcxtxtxtxcxcxaxcrtxmcxtxg(comp#7)axmcxtxgxcstxtxtxcscxaxcxtxmcxtxg(comp#8)axmcxtxgxcstxtxtxcxcxaxcstxmcxtxg(comp#9)axmcxtxgxcstxtxtxcscxaxcstxmcxtxg(comp#10)axmcxtxgxcxtxtxtxcscxaxcstxmcxtxg(comp#11)axmcxtxgxcrtxtxtxcrcxaxcxtxmcxtxg(comp#12)axmcxtxgxcrtxtxtxcxcxaxcrtxmcxtxg(comp#13)axmcxtxgxcrtxtxtxcrcxaxcrtxmcxtxg(comp#14)axmcxtxgxcxtxtxtxcrcxaxcrtxmcxtxg(comp#15)axmcxtxgxcxtxtxtxcrcxaxcstxmcxtxg(comp#16)axmcxtxgxcxtxtxtxcscxaxcrtxmcxtxg(comp#17)axmcxtxgxcstxtxtxcrcxaxcxtxmcxtxg(comp#18)axmcxtxgxcstxtxtxcxcxaxcrtxmcxtxg(comp#19)axmcxtxgxcstxtxtxcrcxaxcrtxmcxtxg(comp#20)axmcxtxgxcstxtxtxcrcxaxcstxmcxtxg(comp#21)axmcxtxgxcstxtxtxcscxaxcrtxmcxtxg(comp#22)axmcxtxgxcrtxtxtxcscxaxcxtxmcxtxg(comp#23)axmcxtxgxcrtxtxtxcxcxaxcstxmcxtxg(comp#24)axmcxtxgxcrtxtxtxcscxaxcstxmcxtxg(comp#25)axmcxtxgxcrtxtxtxcscxaxcrtxmcxtxg(comp#26)axmcxtxgxcrtxtxtxcrcxaxcstxmcxtxg(comp#27)大写字母是β-d-氧lna核苷，小写字母是dna核苷。下标x＝来自rp和sp单体的外消旋混合物的随机掺入的硫代磷酸酯键。下标s＝来自sp单体的立体控制的亚磷酰胺键。下标r＝来自rp单体的立体控制的亚磷酰胺键。大写字母c前面的上标m表示5-甲基胞嘧啶lna核苷。实施例3母体化合物#1已被确定为小鼠中肝毒性。在体内测定法中评估化合物#1-27#的肝毒性：使用每组5只nmri雌性小鼠，在第0,3,7,10和14天向每只小鼠施用15mg/kg化合物，并在第16天处死。测定血清alt。也可以如ep1984381，实施例41中所述测量肝毒性，只是使用nmri小鼠，或使用体外肝细胞毒性测定法。实施例4合成如在sethetalj.med.chem2009,52,10-13鉴定为毒性的以下lna寡核苷酸。txmcxaxtxgxgxcxtxgxcxaxgxmcxt(parent#28)(seqidno2)txmcxaxtsgxgxcxtxgxcxaxgxmcxt(comp#29)txmcxaxtxgxgscxtxgxcxaxgxmcxt(comp#31)txmcxaxtxgxgxcxtxgxcsaxgxmcxt(comp#32)txmcxaxtsgxgscxtxgxcxaxgxmcxt(comp#33)txmcxaxtsgxgxcxtxgxcsaxgxmcxt(comp#34)txmcxaxtsgxgscxtxgxcsaxgxmcxt(comp#35)txmcxaxtxgxgscxtxgxcsaxgxmcxt(comp#36)txmcxaxtsgxgrcxtxgxcxaxgxmcxt(comp#37)txmcxaxtsgxgxcxtxgxcraxgxmcxt(comp#38)txmcxaxtsgxgrcxtxgxcraxgxmcxt(comp#39)txmcxaxtxgxgscxtxgxcraxgxmcxt(comp#40)txmcxaxtsgxgrcxtxgxcsaxgxmcxt(comp#41)txmcxaxtsgxgscxtxgxcraxgxmcxt(comp#42)txmcxaxtrgxgxcxtxgxcxaxgxmcxt(comp#43)txmcxaxtxgxgrcxtxgxcxaxgxmcxt(comp#44)txmcxaxtxgxgxcxtxgxcraxgxmcxt(comp#45)txmcxaxtrgxgrcxtxgxcxaxgxmcxt(comp#46)txmcxaxtrgxgxcxtxgxcraxgxmcxt(comp#47)txmcxaxtrgxgrcxtxgxcraxgxmcxt(comp#48)txmcxaxtxgxgrcxtxgxcraxgxmcxt(comp#49)txmcxaxtrgxgscxtxgxcxaxgxmcxt(comp#50)txmcxaxtrgxgxcxtxgxcsaxgxmcxt(comp#51)txmcxaxtrgxgscxtxgxcsaxgxmcxt(comp#52)txmcxaxtxgxgrcxtxgxcsaxgxmcxt(comp#53)txmcxaxtrgxgscxtxgxcraxgxmcxt(comp#54)txmcxaxtrgxgrcxtxgxcsaxgxmcxt(comp#55)大写字母是β-d-氧lna核苷，小写字母是dna核苷。下标x＝来自rp和sp单体的外消旋混合物的随机掺入的硫代磷酸酯键。下标s＝来自sp单体的立体控制的亚磷酰胺键。下标r＝来自rp单体的立体控制的亚磷酰胺键。大写字母c前面的上标m表示5-甲基胞嘧啶lna核苷。实施例5母体化合物#28已被确定为小鼠中肝毒性的。在体内测定法中评估化合物#28–27#的肝毒性：使用每组5只nmri雌性小鼠，在第0,3,7,10和14天向每只小鼠施用15mg/kg化合物，并在第16天处死。测定血清alt。也可以如ep1984381，实施例41中所述测量肝毒性，只是使用nmri小鼠，或使用体外肝细胞毒性测定法。实施例6.具有3个固定的ps核苷间键的化合物文库在体内的耐受性和组织含量在第0天用单一剂量盐水或30mg/kglna反义寡核苷酸的盐水溶液(seqid#1,10或14)静脉内注射c57bl6/j小鼠(5只动物/gr)，并在第8天处死。收集血清，测定所有组的alt。使用elisa法在lna剂量组中测量寡核苷酸含量。结论：将lna寡核苷酸亚组(其中3种硫代磷酸酯核苷间键以s(化合物#10)或r(化合物#14)构型固定)的肝毒性潜力(alt)与非对映异构体的母体混合物(化合物#1)(所有核苷间键为r和s构型的混合物)的alt进行比较。可以看出(图3)，对于一个亚组(化合物#14)，alt读数显著低于母体混合物(化合物#1)和其他亚组化合物(化合物#10)，alt读数与母体相似。此外，肝脏摄取曲线(图4a)显示，具有低alt读数(comp#14)的lna寡核苷酸亚组与母体lna混合物(comp#1)相同的程度地被吸收到肝脏中，而具有与母体混合物(comp#1)相当的alt的另一个亚组(comp#10)被较少吸收到肝脏中。肾吸收(图4b)对于母体lna(化合物#1)和一个亚组(化合物#10)是相似的，而另一个lna寡核苷酸亚组(化合物#14)较高。对于所有3组化合物(图4c)，脾脏的吸收是相似的。通常可以看出，与lna寡核苷酸的母体混合物相比，将立体化学固定在一些位置并由此产生lna寡核苷酸的亚组诱导了诸如吸收和肝毒性潜力之类的性质的差异。材料和方法：实验设计：表2剂量施用。c57bl/6jbom雌性动物，到达时约20克，根据表2，每公斤体重(根据第0天体重)静脉内给予10ml在盐水中配制的化合物或仅盐水。肝和肾组织取样。将动物用70％co2-30％o2麻醉，并根据表2通过颈脱位处死。将一半肝和一个肾冷冻并用于组织分析。通过夹层elisa法测定肝和肾中的寡核苷酸含量。测量alt水平。实施例7手性限定的硫代磷酸酯lna间隙体的rna酶h活性。使用母体化合物3833：5’-gsmcsaststsgsgstsaststsmcsa-3’(seqidno3)其中大写字母表示β-d-氧-lna核苷，小写字母表示dna核苷，下标s表示随机s或r硫代磷酸酯键(在寡核苷酸合成期间不是手性限定的)，c前的上标m表示5-甲基胞嘧啶lna核苷。设计了一系列3833的完全手性限定的变体，其中12个核苷间位置中的每一个都具有r和s的独特模式，如s或r所示。使用人rna酶h测定rna酶h募集活性和切割模式，并与母体化合物3833(手性混合物)以及3833的完全磷酸二酯连接的变体(完全po)和3833化合物(其在中心dna间隙区域内包含磷酸二酯键和lna侧翼中的随机ps键)(po间隙)相比较。化合物：所有化合物在单个实验中进行评估，只是在进行单独实验时标记*。实验：rna酶h1(重组人)对rna的lna寡核苷酸介导的切割。将lna寡核苷酸15pmol和5’fam标记的rna45pmol加入到13μl水中。加入退火缓冲液6μl(200mmkcl,2mmedta,ph7.5)，温度升至90℃保持2分钟。使样品达到室温，并在3μl750mmkcl,500mmtris-hcl,30mmmgcl2,100mm二硫苏糖醇，ph8.3)中加入rna酶h酶(0.15u)。将样品在37℃下保持30分钟，通过加入edta溶液4μl(0.25m)停止反应。切割的rna样品的aie-hplc将样品15μl加入到200μl缓冲液a(10mmnaclo4,1mmedta,20mmtris-hclph7.8)中。将样品进行50μl的ale-hplc注射体积(collumndnapac1002x250，梯度0分钟0.25ml/min，100％a，22分钟22％b(1mmnaclo4,1mmedta,20mmtris-hclph7.8),25min.0.25ml/min.100％b,30min.0.25ml/min.100％b,31min.0.5ml/min.0％b,35min.0.25ml/min.0％b,40min.0.25ml/min.0％b。信号检测，在518nm处荧光发射，在494nm处激发。结果具有序列gmcattggtattmca的lna寡核苷酸的所有磷键被硫醇化。注意到键中硫代磷酸酯的特定手性。没有注意到手性是r和s的混合物。在aie-hplc保留时间下，列出峰面积占所有峰面积之和的百分比。不同lna-寡核苷酸的活性的排序数从手性混合的lna寡核苷酸3833的酶反应后剩下的全长rna除以其余lna寡核苷酸的剩余rna的百分比来计算。结论除了选择s手性的最后一个5’-偶联和选择了点手性的lna寡核苷酸17298-17301之外，随机选择lna寡核苷酸的硫代磷酸酯键的手性。仅在lna寡核苷酸的间隙形式中的完全二酯和二酯具有比混合手性形式3833更少的活性。手性序列增强rna的活化和切割。对于大多数特异性手性lna寡核苷酸，rna酶h1的活化比手性混合的3833的效果更好。特异性序列中最好的序列启动比3833实质上更多的rna切割(30分钟后为98.4％对47.7％)。每个特异性lna寡核苷酸的特征是它们独特的rna切割模式，其从一个到几个切割点变化。实施例8原代肝细胞的体外毒性筛选小鼠肝灌注通过逆行两步胶原酶肝灌注从10至13周龄雄性c57b16小鼠中分离原代小鼠肝细胞。简言之，用戊巴比妥钠(120mg/kg，腹膜内)麻醉喂食的小鼠。灌注管通过右心室插入尾侧腔静脉。在髂总静脉远端的尾侧腔静脉结扎后，切断门静脉，进行两步肝灌注和细胞分离。首先使用由无钙，egta(0.5mm)补充的hepes(20mm)缓冲的汉克平衡盐溶液组成的预灌注溶液灌注肝脏5分钟，然后用nahco3(25mm)补充的含有cacl2(5mm)和胶原酶(0.2u/ml；胶原酶ii型，worthington)的汉克溶液灌注12分钟。流速保持在7ml/min，所有溶液保持在37℃。在原位灌注后，切除肝脏，机械打开肝包膜，将细胞悬浮于不含酚红的william’smediume(wme)(sigmaw-1878)中，并通过一组尼龙细胞过滤器(40-和70目)过滤。通过percoll(sigmap-4937)离心步骤(percoll密度：1.06g/ml，50g，10分钟)和在wme(50xg，3分钟)中另外的离心除去死细胞。使用的化合物5’-mcxaxmcxaxtxtxcxcxtxtxgxcxtxmcxtxg-3’(母体#56)5’-mcxaxmcxaxtxtscxcxtxtsgxcxtsmcxtsg-3’(comp#57)5’-mcxaxmcxaxtxtrcxcxtxtrgxcxtrmcxtrg-3’(comp#58)5’-mcxaxmcxaxtxtscscxtxtsgscxtxmcxtxg-3’(comp#59)5’-mcxaxmcxaxtxtrcrcxtxtrgrcxtxmcxtxg-3’(comp#60)大写字母是β-d-氧lna核苷，小写字母是dna核苷。下标x＝从rp和sp单体的外消旋混合物中随机掺入的硫代磷酸酯键。下标s＝来自sp单体的立体控制的亚磷酰胺键。下标r＝来自rp单体的立体控制的亚磷酰胺键。大写字母c前面的上标m表示5-甲基胞嘧啶lna核苷。肝细胞培养对于细胞培养，将原代小鼠肝细胞以约5x106个细胞/ml悬浮于补充有10％胎牛血清，青霉素(100u/ml)，链霉素(0.1mg/ml)的wme中，并以0.25x106个细胞/孔的密度接种到胶原包被的96孔板(bectondickinsonag，allschwil，switzerland)中。将细胞预培养3至4小时，在用寡核苷酸处理开始之前允许贴壁于细胞培养板。将溶解在pbs中的寡核苷酸加入到细胞培养物中，并在细胞上放置3天。根据制造商的方案，通过使用细胞毒性检测试剂盒(roche11644793001，rochediagnosticsgmbhrocheappliedsciencemannheim，germany)测量释放到培养基中的乳酸脱氢酶(ldh)的量来确定细胞毒性水平。为了测定细胞atp水平，我们根据制造商的方案使用发光细胞活力测定法(g9242，promegacorporation，madisonwi，usa)。每个样品一式三份进行测试。靶标敲减分析根据制造商说明书从小鼠肝细胞rneasy96试剂盒(qiagen，hombrechtikon，瑞士)纯化mrna，其包括无rna酶的dna酶i处理。使用iscript单链cdna合成试剂盒(bio-radlaboratoriesag，reinach，switzerland)合成cdna。使用rochesybrgreenipcr试剂盒和lightcycler480(rochediagnostics，rotkreuz，瑞士)，用特异性dna引物进行定量实时pcr测定(qrt-pcr)。通过δct阈值法进行分析，以确定相对于rps12mrna的表达。每个分析反应一式两份进行，每个条件有两个样品。结果显示在图5和图6中。化合物58和#60具有显著降低的毒性，同时保留对靶标的有效反义活性(myd88)。这些化合物包括rp立体定向的硫代磷酸酯键。实施例9肾毒性筛选测定在以下rptec-tert1培养，寡核苷酸处理和活力测定中使用与实施例6和8中使用的相同的化合物：根据制造商的说明书在ptec培养基(含有1％pen/strep，10mmhepes，5.0μg/ml人胰岛素，5.0μg/ml人转铁蛋白，8.65ng/ml亚硒酸钠，0.1μm氢化可的松，10ng/ml人重组表皮生长因子，3.5μg/ml抗坏血酸，25ng/ml前列腺素e1，3.2pg/ml三碘-l-甲状腺原氨酸和100μg/ml遗传霉素)中培养rptec-tert1(evercytegmbh，austria)。对于活力测定，将ptec-tert1以2×104个细胞/孔的密度接种到96孔板(falcon，353219)中，并在用寡核苷酸处理之前生长直到汇合。将寡核苷酸溶于pbs中，并以10或30μm的终浓度加入到细胞培养物中。更换培养基，每3天新加入寡核苷酸。在寡核苷酸处理9天后，根据制造商的方案，使用luminescentcellviabilityassay(g7571,promegacorporation,madisonwi,usa)测量细胞atp水平来测定细胞活力。计算一式三份孔的平均atp浓度和标准差。pbs作为载体对照。结果示于图8中。化合物#10与非立体特异性化合物#1和化合物#14相比显示出减少的肾毒性。与母体化合物(#56)相比，立体特异性化合物#57，#58，#60显示出显著降低的肾毒性。实施例10手性限定的硫代磷酸酯lna间隙体的错配特异性。所使用的实验程序如实施例7所述，只是使用与母体3833化合物相比在各个位置引入错配的备选rna底物。确定了针对完全匹配rna底物和错配rna底物的rna酶h活性。表3：错配对3833的rna酶h活性的影响。通过使用较粗的字体大小显示错配。30分钟后分析rna酶h切割。切割产物随错配的位置而变化。表4：错配对3833的立体定向变体的rna酶h活性的影响。对于完美匹配的rna底物，手性限定的硫代磷酸酯寡核苷酸倾向于激活rna酶h介导的rna切割比具有混合手性的aso更意义深远。然而，可以发现选择的硫代磷酸酯(aso)构型的手性限定的寡核苷酸具有错配rna的显著降低的rna酶h切割，突出了筛选寡核苷酸的手性限定变体的文库以鉴定具有改善的错配选择性的单个立体定向化合物的能力。实施例11使用母体化合物4358：5′gsmcsasasgscsastscscstsgst3’(seqidno5)其中大写字母表示β-d-氧-lna核苷，小写字母表示dna核苷，下标s表示随机s或r硫代磷酸酯键(在寡核苷酸合成期间不是手性限定的)，c前的上标m表示5-甲基胞嘧啶lna核苷。设计了4358的一系列完全手性限定的变体，其具有在11个核苷间位置中的每一个上r和s的独特模式，如s或r所示。使用人rna酶h测定rna酶h募集活性和切割模式，并与母体化合物4358(手性混合物)进行比较。得到的结果如下：当前第1页12