CvBV29‑1基因在降低果蝇免疫力和制备免疫低下型果蝇模型中的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学和基因工程技术领域，尤其涉及cvbv29-1基因在降低果蝇免疫力和制备免疫低下型果蝇模型中的应用。

背景技术：

昆虫是目前地球陆地上最繁盛的物种类群，是人类取之不尽的资源宝库。近年来，昆虫的免疫在其基础和应用研究方面受到极大关注，通过实验来研究与昆虫免疫相关的机制、信号等问题，对害虫防治、益虫防病、开发利用抗菌物、研究人类免疫机制等有着非常重要的现实意义。

果蝇属于双翅目、果蝇属、果蝇科昆虫，约1000种。其中，果蝇具有生活史短、易饲养、繁殖快、染色体少、突变型多、易于观察等特点，被广泛地用作遗传和演化的室内外研究材料，是一种重要的模式生物。在生命科学发展的历史长河中，果蝇扮演了十分重要的角色，是十分活跃的模型生物。随着转基因技术的发展，各种转基因果蝇模型的应用也越来越广泛。

目前，转基因果蝇模型主要用于遗传学的研究、发育的基因调控的研究、各类神经疾病的研究、帕金森氏病、老年痴呆症、药物成瘾和酒精中毒、衰老与长寿、学习记忆与某些认知行为等研究中。

低免疫力果蝇模型在对研究昆虫免疫相关机制、增强人类免疫类药剂的筛选等方面有重要意义。但是，毒性较强的基因通常容易造成转基因果蝇的死亡；因此，寻找合适的毒性基因是建立免疫低下型果蝇的重要环节。

而polydnaviruses(多分dna病毒，pdv)是一类寄生蜂专性共生的特殊病毒，主要包括两个属：分别是存在于膜翅目茧蜂科(braconidae)的茧蜂病毒(bracovirus,bv)与姬蜂科(ichneumonidae)昆虫体内的姬蜂病毒属(ichnovirus,iv)(turnbull,m.andb.webb(2002).perspectivesonpolydnavirusoriginsandevolution.advancesinvirusresearch,academicpress.58:203-254)。pdv粒子随雌蜂产卵时注入到寄生蜂的寄主体体腔内，首先侵染血细胞，随后侵染所有组织。pdv作为寄生蜂的“强力武器”(bai,s.,x.chen,j.cheng,w.fuandj.he(2005)."effectsofwasp-associatedfactorsofcotesiaplutellaeongrowthanddevelopmentofplutellaxylostellalarvae."actaphytophylacicasinica32(3):235-240)，其主要生理功能是抑制寄主的免疫(dupuy,c.,e.huguetandj.m.drezen(2006)."unfoldingtheevolutionarystoryofpolydnaviruses."virusresearch117(1):81-89,strand,m.r.andg.r.burke(2012)."polydnavirusesassymbiontsandgenedeliverysystems."plospathogens8(7)，却不造成寄主的死亡，以保证寄生蜂的正常生长发育(ye,shietal.2014)。菜蛾盘绒茧蜂多分dna病毒(cvbv)是国内研究较多的一种多分dna病毒，共有35个环状dna组成，编码一百多个毒性基因。因此，有必要对cvbv基因做更进一步地深入研究。

技术实现要素：

本发明发现了cvbv29-1基因在降低果蝇免疫力和制备免疫低下型果蝇中的新用途。

cvbv29-1基因是菜蛾盘绒茧蜂多分dna病毒的35个基因组片段中的第29个环上的第1个基因，碱基序列如seqidno.1所示；其能够编码169个氨基酸，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明提供了cvbv29-1基因在降低果蝇免疫力中的应用，所述cvbv29-1基因的碱基序列如seqidno.1所示。

经实验发现，cvbv29-1基因在促进果蝇血细胞凋亡中的用途，所述cvbv29-1基因的碱基序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了cvbv29-1基因在制备免疫低下型果蝇模型中的应用，所述cvbv29-1基因的碱基序列如seqidno.1所示。

本发明提供了一种免疫低下型果蝇模型的制备方法，包括：

(1)制备包含有cvbv29-1基因的重组质粒，将重组质粒注入白眼野生型果蝇胚胎中，胚胎发育至成虫后，获得红眼转基因果蝇；所述cvbv29-1基因的碱基序列如seqidno.1所示；

(2)将红眼转基因果蝇与平衡系进行两轮杂交，依据后代表型，挑选纯合体转基因果蝇；

(3)利用uas/gal4系统，将步骤(2)制得的纯合体转基因果蝇与bs8700果蝇品系进行杂交，使得cvbv29-1基因在后代果蝇血细胞中特异性表达，从而获得免疫低下型果蝇。

其中，所述白眼野生型果蝇为w1118；平衡系的基因型为w-/w-；sp/cyo；tm2/tm6b。

所述纯合体转基因果蝇的基因型为w-/w-；cvbv29-1/cvbv29-1；tm2/tm6b。

本发明还提供了一种免疫低下型果蝇模型，其染色体中包含有cvbv29-1基因，所述cvbv29-1基因的碱基序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种采用上述制备方法制备的免疫低下型果蝇模型。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用转基因技术，将菜蛾盘绒茧蜂多分dna病毒基因cvbv29-1转入果蝇基因组，获得了稳定遗传、纯合体的转基因果蝇品系；利用uas/gal4系统，纯合体的cvbv29-1转基因果蝇与bs8700果蝇品系进行杂交，得到的品系表达多分dna病毒基因cvbv29-1后，存在血细胞凋亡的现象，并且在受到病原物侵染时，具有明显的免疫缺陷性状，在对研究昆虫免疫相关机制、增强人类免疫类药剂的筛选等方面有重要意义。

(2)本发明构建的cvbv29-1转基因果蝇借助gal4/uas系统的调控以及杂交试验，实现了cvbv29-1基因在果蝇特定组织的高表达。

附图说明

图1为实施例1中构建cvbv29-1转基因果蝇的pcr检测结果。

图2为实施例1中半定量pcr检测cvbv29-1在转基因果蝇中的表达结果。

图3为实施例1中cvbv29-1基因在果蝇血细胞中特异表达对血细胞影响的检测结果。

图4为实施例1中cvbv29-1基因引起果蝇幼虫血细胞凋亡的检测结果。

图5为实施例1中cvbv29-1基因影响果蝇免疫的检测结果。

具体实施方式

实施例1

1、转基因果蝇的构建

根据cvbv29-1基因开放阅读框(orf,seqidno.1所示)两端序列以及puasttb载体上多克隆位点序列，结合同源重组酶的作用方式，设计特异性引物，引物序列如下：

f：5’-ttcgttaacagatctgcggccgcatggtgttcaaaaaatctgc-3’

r：5’-tcctctagaggtaccctcgagttaaagcgaaattgcttcttc-3’；

采用trizol(invitrogen,carlsbad,ca,usa)提取寄生后小菜蛾血细胞的总rna，并利用试剂盒smartracecdnaamplificationkit(clontech,usa)构建cdna文库。然后，利用特异性引物f、r从构建的cdna文库中pcr扩增出带有酶切位点的cvbv29-1基因片段，利用同源重组酶(clonexpressiionestepcloningkit，诺唯赞，南京)将片段重组克隆到载体上。重组后的载体转到大肠杆菌进行扩繁，并对重组质粒进行测序验证序列的正确性。

将验证正确的重组质粒显微注射入白眼野生型黑腹果蝇w1118的胚胎中，胚胎发育至成虫即为g0代，g0代果蝇中红眼果蝇即为成功的转基因品系，以此为依据进行筛选。

利用pcr检测，提取cvbv29-1转基因果蝇和野生型w1118黑腹果蝇的基因组dna，分别用特异性引物f、r对这些基因组dna进行pcr检测，从cvbv29-1转基因果蝇扩增出与cvbv29-1大小一致的片段，而在野生型w1118黑腹果蝇的基因组dna中没有扩增出任何片段。证明菜蛾盘绒茧蜂多分dna病毒cvbv29-1基因成功插入到转基因果蝇的基因组中，转基因果蝇品系构建成功(如图1)。

2、cvbv29-1转基因果蝇纯合体品系的构建

本实施例中cvbv29-1插入到三号染色体上，故将上述步骤1构建成功的转基因品系与平衡系(w-/w-；sp/cyo；tm2/tm6b)进行杂交，依据后代表现型，挑选出子代具有卷翅、大平衡棒的处女果蝇(w-/w-；+/cyo；tm2/cvbv29-1)以及具有体侧2根以上刚毛、肩部多毛的雄果蝇(w-/w-；sp/+；tm6b/cvbv29-1)，并将挑选出的果蝇进行杂交；或者挑选出子代具有卷翅、大平衡棒的雄果蝇(w-/w-；+/cyo；tm2/cvbv29-1)以及具有体侧2根以上刚毛、肩部多毛的处女果蝇(w-/w-；sp/+；tm6b/cvbv29-1)，并将挑选出的果蝇进行杂交；杂交后代挑选卷翅、体侧2根以上刚毛的纯合体的转cvbv29-1基因的果蝇(w-/w-；sp/cyo；cvbv29-1/cvbv29-1)进行保种。

3、cvbv29-1转基因果蝇在体内的表达

利用uas/gal4系统，将步骤2中纯合体的cvbv29-1转基因果蝇与bs8700(flybaseid:fbti0064641)果蝇品系进行杂交，使得cvbv29-1在果蝇血细胞中特异表达，并以cvbv29-1转基因品系与野生型w1118杂交作为对照。提取子代血细胞总rna反转录为cdna(具体方法同(1)中)，以管家基因actin做内参，用定量特异性引物进行半定量检测。

定量特异性引物如下：

cvbv29-1-qpcr-f：5’-cacatcactgcgcctcgtac-3’；

cvbv29-1-qpcr-f：5’-ccactgacatgtaaacgcctg-3’；

dro-actin-qpcr–f：5’-gctgagcgtgaaatcgtccg-3’；

dro-actin-qpcr-r：5’-ggagttgtaggtggtctcgtgga-3’。

图2结果表明，在mrna水平上，cvbv29-1转基因品系和w1118的杂交后代无cvbv29-1的表达，而cvbv29-1转基因品系和bs8700的杂交后代表达量很高。因此，说明得到了在血细胞中特异表达cvbv29-1的转基因果蝇。

4、cvbv29-1基因在果蝇血细胞中特异表达对果蝇的影响

a)cvbv29-1在果蝇血细胞中特异表达对血细胞影响的检测结果

利用cvbv29-1转基因品系与野生型w1118和bs8700的处女果蝇分别杂交，提取子代血细胞，对子代幼虫血细胞进行原代培养，并置于光学显微镜下进行形态学观察。

图3结果表明，对照组果蝇幼虫血细胞生长状态正常，而有cvbv29-1特异表达的果蝇幼虫血细胞，出现部分凋亡的现象，并伴随有凋亡小体的产生(如图中白色箭头所指)。

b)cvbv29-1引起果蝇幼虫血细胞凋亡的检测结果

利用cvbv29-1转基因品系与野生型w1118和bs8700的处女果蝇分别杂交，提取子代血细胞，对子代幼虫血细胞进行原代培养，并按照tunelbrightredapoptosisdetectionkit(诺唯赞生物科技有限公司)说明书所述方法进行检测。

图4结果表明，对照组血细胞无凋亡信号(白色斑点)；而cvbv29-1在果蝇幼虫血细胞中特异表达能引起果蝇幼虫血细胞的凋亡(如白色箭头所示)。

c)cvbv29-1影响果蝇免疫的检测结果

利用cvbv29-1转基因品系与野生型w1118和bs8700的处女果蝇分别杂交，向后代果蝇雄成虫(约60头)体内注射33nlpbs和金黄色葡萄球菌(od＝0.4)。注射后每隔12h，统计果蝇生存情况，绘制生存曲线。

图5结果表明，注射pbs不影响果蝇的生存率；而注射金黄色葡萄球菌后，cvbv29-1转基因品系与bs8700的杂交后代的存活率显著(p＝0.0068)低于对照组(cvbv29-1转基因品系与野生型w1118的杂交后代)，表明cvbv29-1能降低果蝇的免疫。

sequencelisting

<110>浙江大学

<120>cvbv29-1基因在降低果蝇免疫力和制备免疫缺陷型果蝇模型中的应用

<130>

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>510

<212>dna

<213>菜蛾盘绒茧蜂多分dna病毒

<400>1

atggtgttcaaaaaatctgcgttagtactactggcagctatcgtcgggctcacatgggtt60

caagcgtttccagagcacaggggtgaattttctaggccccgtgacttcagtgactccaga120

acccaaaatgacaacgacatcgaaagccacatcactgcgcctcgtacttcaacagtttat180

ggatccaataatgttgccactctcccacccatcaaatatggactctccgaagcgagacca240

actcactcacgtcggaaatttaaagttagacttaccgaagaaggttctttgaagctcatt300

cacgacatatatgaaactaatgaagaaattaagagtatgtggggatctcagtcaacgtta360

gaaagaagttaccttttgaatctgcgccaaactttatgcaacatggtaacaggcgtttac420

atgtcagtggacgaccgagtcattcaggatgtccaaaatgtcatttgctcggctttagtc480

ttggacagcgaagaagcaatttcgctttaa510

<210>2

<211>169

<212>prt

<213>菜蛾盘绒茧蜂多分dna病毒

<400>2

metvalphelyslysseralaleuvalleuleualaalailevalgly

151015

leuthrtrpvalglnalapheprogluhisargglyglupheserarg

202530

proargasppheseraspserargthrglnasnaspasnaspileglu

354045

serhisilethralaproargthrserthrvaltyrglyserasnasn

505560

valalathrleuproproilelystyrglyleuserglualaargpro

65707580

thrhisserargarglysphelysvalargleuthrglugluglyser

859095

leulysleuilehisaspiletyrgluthrasnglugluilelysser

100105110

mettrpglyserglnserthrleugluargsertyrleuleuasnleu

115120125

argglnthrleucysasnmetvalthrglyvaltyrmetservalasp

130135140

aspargvalileglnaspvalglnasnvalilecysseralaleuval

145150155160

leuaspsergluglualaileserleu

165

<210>3

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

ttcgttaacagatctgcggccgcatggtgttcaaaaaatctgc43

<210>4

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tcctctagaggtaccctcgagttaaagcgaaattgcttcttc42

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cacatcactgcgcctcgtac20

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ccactgacatgtaaacgcctg21

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gctgagcgtgaaatcgtccg20

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

ggagttgtaggtggtctcgtgga23