专利名称：：B型肝炎病毒dna捕捉用探针和探针固定化固相载体的制作方法
技术领域：
：本发明涉及B型肝炎病毒(本发明说明书中也称为"HBV")DNA捕捉用探针和固定有所述探针的固相载体。
背景技术：
：HBV的定量，作为用于观察HBV感染者的治疗效果，以及为了防止通过输血用血液或移植用器官介导的受者的HBV感染而检查供体有无感染HBV的手段，是十分重要的。作为定量血清等试样中的HBV的方法，可以举出如下方法，例如用磁性颗粒等载体捕捉试样中的HBV-DNA,通过TaqMan(商标)法等实时检测PCR法定量所捕捉的HBV-DNA的方法。此时优选的是，即使是病毒浓度极低的检测对象，也可以准确地捕捉HBV-DNA。
发明内容本发明提供一种即使是病毒浓度极低的检测对象，也可以准确地捕捉HBV-DNA的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针和探针固定化固相载体。本发明的一个方式中所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针为，含有与选自序列号1~12所示的任一个序列中的连续的10个以上碱基具有80%以上序列同源性的碱基序列，且为碱基数15~80的寡核苷酸。本发明的一个方式中所述的探针固定化固相载体固定有上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探针。通过使用上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探针，即使在病毒浓度极低的检测对象中也可以准确地捕捉HBV-DNA。更具体而言，通过使用固定有上述B型肝炎病毒DNA捕捉用探针的探针固定化固相载体来捕捉HBV-DNA，即使在病毒浓度极低的检测对象中也可以准确地捕捉HBV-DNA。l.B型肝炎病毒DNA捕捉用探针本发明的一个实施方式中所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针(以下也称为"HBV-DNA捕捉用探针，，)含有与选自序列号1~12所示的任一个序列中的连续的10个以上碱基具有80%以上(优选90%以上)的序列同源性的碱基序列，且碱基数为15~80(优选25-45)的寡核苷酸。HBV-DNA捕捉用探针可以使用市售品，也可以通过公知的合成方法合成。探针BA:5'—TCCTAGGACCCCTGCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCT-3'(序列号l)探针BB:5，-CCCC丁GCTCGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTTGTTGACAA一3'(序列号2)探针BC:5'—GTCTAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGG—3'(序列号3)探针BD:5'—TATCGCTGGATGTGTCTGCGGCGTTT'TATCATATTCCTCT一3'(序列号4)探针BE:5,—CATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGTTCTTCTGGA—3'(序列号5)探针BF:5'_CCTATGGGAGTGGGCCTCAGTCCG丁丁TCTCTTGGCTCAGTTTACTAG-3'(序列号6)探针BG:5'_GGCTTTCCCCCACTGTTTGGCTTTCAGCTATATGGATGAT—3'(序列号7)探针BH:5'—丁GCCAAGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCTT—3，(序列号8)探针BI:5'—CTCCTCTGCCGATCCATACTGCGGAACTCCTAGCCGCTTG—3'(序列号9)探针BJ:5'—CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTGCACGTTGCATGGAGA—3'(序列号IO)探针BK:5'-TGTTCAAGCCTCCAAGCTGTGCCTTGGGTGGCTTTGGGGC—3'(序列号ll)探针BL5'-GCAGG丁CCCCTAGAAGAAGAACTCCCTCGCCTCGCAGACGAAG—3'(序列号12)通过将HBV-DNA捕捉用探针固定化在例如探针固定化固相载体(例如磁性颗粒)的表面，在包含检测对象的试样中使该捕捉用探针与HBV-DNA杂交，在极低浓度下也可以捕捉检测对象中的HBV-DNA。作为检出对象的HBV-DNA包含于怀疑含有HBV的某种检测对象中，例如血清，血浆等体液中。而且，使用HBV-DNA捕捉用探针捕捉到的HBV-DNA可以通过例如实时检测PCR法进行定量。例如，在含有捕捉到HBV-DNA的磁性颗粒和正向侧引物和反向侧引物和荧光探针(3，末端被供体荧光色素标识化且5，末端被受体荧光色素标识化的寡核苷酸(TaqMan(商标)探针))的系统中进行PCR反应，可以基于获得的荧光强度测定检测对象中的B型肝炎病毒DNA量。该实时检测PCR法本身是公知的，这种用途的装置和试剂盒也是市售的，因此使用这种市售的装置和试剂盒可以进行实时检测PCR法。2.探针固定化固相载体本发明的一个实施方式中所述的探针固定化固相载体固定有上述HBV-DNA捕捉用探针。作为固相载体，可以举出，例如可以作为色镨载体、诊断试剂而使用的载体颗粒，例如可以作为DNA芯片、DNA微阵列而使用的芯片(基板)等。本实施方式中所述的探针固定化固相载体，更优选为用于检测HBV的固相载体(更具体的是在表面固定有HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒)。作为在磁性颗粒上将HBV-DNA捕捉用探针固定化的方法，可以举出，例如使3，末端被氨基修饰的HBV-DNA捕捉用探针与含有羧基的磁性颗粒反应的方法，使3，末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探针与抗生物素蛋白化磁性颗粒反应的方法。3.实施例以下，基于实施例对本发明进行更具体的说明。不过，本发明并不限于下述实施例。3.1具有HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒的制作3.1.1.HBV画DNA捕捉用探针作为HBV-DNA捕捉用探针，使用上述序列号1~12所示的序列BA~BL。3.1.2.HBV-DNA捕捉用探针向磁性颗粒的固定化性颗粒反应的方法、和使3，末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探针与抗生物素蛋白化磁性颗粒反应的方法这两种方法，制作固定有HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒。(a)通过使3，末端被氨基修饰的HBV-DNA捕捉用探针与含有羧基的磁性颗粒反应，HBV-DNA捕捉用探针向磁性颗粒固定化将含有羧基的磁性颗粒(Magnosphere(商标)M300/Carboxyl(JSR林式会社制))lwt。/。分散液500jul取至管中，通过磁力架进行磁力分离，除去上清。用0.0001N盐酸清洗3次后，分散于500jil的0.0001N盐酸中，加入5n1的3'末端被氨基化的HBV-DNA捕捉用探针(探针BA)IOOjnM溶液、和0.25mgEDC(l-乙基-3-(3-二曱基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐)，在设定于10X:的恒温槽中搅拌15小时。然后，通过磁力架进行磁力分离，除去上清。用含有0.5mMEDTA和l細NaCl的5mMtris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于50n1的5mMtris-HCl緩沖液中，获得了通过酰胺键结合有HBV-DNA捕捉用探针(探针BA)的探针固定化磁性颗粒(am-BA)的分散液(10%重量)。而且，用同样的方法获得了通过酰胺键结合有HBV-DNA捕捉用探针(探针BB,BC，BD,BE，BF，BG，BH，BI，BJ，BK，BL)的探针固定化磁性颗粒(am-BB,am-BC,am-BD，am-BE，am-BF，am-BG,am國BH,am-BI,am—BJ,am國BK，am画BL)o(b)通过使3，末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探针与抗生物素蛋白化磁性颗粒反应，HBV-DNA捕捉用探针向磁性颗粒的固定化将生物素化磁性颗粒(Magnosphere(商标)M300/Streptavidin(JSR林式会社制))lwtYo分散液500ji1取至管中，通过磁力架进行磁力分离，除去上清。用含有0.5mMEDTA和l.OMNaCl的5mMTris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于500ji1的含有0.5mMEDTA和l.OMNaCl的5mMTris-HCl(pH7.4)中，加入5nl的3，末端被生物素化的HBV-DNA捕捉用探针(探针BA)100juM溶液，室温下搅拌30分钟。然后，通过磁力架进行磁力分离，除去上清。用含有0.5mMEDTA和l.OMNaCl的5mMtris-HCl(pH7.4)清洗3次后，分散于50p1的5mMtris-HCl緩冲液中，获得了通过生物素-抗生物素蛋白结合而结合了HBV-DNA捕捉用探针(探针BA)的磁性颗粒(bi-BA)分散液(lO%重量)。而且，用同样的方法获得了通过生物素-抗生物素蛋白结合而分别结合了探针BB、BC、BD、BE、BF、BG、BH、BI、BJ、BK、BL的探针固定化磁性颗粒(bi-BB、bi-BC、bi-BD、bi誦BE、bi画BF、bi誦BG、bi-BH、bi-BI、bi-BJ、bi-BK、bi-BL)。3.2.通过HBV-DNA捕捉用探针固定化磁性颗粒进行的HBV-DNA的提取和检测3.2.1.HBV國DNA的提取用上述工序制备的HBV-DNA捕捉用探针固定化磁性颗粒，从人血浆中提取HBV-DNA。用正常的人血浆稀释含有浓度已知的HBV的人血浆的检测对象，制备出IO倍阶的稀释系列。从各0.1ml的这些稀释的血浆中提取HBV-DNA。首先，将O.lml血浆取至管中，加入380nl检测对象稀释液(1%N-月桂酰肌氨酸钠，10mMEDTA，200mMNaCl，2%2-琉基乙醇，200mMTris-HCl(pH7.5))和5n1的10%葡聚糖T2000(Amersham公司制)进行搅拌后，于55"C静置30分钟。接着，加入250jul的8M胍基盐酸盐进行搅拌后，于55匸静置15分钟。然后,于95匸静置10分钟后冷却到室温。然后，加入10jul具有上述工序中制备的HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒分散液(IO重量％)，于室温下搅拌10分钟后，通过磁力架进行磁力分离除去液体。然后，用0.01%tritonX-100和含有0.1MNaCl的10mMtris-HCl(pH7.5)溶液清洗颗粒1次后，分散于40jul的无脱氧核糖核酸酶的水中，获得了含有HBV-DNA的磁性颗粒分散液。以该磁性颗粒分散液作为模板，直接进行实时检测PCR扩增反应处理。3.2.2.通过实时检测PCR进行的扩增和检测每一个反应管中制备下表l所示的反应液，加入40pl含有上述提取的HBV-DNA的磁性颗粒分散液，进行实时检测PCR。反应液的纟且成PCR等级的蒸馏水32.2nl10x緩沖液10plMgCl2(25mM)10ju1dATP(10mM)1ji1dGTP(10mM)1|J1dCTP(10mM)1ji1dTTP(10mM)1ji1正向侧引物(100iaM)lpl反向侧引物(100jiM)lHlTaqMan(商标)探针(25pM)0.4n1FastStartTaqDNA聚合酶(5U/p1)0.4ji1ROXReferenceDye(Invitrogen公司制)1|i1总计60|il正向侧引物、反向侧引物和TaqMan(商标)探针使用具有特表2005-505289记载的下述序列。正向側引物的序列5'—ATCTTATCAACACTTCCGGA—3'(序列号13)反向側引物的序列5'—AGATTGAGATCTTCTGCGAC—3'(序列号14)TaqMan(商标)探4十的序列5，一[FAM]AGGTCCCCTAGAAGAAGAACTCCCT[TAMRA]—3'(序列号15)FastStartTaqDNA聚合酶和10x緩沖液4吏用FastStartTaqDNA聚合酶(Rochediagnostic公司制)所附的试剂。将反应管置于实时检测PCR装置Prism7700(商品名，AppliedBiosystems公司)，在以下条件下进行定量PCR反应。初期活性化步骤95匸15分钟PCR变性95t:15秒PCR延伸60"C60秒重复进行50个这样的PCR循环。到达50个循环时，将荧光强度以指数函数性增加的判断为阳性，不增加的判断为阴性。使用各磁性颗粒获得的实验结果示于下表l。根据表1可知，具有上述HBV-DNA捕捉用探针的磁性颗粒可以从含有至少10个/0.1ml血浆的病毒的试样中捕捉B型肝炎病毒。表l使用HBV-DM固定化磁性颗粒的HBV-DM的分离和检测结果(阳性检测对象数/试验检测对象数)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>序列表<110>JSR株式会社<120>B型肝炎病毒DNA捕捉用探针和探针同定化固相载体<130>IP0817294<160>15<210>1<211>39<212>DNA<213>人工序列<■>1tcctaggacccctgctcgtgttacaggcggggtttttct39<210>2<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>2cccctgctcgtgttacaggcggggtttttcttgttgacaa40<210>3<211>39<212>DNA<213>人工序列<400>3gtctagactcgtggtggacttctctcaattttctagggg39<210>4<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>4tatcgctggatgtgtctgcggcgttttatcatattcctct40<210>5<211>42<212>DNA<213>人工序列<400>5catcctgctgctatgcctcatcttcttgttggttcttctgga42<210>6<211>47<212>DNA<213>人工序列<400>6cctatgggagtgggcctcagtccgtttctcttggctcagtttactag47<210>7<211>40<212>DNA<213>人工序列<400>7ggctttcccccactgtttggctttcagctatatggatgat40<210>8<211>41<212>DNA<213>人工序列<400>8tgccaagtgtttgctgacgcaacccccactggctggggctt41<210>9<formula>formulaseeoriginaldocumentpage13</formula><210>14<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>14agattgagatcttctgcgac20<210>15<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>15aggtcccctagaagaagaactccct2权利要求1.一种B型肝炎病毒DNA捕捉用探针，其特征在于，含有与选自序列号1～12所示的任一个序列中的连续的10个以上碱基具有80％以上序列同源性的碱基序列，且为碱基数15～80的寡核苷酸。2.—种探针固定化固相载体，其特征在于，固定有权利要求l所述的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针。全文摘要提供了一种即使是病毒浓度极少的检测对象也可以准确地捕捉HBV-DNA的B型肝炎病毒DNA捕捉用探针和探针固定化固相载体。B型肝炎病毒DNA捕捉用探针含有与选自序列号1～12所示的任一个序列中的连续的10个以上碱基具有80％以上序列同源性的碱基序列，且为碱基数15～80的寡核苷酸。文档编号C12N15/09GK101519699SQ200910005388公开日2009年9月2日申请日期2009年2月24日优先权日2008年2月26日发明者上野胜,村田充弘,片寄聪,福田哲夫,范可君申请人:Jsr株式会社