册恒定区。通过用丝氨酸残基替换一个或多个半脫氨酸残基，可W修饰较链区，W防 止二聚化。在US2003/0118592和US2003/0133939中进一步公开了该样的结合-结构域 免疫球蛋白融合蛋白。使用本领域技术人员已知的常规技术，得到该些抗体片段，并W与完 整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。
[00巧]典型的抗原结合位点包含通过轻链免疫球蛋白和重链免疫球蛋白的配对形成的 可变区。抗体可变区的结构是非常一致的，且表现出非常类似的结构。该些可变区通常包 含相对同源的框架区（FR)，它们中间夹杂3个称作互补性决定区（CDR)的高变区。抗原结 合片段的总结合活性经常由CDR的序列决定。FR经常在CDR的适当H维定位和排列中起作 用，W实现最佳的抗原结合。
[0026] 本发明的抗体和/或抗原结合片段可能源自，例如，小鼠、大鼠或任意其它哺乳动 物，或其它来源，诸如通过重组DNA技术。
[0027] 从在下文中提供的非限制性详述，可W明白本发明的其它范围、适用性和优点。但 是，应当理解，尽管指示本发明的示例性实施方案，该详述仅作为实施例给出，并参考附图。 【【附图说明】】
[0028] 图lA显示了使用半定量RT-PCR反应进行的表达概况分析，用于测量源自超过20 个卵巢肿瘤、良性（低恶性潜力）肿瘤、卵巢癌细胞系和30个正常组织的RNA样品中的 KAAGlmRNA表达水平。对照图显示GAPDH表达，GAPDH即用于对比每个RT-PCR反应中的原 料量的管家基因。
[0029] 图1B显示的半定量RT-PCR实验证实了KAAGlmRNA在卵巢癌细胞系中表达，尤其 是源自腹水的那些。
[0030] 图1C显示的简图解释了卵巢癌细胞系形成称作球状体的3D结构的能力。左图显 示了在无血清培养基中培养的细胞，而5%血清刺激球状体结构的形成。
[0031] 图1D显示的半定量RT-PCR实验证实了在卵巢癌细胞系的球状体形成过程中高 度诱导KAAGlmRNA。
[0032] 图2A显示的简图解释了创伤或抓伤试验，即基于细胞的试验，它是细胞系经预定 时间段迁移进裸露区中的能力的测量。携带KAAGlshRNA的T0V-21G细胞表现出填充裸露 区的能力下降。
[0033] 图2B显示了产克隆试验（也称作集落存活试验）的图解。它测量稀释的细胞经 几天时段的存活。携带KAAGlshRNA的T0V-21G细胞表现出存活减少。
[0034] 图3A显示了用考马斯蓝染色的聚丙帰醜胺凝胶，且含有在瞬时转染的293E细胞 中产生的、纯化的化-KAAG1融合蛋白的样品（10yg)。
[00巧]图3B显示了含有单个单克隆抗体的96-孔平板之一的化ISA结果，所述单克隆抗 体选自含有抗-KAAG1F油的Omniclonal文库#3。结果表明，48个（用灰色突出显示）F油 非常有效地与KAAG1相互作用。用粗体数字指示的孔含有示例性的单克隆3D3、3G10和3C4。
[0036] 图4A显示了用考马斯蓝染色的聚丙帰醜胺凝胶，且含有下述样品（10yg):纯化 的化-KAAG1融合蛋白（泳道1)，跨氨基酸1-60的KAAG1的截短突变体（泳道2)，和跨氨 基酸1-35的KAAG1的另一个截短突变体（泳道3)，它们在瞬时转染的293E细胞中产生。 所有蛋白都是化融合蛋白。
[0037] 图4B的线路图解释了KAAG1的截短突变体，产生它用于表位作图研究。
[003引 图4C显示的图描述了来自ELISA分析的结果，其对应被Omniclonal文库#3中包 含的抗-KAAG1抗体结合的表位。结果表明，大多数单克隆与KAAG1的中央区相互作用，且 某些抗体结合KAAG1的氨基端或駿基端。
[0039] 图5显示的线路图解释了将小鼠F油转化成IgGl小鼠-人嵌合的mAb所涉及的 步骤。
[0040] 图6显示的图对比了小鼠抗-KAAG1F油和对应的IgGl嵌合的单克隆抗体对示例 性的抗体3D3、3G10和3C4的结合。结果表明，当转移至完整人IgGl支架时，维持了F油 可变区的相对结合。
[0041] 图7显示了在有嵌合的IgGl抗-KAAG1单克隆抗体存在下使用T0V-21G和0V-90 卵巢癌细胞系的球状体形成实验的描述。松散填充的结构更少侵入性的癌细胞系的指征。 结果显示了用示例性的抗-KAAG1抗体3D3、3G10或3C4处理的球状体。
[0042] 图8A显示了含有从卵巢瘤患者得到的大约70个活组织检查样品的组织微阵列的 扫描。用3D3抗-KAAG1抗体印迹样品，并证实，绝大多数卵巢肿瘤表达非常高水平的KAAG1 抗原。
[0043] 图8B是来自组织微阵列实验的更高放大率图片。箭头显示KAAGl在血清卵巢肿 瘤细胞的上皮层的顶端表面处的膜定位。
[0044] 图8C解释了其它免疫组织化学研究，它们证实，KAAG1在所有卵巢癌类型中高度 表达。显示的组织型是血清的、粘蛋白的和子宫内膜样的。
[0045] 图9A、9B和9C总结了使用ClustalW2程序得到的选择的CD化1、CD化2或CD化3 序列的比对结果；其中表示该列中的残基在所有比对的序列中是相同的，"："表示已经 观察到保守置换，且表示观察到半-保守置换。使用ClustalW程序（LarkinM.A.,等 人，（2007)ClustalW和ClustalX版本2.Bioinformatics200723 (21):2947-2948)，产生共 有的CDR。
[0046] 图10A、10B和10C总结了使用ClustalW2程序得到的选择的CDRHUCDR肥或CDR册 序列的比对结果；其中表示该列中的残基在所有比对的序列中是相同的，"："表示已经 观察到保守置换，且表示观察到半-保守置换。使用ClustalW程序（LarkinM.A.,等 人，（2007)ClustalW和ClustalX版本 2.Bioinformatics200723 (21) : 2947-2948)，产生共 有的CDR。
[0047] 图11表示每个产生的轻链可变区和在SEQIDN0:16、20、24或105中鉴别出的代 表性的轻链可变区之间的序列对比。使用本文指出的Blast2测序程序，已经测定了序列同 一性百分比和序列相似性百分比。
[0048] 图12表示每个产生的重链可变区和在SEQIDN0:18、22、26或132中鉴别出的代 表性的重链可变区之间的序列对比。使用本文指出的Blast2测序程序，已经测定了序列同 一性百分比和序列相似性百分比。
[004引图13,祀向KAAG1的IgGi抗体在体外可W有效地介导ADCC活性。用3D3温育PB MNC(A1ICel1S,UX,Emoirvi1le,CA) 30min，并W1:25的比例，与0VCAR-3或WIL2-S细胞相 混合。在37C温育细胞化，并通过测量培养基中的LDH水平测定细胞裂解。如下计算细胞 的细胞毒性：％细胞毒性=(实验值-自发的效应值-自发的祀物值）x!00/(最大祀 物值-自发的祀物值）。
[0050] 图14,抗-KAAGlmAb阻止T0V-112D卵巢肿瘤的体内扩散。W200iiL的体积，将lx 1〇6个细胞植入SCID小鼠的腹腔。2天后，W25mg/kgqwk的剂量，用PBS或在PBS中稀释 的抗体处理。通过腹部触诊检测到肿瘤后，尽可能快地处死小鼠。用肉眼对肿瘤数目评分 炬)，且将在图A中的数据表示为肿瘤平均数/小鼠+SE。
[0051] 图15显示了使用抗-KAAG1抗体在从鱗状细胞癌和黑素瘤分离出的几个切片的人 皮肤肿瘤组织微阵列（PantomicsInc.，Richmond,CA)上进行的免疫组织化学。
[0052] 图16解释了在有或没有嵌合的3D3抗体存在下的黑素瘤细胞系（A375和 SK-MEL5)和肾细胞癌细胞系（A498和786-0)的球状体形成。
[0053] 图17A显示的图解释了递增浓度的3C4、3D3和3G10抗体向在不渗透细胞的条件 下固定的细胞系（0V-90、T0V-21G和SK0V-3)的结合。
[0054] 图17B的图解释了使用3D3抗体在SK0V-3细胞系上进行的流式细胞术的结果。 [00巧]图18A的图解释了 3D3抗体模型的结构。
[0056] 图18B的图解释了 3C4抗体模型的结构。
[0057] 图19A的图解释了与嵌合的3D3抗体向重组KAAG1的结合相比，递增浓度的人源 化的3D3抗体的结合。
[0058] 图19B的表总结了人源化的3D3抗体、嵌合的3D3抗体W及杂交抗体（包括嵌合 或人源化抗体的轻链和重链的置换）的动力学参数。
[0059] 图19C解释了在人源化的3D3抗体、嵌合的3D3抗体存在下，或在缓冲液或对照 IgG存在下，SK0V-3卵巢癌细胞的球状体形成。
[0060] 图20A表示单克隆3D3轻链可变区（SEQIDNO. : 16)和人源化的3D3轻链可变区 (SEQIDNO. : 178)的序列比对。人源化的3D3轻链可变区与单克隆3D3轻链可变区具有 86%同一性（94%序列相似性），且它们的3个CDR是100% (用粗体表示）。
[0061] 图20B表示单克隆3D3重链可变区（SEQIDNO. : 18)和人源化的3D3重链可变区 (SEQIDNO. : 179)的序列比对。人源化的3D3重链可变区与单克隆3D3重链可变区具有 82%同一性（91 %序列相似性），且它们的3个CDR是100% (用粗体表示）。
[0062] 图21A表示单克隆3C4轻链可变区（SEQIDNO. :24)和人源化的3C4轻链可变区 (SEQIDNO. : 182)的序列比对。人源化的3C4轻链可变区与单克隆3C4轻链可变区具有 85%同一性（93%序列相似性），且它们的3个CDR是100% (用粗体表示）。
[0063] 图21B表示单克隆3C4重链可变区（SEQIDNO. :26)和人源化的3C4重链可变区 (SEQIDNO. : 183)的序列比对。人源化的3C4重链可变区与单克隆3C4重链可变区具有 86%同一性（93%序列相似性），且它们的3个CDR是100% (用粗体表示）。 【【具体实施方式】】
[0064]【KAAG1在癌细胞中的表达和生物活性】
[0065] 本发明涉及祀向在不同的癌症类型、尤其是卵巢癌中发现的肿瘤的抗体的应用。 为了把抗体引向肿瘤，必须鉴别在癌细胞的细胞表面处表达的肿瘤特异性抗原。有几种 技术可用于鉴别肿瘤特异性抗原，且在公布的专利申请号PCT/CA2007/001134中，描述了 用于鉴别卵巢肿瘤中的KAAG1的方法，即称作基于减法转录的mRNA扩增（Subtractive Transcription-basedAmplificationofmRNA) (STAR)的创新发现平台。
[0066] 卵巢癌STAR文库的分析，产生了许多编码分泌型和细胞表面蛋白的基因。它们 中的一个称作AB-0447,含有编码84个氨基酸的多肤的开放读码框，所述多肤与SEQID NO. : 2相对应，由具有SEQIDNO. : 1所示的核巧酸序列的885个碱基对的cDNA编码。对可 公开得到的数据库的检索掲示，AB-0447核巧酸序列与称作KAAG1的基因的核巧酸序列相 同。生物信息学分析预测为膜-销定的蛋白，它的功能结构域呈现给胞外隔室。KAAG1最初 克隆自肾癌文库，作为细胞表面抗原，即证实它的膜定位的结果。另外，我们的研究证实，该 蛋白在它的氨基端被加工，该结果与在氨基酸30和34处或二者之间的功能信号肤的切割 相一致。此外，全长cDNA的瞬时表达导致培养基中切割的KAAG1的检测。该最后一个发现 指示，当在高水平表达时，该膜-销定的蛋白可W从细胞脱落。相反，KAAG1的氨基-截短 突变体的表达导致蛋白的细胞内保留。目前没有关于它的功能的公开报道，且W前没有记 载本发明公开的KAAG1在卵巢癌中过表达。
[0067] 因此，我们已经研究了KAAG1是否可W用于基于抗体的诊断和治疗。
[006引 已经建立了几个基于卵巢癌细胞的模型，诸如T0V-21G、T0V-112D、0V-90和其它 模型，它们是本领域技术人员所熟知的。该些细胞是源自具有卵巢肿瘤或腹水液的患者的 人卵巢癌细胞系集合的一部分。该些细胞系已经经历彻底分析，包括在微阵列上的全基因 表达模式，使得它们成为优良的基于细胞的人卵巢癌模型。生长性质、基因表达模式和对化 疗药的应答表明，该些细胞系是体内卵巢瘤行为的恰当代表（Benoit等人，2007)。从该 些卵巢癌细胞系分离的总RNA的RT-PCR分析表明，KAAG1转录物在源自原发肿瘤的细胞系 中弱表达。相反，源自腹水液的细胞系含有高水平的KAAG1表达。在来自腹水液的细胞中 增加的KAAG1表达暗示，细胞的环境会影响KAAG1基因的调节。腹水细胞与晚期疾病有关， 且该表达模式暗示，KAAG1水平的增加与不依赖于销着生长有关。根据该后一种暗示，发现 KAAG1表达在源自原发肿瘤的细胞系中显著增加（当在3D培养中将该些细胞培养成球状 体时）。该些球状体已经被充分表征，且被发现在体内表现出