一种特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种特异性识别氧氟沙星的SSDNA适配体及其应用，属于生物化学与分子生物学、分析化学和组合化学领域。
【背景技术】
[0002]氟喹诺酮类药物如氧氟沙星、沙拉沙星、培氟沙星等，对大肠杆菌、沙门杆菌、葡萄球菌、克霉白杆菌、志贺杆菌、变形杆菌、流感嗜血杆菌、淋球菌、链球菌等抗菌活性较强，对化脓杆菌、肺炎链球菌、肺炎衣原体、肺炎支原体也有良好的抗菌作用。氧氟沙星药物的作用机理同其他喹诺酮类抗生素一样，通过抑制细菌的DNA旋转酶(gyrase)的合成，阻断DNA的正常的合成与复制，导致细菌死亡。因此，喹诺酮药物是目前人兽共用的抗感染的主要药物之一。但是当动物体内喹诺酮类抗生素长期积累达到某个程度时，生物体内对此类抗生素的耐药性增强，耐药细菌的数量逐渐增加，最后导致此类药物的药效降低；除此之外，还会损伤幼龄动物的软骨生长。大剂量的此类抗生素进入人体，会导致胃肠道不适，中枢神经和肝细胞受损等不良反应。氧氟沙星属于氟喹诺酮类药物，因其8-位被氟元素取代增强了光毒性，长期食用兽药超标的动物源食品不仅对人体健康造成直接或间接的伤害，还会造成人体对此类药物产生抗药性，不利于细菌性疾病的预防和治疗。因此，很多国家和地区均规定了此类抗生素在动物源食品中的最大残留限量。
[0003]美国食品药品监督管理局(FDA)就明令禁止喹诺酮类药物用于食源性动物的细菌感染治疗上，我国严格规定了动物源食品中喹诺酮类药物的残留量，最高残留限量为0.01-1.9mg.kg-1,日本规定进口的饅鱼及饅鱼产品的残留检测限量应在0.05mg.kg4以内。由于养殖过程中经常存在着违法使用或者不合理使用的现象，食品中喹诺酮类抗生素的过量残留，已经成为国内外普遍关注的食品安全问题之一。因此，加大对药物残留的监控力度，加强药残检测新技术的开发是十分有必要的。基于适配体的生物传感检测方法具有灵敏度高、特异性强等特点，因此筛选氧氟沙星的特异性适配体对于建立高效快速、特异灵敏的氧氟沙星检测方法具有十分重要的意义。
[0004]指数富集的配体系统进化技术(systematic evolut1n of ligands byexponential enrichment，简称为SELEX)是由Tuerk和Gold于1990年开发的一种体外筛选技术，认为该技术经过发展可以得到蛋白质的高亲和配基。该技术是新建立的一种体外合成的组合化学技术，基于单链寡核苷酸碱基之间可以形成多种空间结构，这些结构容易与靶分子结合的原理，从含有1013~1015个不同基元的初始文库中，经过几轮或数十轮的重复筛选富集过程，获得高亲和性、高特异性的核酸适配体。核酸适配体的筛选技术可以应用于各种类型靶分子的筛选上，不仅可以筛选无机或有机小分子、蛋白质、糖、抗生素等单个靶分子，还可以筛选复杂的靶结构或组成不明确的复合靶如靶分子混合物、生物体、完整细胞等。利用SELEX技术筛选获得的适配体有着比抗体分子更高的特异性和亲和力，甚至能识别单抗不能区分的抗原物质。同时，与蛋白质性质的抗体相比，核酸适配体具有明显的优越性，例如:靶分子范围广，不受免疫条件和免疫原性的限制，可在体外人工合成并且合成技术已非常成熟，变性与复性可逆，可应用于非生理条件下，可根据需求进行多种化学修饰，易于长期室温保存等。这些特性使得适配体在生物医药研宄领域得到广泛应用。近年来已有学者将适配体应用于抗生素的检测领域，同生物传感器平台结合，发展出快速、新颖的检测方法而备受关注。
[0005]本发明通过氧化石墨稀-SELEX (GO-SELEX)技术，利用氧化石墨稀可以富集ssDNA分子，而不富集与氧氟沙星结合的ssDNA，以氧化石墨烯作为筛选中结合与分离的介质，通过多轮筛选得到可以与氧氟沙星高特异性结合的ssDNA适配体序列，为氧氟沙星尤其是食品中氧氟沙星残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性检测识别元件。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是通过改良的GO-SELEX技术，借助于氧化石墨烯可以结合ssDNA分子，而不能结合与氧氟沙星结合的ssDNA分子的特点，以其作为结合与分离的介质，筛选得到能特异性结合氧氟沙星的ssDNA适配体。该适配体是氧氟沙星的新型识别元件，具有稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰和标记的高特异性的优势。
[0007]本发明的技术方案:
特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体，选自序列表A1~A12所示序列的一种或多种，包括含有Al?A12所述序列的ssDNA。
[0008]其中，序列表A1~A12在结构上均符合下述通式I所示的结构特征，
5' -TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3'(通式 I);其中N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。
[0009]在序列表中，优选序列Al、A3、A4或A5所示的序列。
[0010]特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体被能提高稳定性的基团，提供检测信号的荧光基团、同位素、电化学标记物、酶标记物，以及用于形成组合物的亲和配基、巯基所修饰。
[0011]特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体的应用:使可能含有氧氟沙星的样品与特异性识别氧氟沙星的ssDNA适配体接触，检测氧氟沙星与所述适配体的结合。具体用于检测氧氟沙星的组合物、试剂盒或芯片上。
[0012]筛选特异性结合氧氟沙星的ssDNA适配体的方法，包括步骤(a) - (I):
(a)筛选文库:ssDNA文库；
5' -TAGGGAATTC GTCGACGGAT CC-N35-CTGCAGGTCG ACGCATGCGC CG-3'其中 N代表碱基A，T，C，G中任一个，N35代表随机片段长度为35个碱基。
[0013](b)氧化石墨稀:功能化的石墨稀，配制成浓度为2mg.ml/1;
(c)氧氟沙星溶液:配置成浓度为1mmol.L—1;
Cd)链霉亲和素磁珠:粒径l_2Mm，浓度为1mg.mL—1;
(e)使步骤(a)中的筛选文库和步骤(c)中的氧氟沙星在适宜的条件下保温；所述适宜条件是指使筛选文库中的成员能和氧氟沙星特异性结合的条件，包括室温25°C，作用时间 Ih,结合缓冲液成分为 10mmol.L 1 NaCl，2mmo1.L 1 MgCl2, 5mmol.L 1 KCl，lmmol.L 1CaCl2,0.02% Tween 20 和 20mmol.L-1 Tris-HCl, ρΗ7.6 ；
(f )使步骤(e)与步骤(b)中的氧化石墨烯在适宜的条件下结合；适宜的条件包括室温25 °C，结合时间2h ；
(g)收集经步骤(f)处理的与(c)中氧氟沙星结合的文库成员；
(h)对步骤(g)的文库成员进行PCR扩增处理，下游引物5'-端标记生物素；
(i )将步骤(h)中的文库成员与(d)中的链霉亲和素磁珠在适宜条件下接触，得到单链次级文库，将单链次级文库与步骤(C)中氧氟沙星在适宜条件下接触；
单链次级文库制备:取链霉亲和素磁珠，用Bind and Wash buffer (B&ff 1mmol.Γ1Tris-HCl，lmmol.171 EDTA，2mol.171 NaCl，pH7.5)冲洗，将第一轮筛选后用上游引物跟生物素标记的下游引物进行扩增的产物加入链霉亲和素磁珠中，室温结合15min (轻微震荡)，用B&W缓冲液冲洗，磁性分离，洗去未结合到磁珠上的DNA，在链霉亲和素磁珠中加入50 μ L
0.1mol吨―1的NaOH溶液，37°C孵育15min，磁性分离，将带生物素的一条链留在链霉亲和素磁珠上，洗下不带生物素的一条单链DNA即为下一轮筛选的次级文库。
[0014](j)收集步骤(g)或(i)中与(C)特异性结合的文库成员；
(k)重复步骤(e)?(j)，重复次数1、2、3、4、5、6、7次，优选重复7次；重复6次后，进行一轮负筛选实验后，随后进行第7次重复。
[0015]负筛选实验:将制备的次级文库加入200 μ L的结合缓冲液，90°C下混匀lOmin。加入环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星混合物(环丙沙星:恩诺沙星:诺氟沙星摩尔比=1:1:1)，室温轻微震荡lh，加入质量为ssDNA 1000倍的氧化石墨烯，室温震荡2h，能够与环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星结合的ssDNA从氧化石墨烯上解吸下来，游离在溶液中，不能与它们结合的ssDNA结合在氧化石墨烯上，离心弃掉上清液。往含有氧化石墨烯沉淀的离心管中加入结合缓冲液，离心弃掉上清液，重复操作3次，彻底去除能与环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星结合的ssDNA。加入结合缓冲液200 μ L，再加入等物质量的氧氟沙星，轻微震荡lh，与氧氟沙星高特异结合的ssDNA形成能与氧氟沙星结合的三维结构从氧化石墨烯上解吸下来留在上清液中。
[0016](I)任选地，对(j)步骤获得的文库成员进行确定，优选序列测定。
[0017]本发明的有益效果:本发明采用修饰的GO-SELEX技术，筛选得到与氧氟沙星高特异结合的ssDNA适配体，方法快速简便易操作，使用仪器简单，一般的实验条件都可以达到。筛选得到的高亲和力适配体序列可以特异性地跟氧氟沙星结合，为食品中氧氟沙星残留的检测提供了稳定性良好、灵敏度高、成本低、易制备、易修饰