一种合浦珠母贝表皮生长因子样基因Pf-egf1及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于水产生物技术领域，具体涉及的是一种合浦珠母贝（Pinctada fucata)表皮生长因子样基因Pf-egfl及其应用。
【背景技术】
[0002] 表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF)是一个大家族，包括表皮生 长因子(epidermal growth factor，EGF)、车专化生长因子- a (transforming growth factor-a，TGF_a)、肝素结合性表皮生长因子（heparin binding EGF，HB_EGF)、双调蛋白 (amphiregulin，AR)、细胞素（betacellulin，BTC)、神经调节素（neuregulin，NGR)与表皮 素（印iregulin，EPR)等。它们都包含至少一个保守的EGF-like结构域，这个结构域由3 对二硫键所维持。EGF 与 EGF 受体（epidermal growth factor receptor，EGFR)结合，形成 同源或者异源二聚体，引发一系列的信号传导，促进细胞内DNA、RNA以及蛋白质的合成，从 而诱导细胞的有丝分裂、迀移和分化等过程。在目前的报道中，脊椎动物研宄较多，无脊椎 动物较少。Herman等从静水椎实螺（Lymnaea stagnalis)中克隆得到EGF同源基因L-egf， 发现在生长及损伤修复过程中起着重要作用。Eri等人从海鞘中（Herdmania curvata)获 得了一个在变态过程中发挥重要调节作用的Hemps，该基因被证明是EGF家族相关基因。 Hursh 等人研宄了海胆（Strongylocentrotus purpuratus)中 EGF 家族相关基因 Sp-egfl 与Sp-egfll，发现其在海胆的受精以及胚胎发育等过程中发挥着重要的作用。
[0003] 合浦珠母贝（Pinctada fucata)是我国海水珍珠养殖的主要珍珠贝，在我国主要 分布在南方沿海地区，特别在广西合浦至广东沿海区域分布的为多，具有很高的价值。目前 有关合浦珠母贝功能基因的研宄主要集中在免疫基因和珍珠形成相关基因上面，如热休克 蛋白Hsp70基因，组织蛋白酶基因，肌动蛋白基因，壳基质蛋白相关基因等，而与生长、 繁育等具有经济价值性状相关的功能基因研宄较少。合浦珠母贝在幼体阶段需要经历一系 列变态发育过程，在珍珠养殖过程中需要进行插核手术，从而导致损伤。由于EGF具有损伤 修复的功能，因此对育珠手术伤口的恢复可能会起作用。但目前还没有关于如何恢复育珠 手术损伤和伤口方面的研宄。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种合浦珠母贝表皮生长因子样基因Pf-egfl和由此推 断的氨基酸序列。
[0005] 本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种合浦珠母贝表皮生长因 子样基因Pf-egfl，该基因Pf-egfl的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0006] 该基因Pf-egf 1的cDNA核苷酸序列的394bp~396bp为起始密码子ATG， 1093bp~1095bp为终止密码子TGA，拥有702bp开放阅读框。
[0007] 该合浦珠母贝表皮生长因子样基因Pf-egf 1，它的氨基酸序列如SEQIDN0. 2所 不〇
[0008] 表皮生长因子（EGF)家族目前主要在脊椎动物中报道比较多。本发明利用合 浦珠母贝的转录组，在贝类首次克隆得到EGF-like基因Pf-egf 1，功能结构域分析发现 Pf-egf 1包含一个跨膜结构域（l_34aa)和一个EGF-like结构域（170_211aa)，与EGF家族 其他成员及其相关蛋白相比，Pf-egf 1与他们有着共同的EGF-like结构域（图1)，包括典 型的6个半胱氨酸残基与3个C末端残基（图1)，这与EGF家族及其相关蛋白是相同的，表 明Pf-egf 1是EGF家族相关蛋白，表皮生长因子的6个半胱氨酸残基和3个C末端残基是 维持其在生物体内得活性所必须的。
[0009] EGF家族及其相关蛋白在哺乳动物中已经广泛的得到，同时，EGF-like结构域 在单细胞生物的恶性疟原虫、无脊椎动物和脊椎动物中也都被发现，表明EGF-like结构 域在物种进化过程中是相对保守的。目前在贝类报道的EGF家族及其相关蛋白基因有4 个，分别是杂色鲍（Haliotis diversicolor)的HdEGFl基因、光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata)的 EGF 相关基因、近江牡販（Crassostrea ariakensi)中 Tolliod-like 基因 CaTLL和静水椎实螺（Lymnaea stagnalis)中的一个EGF同源蛋白L_egf。Pf-egf 1与上述 基因的序列比对发现，除了 EGF-like结构域外，其余的氨基酸序列没有可信的相似性，进 化树（图2)显示Pf-egfl独自聚为一支，表明Pf-egfl是EGF家族及其相关蛋白的一个新 成员。
[0010] 上述合浦珠母贝表皮生长因子样基因Pf-egfl在合浦珠母贝变态发育和生长、创 伤修复方面的用途。
[0011] EGF家族及其相关蛋白在高等动物中的表达分布比较广泛。在人体中，EGF家族 的神经调节蛋白（neuregulin，NRG)在人的乳腺、前列腺、心脏、肝、肾、小肠以及脾中均 有不同程度的表达。另外，对小鼠的肝素结合性表皮生长因子（heparin binding EGF， HB-EGF)研宄发现HB-EGF在小鼠的肺、骨骼肌、大脑和心脏中的表达量很高。本发明利用 qRT-PCR技术检测了 Pf-egfl基因在合浦珠母贝不同组织中的表达，发现Pf-egfl在肠中 的表达量最高，极有可能与肠道容易受到损伤，需要修复有关，这与EGF家族成员细胞素 (betacellulin，BTC)在人中的表达类似的。
[0012] EGF家族及其相关蛋白在生物体正常胚胎发育及其成熟稳定的过程中发挥着不同 的作用。表皮素（印iregulin，EPR)在小鼠胚胎发育的前7天有明显的表达，之后就逐渐下 降直至表达量消失，预示着表皮素可能参与了小鼠的胚胎早期生长发育过程。胚胎发育中 的小鼠在神经调节蛋白（neuroregulin，NRG)突变后会出现死亡的情况，表明NRG在小鼠胚 胎发育的过程中也起着重要作用。在本发明的实验中，Pf-egfl在合浦珠母贝幼虫的担轮 期、D型期、壳顶期、眼点期、变态期呈现先下降后升高的趋势，并且在变态期的表达量最高， 差异显著（P〈0. 05)，表明合浦珠母贝在变态期Pf-egfl起着重要作用。张洁等也发现杂色 鲍的表皮生长因子相关蛋白HdEGFl在幼体附着后的表达量比附着前高出19倍之多，主要 在幼体变态后的消化道表皮细胞上集中表达，说明HdEGFl直接参与了消化道的生长和变 态后细胞分化的过程，与本发明的结果类似。
[0013] 本发明具有以下优点：
[0014] (1)本发明对合浦珠母贝EGF进行了克隆与表达分析，结果获得合浦珠母贝表皮 生长因子样基因Pf-egf 1的cDNA全长序列4107,命名为Pf-egf 1，开放阅读框（0RF) 702bp， 编码234个氨基酸，包含一个信号肽序列和一个跨膜结构域，功能结构域分析发现Pf-egf 1 具有一个EGF-like结构域，有6个半胱氨酸残基，由3个二硫键维持，是表皮生长因子家 族及其相关蛋白的特征结构域，但其余序列与现有相关基因序列差异较大，是一个新的 EGF-like 基因；
[0015] (2)本发明构建的合浦珠母贝表皮生长因子样基因Pf-egf ImRNA在合浦珠母贝外 套膜、闭壳肌、鳃、肝胰腺、珍珠囊、肠、性腺中都有表达，在肠中的表达显著高于其他组织； 在合浦珠母贝幼体发育的担轮期、D型期、壳顶期、眼点期和变态期的表达呈现逐渐升高的 趋势，并且在变态期的表达量极显著地高于其它时期。上述结果表明Pf-egf 1基因在合浦 珠母贝肠道修复和幼虫变态发育阶段起着重要作用，为进一步开展育珠与生长调控奠定了 一定基础。
【附图说明】
[0016] 图1是实施例1中Pf-egf 1与EGF家族及其相关蛋白EGF-like结构域比对；
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