与宫颈癌发生相关的hpv整合的基因位点及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及妇科肿瘤学和分子遗传学领域，具体地说，本发明涉及与宫颈癌发生 相关的HPV整合的基因位点，以及这些HPV整合的基因位点在检测宫颈癌高危人群试剂盒 中的应用。
【背景技术】
[0002] 宫颈癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤之一，在世界范围内的死亡率占女性恶性 肿瘤疾病的第三位。世界上每年大约有50万的新发宫颈癌患者，同时每年有26. 8万人死于 宫颈癌。宫颈癌的发病率和地区发达程度有很强的关联性，将近86%的宫颈癌病例和88% 的死亡病例发生在欠发达地区（Arbyn M等，Ann 0ncol，2011 ;22 :2675-2683)。全球范围内 宫颈癌已造成约780万的寿命损失年数（David Formana等，Vaccine，2012 ;30S :F12_F23)。 在中国宫颈癌的发病率和死亡率也均高居世界第二，仅在2010年，就有76, 884例新发宫颈 癌和21，626例死亡。目前，宫颈癌的发病率在某些地区出现上升趋势，且患者趋于年轻化。 随着社会经济的日益发展，宫颈癌这一危害广大妇女的恶性疾病越来越受到社会各界的关 注。
[0003] 对于宫颈癌的发病机制的研宄一直是学界的热点之一。宫颈癌作为一种恶性肿 瘤，其发病机制相对复杂，除了高危型人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus，HPV)的持 续感染外，还有宿主细胞基因组改变等其他因素。随着细胞遗传学和分子生物学的深入研 宄，人们逐渐发现高危型HPV感染者并非都发生了宫颈癌，HPV与宿主染色体的整合才是宫 颈细胞永生化过程中的重要步骤（Wheeler CM，0bstet Gynecol Clin North Am，2013;40: 165-176)。高危型HPV感染细胞后，在整合的病毒中HPV基因组的易变部分缺失，并整合入 宿主基因组DNA，断裂点常在E1、E2基因开放读码框（0RF)处，其中以发生在E2基因的"铰 链区"最多（Choo KB等，Virology，1987;161:259-261)。E2基因的缺失，能抑制整合病毒 启动子所调控的转录，同时也可导致E6和E7基因表达失控，提高了 E6和E7的过表达和稳 定性（Parish JL等，J Virol，2006 ;80 :4580-4590)，而E6、E7两种癌蛋白能分别结合和破 坏p53、pRb等细胞周期调节关键蛋白并干扰其作用（zur Hausen H，J Natl Cancer Inst， 2000 ;92 :690-698)，导致细胞的恶性转化或癌变能力增强。因此，宫颈癌HPV整合的研宄是 阐明宫颈癌发病机制的重要线索。
[0004] HPV整合在细胞染色体的位置不尽相同。研宄发现HPV DNA整合入宿主细胞基因 的位点有一定的倾向性，比如常整合在染色体的脆性位点（common fragile sites，CFSs)、 原癌基因和染色体突变点附近等（Wentzensen N等，Cancer Res，2004;64:3878_3884)。这 些倾向于高频发生的整合位点可能在宫颈癌发生过程中促进细胞获得选择性生长优势。阐 明HPV的高频整合位点对于揭示宫颈癌发生的机制、鉴别诊断宫颈癌高位人群有重要的意 义。
[0005] 既往发展的HPV整合位点的检测方法有整合HPV病毒致癌基因转录子的扩增 (Klaes R 等，Cancer Res，1999 ;59 :6132_6136)、Southern 杂交（Cullen AP 等，J Virol， 1991 ;65 :606-612)、实时定量PCR(Peitsaro P等，J Clin Microbiol，2002 ;40 :886-891)、 限制性酶切位点 PCR(Thorland EC 等，Cancer Res，2000 ;60 :5916-5921)和 DNA 原位杂交 (Evans MF等，J Pathol，2004;202:l-4)。虽然这些方法都能对HPV整合位点进行检测，但 均存在敏感度低、操作繁琐、耗时、需大量的样品、对结果判断不确定等缺点。
[0006] 最近新开发的高通量病毒整合检测技术是一种新的实验化和计算机化的方法，它 能利用捕获测序在单一碱基对分辨率下有效的进行病毒基因整合检测。它利用HPV探针 捕获宿主基因中的病毒插入片段，并把这些片段在测序平台进行进一步测序；基于所获得 的DNA序列数据，用片段拼接策略定位整合位点，最后用PCR Sanger测序对检测出的整合 位点进行验证（W. Li，Genomics，2013 ; 102 :338-344)。这种技术具有高特异性和敏感性， 是确定人类基因组中的病毒整合的具有很好成本效益的方法（W. Li，Genomics，2013 ;102 : 338-344)。
[0007]目前，对于宫颈癌高危人群的检测方法及产品主要是针对HPV本身进行检测，即 检测样本中是否存在HPV，但实际上并非所有的高危型HPV感染者都发生了宫颈癌，因此， 此类对于宫颈癌高危人群的检测方法及产品具有检测结果不准确、灵敏度低等缺陷。而尚 未有针对HPV的整合位点来检测宫颈癌高危人群的方法及产品，这主要是因为，检测是否 有HPV的整合需要同时检测HPV的序列和宿主人基因组的序列，并且这两条序列形成了融 合序列。现有检测HPV整合的技术如DIPS-PCR(Luft F等，Int J Cancer，2001，92(l): 9-17)和 AP0T(Klaes R 等，Cancer Res，1999, 59(24) :6132-6136)技术操作繁琐、稳定性 差，检测结果不准确、不全面，检测技术仅停留在实验室研宄探索水平，尚无法应用于临床 检测。发明利用高通量病毒整合检测和PCR Sanger测序研宄揭示与宫颈癌发生相关的整 合位点，具有检测方法灵敏、检测结果全面等优点。
【发明内容】
[0008] 鉴于上述问题，本发明利用高通量病毒整合检测和PCR Sanger测序研宄揭示与宫 颈癌发生相关的 50 个 HPV 整合位点（P0U5FlB、raiT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRPlB、LEPRELl、 DLG2、SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、F0XP2、CDH7、DMD、MACR0D2、 AGTR2、C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、R0CK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、L0C100132288、 DCC、PARD3B、HS3ST4、DLG1、RALYL、IGF1、TRIM33、SLC8A1、DNAH11、CLSTN2、C9orfl02、 L0C728410、S0RCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1);根据宫颈 组织DNA中HPV整合至上述50个基因位点中的任意一个或几个位点，来制备检测宫颈癌高 危人群的试剂盒，本发明的检测宫颈癌高危人群的试剂盒具有快速、方便、准确等优点。
[0009] 本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
[0010] 本发明提供与宫颈癌发生相关的HPV整合的基因位点，HPV的部分或全部序列插 入人基因组序列，形成整合的基因位点，所述整合的基因位点包括以下任意一个或几个基 因的任意序列，所述基因包括：P0U5F1B、H1IT、KLF12、KLF5、HMGA2、LRP1B、LEPREL1、DLG2、 SEMA3D、MSRB3、MAPK10、PCDH15、PLS3、PARK2、ZNF33B、F0XP2、CDH7、DMD、MACR0D2、AGTR2、 C9orf85、PRDM9、CADM2、MSX2、CPNE8、R0CK1、NEK11、DUSP6、EPHA6、L0C100132288、DCC、 PARD3B、HS3ST4、DLGl、RALYL、IGFl、TRIM33、SLC8Al、DNAHll、CLSTN2、C9orfl02、L0C728410、 S0RCS2、FSTL5、BDP1、FLJ37543、ZNF479、ERC2、SLC7A11、IL1RAPL1。例如 HPV 的部分或全 部序列可以分别整合到上述任意N个基因中的任意一个或几个位点中，其中N选自1至50 任意一个数值。
[0011] 进一步，所述HPV的部分或全部序列包括HPV16、HPV18、HPV33、HPV58的全部或部 分序列。
[0012] 进一步，HPV的部分或全部序列插入人基因组序列，所述人基因组序列的插入位点 包括以下任意一个或几个位点：
[0013] chr8 ：128230632, chr3 ：60580190, chrl3 ：75080260, chrl2 ：66044325, chrl3 ： 74231438, chr2 ：142277627, chr3 ：189679114, chrll ：84402641, chr7 ：84587024, chrl2 ： 66044686, chr4 ：87136569, chrlO ：56856238, chrX ：114937892, chr6 ：162551151, chrlO ： 42599645, chr7 ：114325898, chrl8 ：63824312, chrX ：33071182, chr20 ：15200988, chrX ： 115008129, chr9 ：74521711, chr5 ：23739233, chr3 ：85282358, chr5 ：174231749, chrl2 ： 39130515, chrl8 ：18520045, chr3 ：130945456, chrl2 ：89805199, chr3 ：96760090, chr21 ： 9831305, chrl8 ：50601053, chr2 ：206446164, chrl6 ：25792328, chr3 ：197223493, chr8 ： 85862571, chrl2 ：102672730, chrl ：114995675, chr2 ：40584069, chr7 ：1651378, chr3 ： 140013931, chr9 ：98904388, chr4 ：18221, chr4 ：7711377, chr4 ：162695494, chr5 ： 70874679, chr5 ：61009796, chr7 ：57211246, chr3 ：55593863, chr4 ：138874818, chrX ： 28786772。
[0014] 进一步，所述HPV的部分序列包括以下任意一个或几个序列：
[0015] HPV16 ： 18-5734,HPV16 ：3022-3153, HPV16 ： 1613-1665,HPV16 ：3578-3667, HPV16 ： 2911-3031， HPV16