图2是实施例1中Pf-egf 1与EGF家族基因序列构建的系统进化树（NJ法）；
[0018] 图3是实施例2中具体合浦珠母贝Pf-egf 1在不同组织中的表达情况，Ms.闭壳 肌，He.肝胰腺，Ps.珍珠囊，Gi.鳃，Mt.外套膜，Go.性腺，In.肠，相同字母表示差异不显 著（P>0. 05)，不同字母表示差异显著（P〈0. 05);
[0019] 图4是实施例2中合浦珠母贝Pf-egf 1在不同发育时期的表达情况，T.担轮期， D.D型期，U.壳顶期，P.眼点期，M.变态期，相同字母表示差异不显著（P>0. 05)，不同字母 表不差异显著（P〈〇. 05)。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但不以任何形式限制本发明。
[0021] 实施例1合浦珠母贝表皮生长因子样基因Pf-egf 1的构建
[0022] -、材料与方法
[0023] 1. 1材料
[0024] 合浦珠母贝取自海南陵水新村热带水产研宄开发中心基地，取健康、活力好的成 贝，解剖后取其外套膜、闭壳肌、鳃、肝胰腺、珍珠囊、肠、性腺7种组织，放在RNA样品保护液 (TAKARA)中保存；人工培育获得合浦珠母贝不同发育时期样品：担轮期（受精后8h)、D型 期（受精后24h)、壳顶期（受精后14d)、眼点期（受精后20d)、变态期（受精后24d)样品，不 同发育时期样品收集完后分别放入RNA样品保护液中保存，及时带回广州实验室于-80°C 冰箱保存备用。
[0025] 1. 2 RNA 提取与 cDNA 合成
[0026] 取合浦珠母贝的外套膜，按照Macherey-Nagel公司的Total RNA isolation NucleoSpin?试剂盒说明提取总RNA，琼脂糖电泳检测完整性并且用紫外 分光光度计检测其浓度和纯度后放在超低温冰箱中保存备用。利用M-MLV反转录酶 (TAKARA，大连）合成 cDNA 第一链；利用 TAKARA -Full RACE Kit (TAKARA，大连）合成 3'狀0￡-。0嫩，用5'41111狀0￡1(^〇^1^狀，大连）合成5'狀0￡-。0嫩，-20°0保存备 用。
[0027] 1. 3 EGF-like 基因的克隆
[0028] 根据合浦珠母贝转录组序列，利用Primer Primer5. 0软件分别设计引物FI、Rl， F2、R2, F3、R3(见下表1)扩增目的片段，PCR反应体系为10XPCR Buffer2.0yL，dNTP Mixture (各 2. 5mmol/L) 1. 6 y L，正反向引物（F/R) (10 ymol/L)各 0? 8 y L，TaKaRa Taq(5U/ y L) 0? 2 y L，ddH20 13. 8 y L，cDNA 0? 8 y L。PCR 反应条件为 95°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s， 72°C lmin30s，循环35次；72°C lOmin。DNA回收试剂盒（Meagn，广州）纯化目的片段后连 接到PMD18-T (TAKARA，大连）载体上，转化到大肠杆菌感受态细胞E. coli DH5 a (天根，北 京），涂LB/AMP平板、挑菌落经阳性克隆鉴定送生工测序后与已知序列进行比对。
[0029] 根据已经得到的目的片段，分别设计3'、5' RACE特异性引物（表1)，以 3' RACE-cDNA，5' RACE-cDNA 为模板，按照 TaKaRa RACE 说明书分别进行 3' RACE 与 5' RACE 反应，PCR反应产物经电泳、胶回收、连接、转化后，通过菌落PCR选取阳性克隆送生工测序， 将测序结果与已知序列进行比对，获得EGF-1 ike基因的全长序列。
[0030] 1. 4序列分析
[0031] 用 ORF Finder (http: //www. ncbi. nlm. nih. gov/gorf/gorf. html)查找开放阅 读框（0RF);用DNAstar软件和BioeEdit软件预测氨基酸序列；用ProtParam(http: // web, expasy. org/protparam/)预测编码蛋白的理化特性；用 Sign￡ilP4. 1 (http://www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽序列；用 TMHMM srever 2. 0 (http: //www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)预测蛋白跨膜结构域；用 NetPhos2. OServer (http: // www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos/)预测蛋白质的磷酸化位点；用 WoLF PS0RT 工具 (http://wolfpsort. sea, cbrc. jp/)对蛋白质进行亚细胞定位；用 SMART (http: //smart. embl_heidelberR.de/)分析蛋白质的功能结构域；用MEGA5. 1构建系统进化树，如图2中 所示。
[0032] 1.5不同组织与不同发育时期表达分析
[0033]用 PrimerScriptTM 1st strand cDNA synthesis Kit (TAKARA)试剂盒将合浦珠 母贝不同组织（外套膜、闭壳肌、鳃、肝胰腺、珍珠囊、肠、性腺）与不同发育时期（担轮期、 D型期、壳顶期、眼点期、变态期）的总RNA反转录成cDNA备用。
[0034] 根据已经获得的EGF-like基因序列，设计荧光定量引物qRT-F、qRT-R (表1)，用 18S rRNA基因作为内参，用SYBR Real-time PCR Master Mix试剂盒（TAKARA)进行荧光定 量 PCR 反应，反应在 CFX96 real-time PCR 仪（Eppendorf)上进行，反应体系 20yL:2XSYBR Green Real-time PCR Master MixlOyL, Primer FR(10ymol/L)0. 4yL, ddH20 8. 2 yL, cDNA (100倍稀释）1 y L，每个时相做3个样品，每个样品做3个平行重复。PCR反应条件为： 95°C3min ;95°〇58,55°〇308,40个循环；反应结束后进行溶解曲线分析，用相对定量2- &^ 法计算目的基因的相对表达水平。基因的表达水平用平均值土标准误（mean土SE)表示， 并用SPSS19. 0统计软件进行单因素方差分析，P〈0. 05为差异显著。
[0035] 表1实验中所用引物序列
[0036]
【主权项】
1. 一种合浦珠母贝表皮生长因子样基因 Pf-egfl，其特征是：该基因 Pf-egfl的cDNA 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. 根据权利要求1所述的合浦珠母贝表皮生长因子样基因 Pf-egfl，其特征是：该基因 Pf-egf 1的cDNA核苷酸序列的394bp~396bp为起始密码子ATG，1093bp~1095bp为终止 密码子TGA，拥有702bp开放阅读框。
3. -种合浦珠母贝表皮生长因子样基因 Pf-egfl，其特征是：它的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
4. 权利要求1-3任一项所述的合浦珠母贝表皮生长因子样基因 Pf-egf 1在合浦珠母贝 变态发育和生长、创伤修复方面的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种合浦珠母贝表皮生长因子样基因Pf-egf1，该基因Pf-egf1的cDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，它的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，本发明还公开了合浦珠母贝表皮生长因子样基因Pf-egf1在合浦珠母贝变态发育和生长、创伤修复方面的用途。
【IPC分类】C07K14-485, C12N15-12
【公开号】CN104830868
【申请号】CN201510207812
【发明人】喻达辉, 朱文杰, 黄桂菊, 张东玲, 范嗣刚
【申请人】中国水产科学研究院南海水产研究所, 集美大学
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年4月28日