一种鼠妇纤溶酶及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及制药领域，具体涉及一种鼠妇纤溶酶及其应用。
【背景技术】
[0002] 血栓性疾病是一类发病率较高、严重危害人类健康的疾病，主要包括心肌梗死，中 风，脑栓塞，肺血栓等。血栓性疾病在全球范围内呈现渐增之势。据统计，全球每年平均约 有1200万人死于心脑血管病，占所有死亡人数的1/4,而这些死者80%在发展中国家。预计 在2020年全球每年将有2500万人死于心脑血管疾病。在中国这一比例更为惊人，据2010 年《中国卫生统计提要》数据，心脑血管疾病导致的死亡人数已超过全国总死亡人数的40%， 高居我国居民死因的首位。每年全国心脑血管病死亡人数达260万人，心脑血管病的复发 率也很高，五年内复发率高达42%，存活的患者75%致残，其中40%以上重残。
[0003] 目前，根据血栓形成的机制，抗栓药物主要分为抗血小板药物，抗凝药物和溶栓 药物。其中溶栓药物是广泛应用于临床治疗血栓最有效的药物，如尿激酶，链激酶，组织型 纤溶酶原激活剂（t-PA)等。虽然这些溶栓药物大幅度降低了血栓性疾病的致死率和致 残率，但是仍然具有较多的缺点，例如尿激酶虽然具有非常好的溶栓活性，但是抗凝活性较 差，因此尿激酶仅能用于溶栓，不能用于预防血栓的形成。目前市场上很少有药物同时具有 溶栓和抗凝作用。因此，寻找一种副作用小，避免再阻塞和再梗死的天然溶栓抗凝药物势在 必行。
[0004] 鼠妇为甲壳纲等足目鼠妇科动物鼠妇J7io 的干燥虫体， 别名潮虫，地虱，西瓜虫，豌豆虫等，始载于《神农本草》，具有破血利水，解毒止痛之功效。鼠 妇作为一味传统的虫类中药，临床应用较为广泛，可用于治疗中重度癌性疼痛，扁平疣，痔 疮，百日咳等，现代研究表明鼠妇具有镇痛，抗炎，抗肿瘤的作用。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种鼠妇纤溶酶，同时具有溶栓和抗凝活性。
[0006] 本发明的另一目的是提供所述鼠妇纤溶酶在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
[0007] 本发明的目的采用如下技术方案实现。
[0008] -种鼠妇纤溶酶，具有溶栓和抗凝活性，采用如下方法制备： (1) 将鼠妇采用湿法超微粉碎，获得提取液； (2) 从所述提取液中提取分子量为4kDa~lOOkDa的蛋白组分； (3) 对步骤（2)所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分采用硫酸铵沉淀法进行纯化，获 得粗蛋白； (4) 将所述粗蛋白经凝胶过滤层析和阴离子交换层析，取具有溶栓活性的洗脱液，得到 鼠妇纤溶酶。
[0009] 在本发明中，步骤（1冲将鼠妇用6~10倍质量的水浸泡0. 5~2 h，然后加入超微粉 碎机中进行湿法超微粉碎。
[0010] 优选的技术方案中，所述湿法超微粉碎的温度为0_40°C，时间为5~30 min。
[0011] 在本发明中，步骤（2)中将所述提取液采用截留分子量为80kDa~100kDa的中空纤 维膜进行分离，取透过液，采用截留分子量为4kDa的中空纤维膜进行分离，取截留液，得到 分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分。
[0012] 在本发明中，步骤（3)中所述硫酸铵沉淀法具体为：在所述分子量为4kDa~100kDa 的蛋白组分中加入硫酸铵至饱和度为75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
[0013] 优选的技术方案中，所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中先加入硫酸铵至 饱和度为35-65%,静置后离心，取上清液；然后在所述上清液中加入硫酸铵至饱和度为 75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
[0014] 最优选的技术方案中，所述分子量为4kDa~100kDa的蛋白组分中先加入硫酸铵 至饱和度为55-65%,静置后离心,取上清液；然后在所述上清液中加入硫酸铵至饱和度为 75-85%，静置后离心，取沉淀，得到粗蛋白。
[0015] 在本发明中，步骤（4)的具体方法为：所述粗蛋白依次经过Sephadex G-100凝胶 过滤柱、Sephacryl S-200 HR凝胶过滤柱、HiTrap Capto Q离子交换层析柱和Superose-12 凝胶过滤柱，取具有溶栓活性的洗脱液，得到鼠妇纤溶酶。
[0016] 在本发明中，所述鼠妇纤溶酶的分子量为37. 5-38. 5KDa，且自N端起第1-15位氨 基酸残基的序列为：六8卩-116-八811-617-617-617-八1&-1']11'-1^11-Pro - Gln - Pro - Leu - Tyr - Gin。本发明所述鼠妇纤溶酶，命名为PSLTroOl。
[0017] 本发明还提供所述鼠妇纤溶酶在制备治疗血栓性疾病药物中的应用。
[0018] 本发明首次发现了鼠妇纤溶酶PSLTroOl，同时具有较强的溶栓和抗凝的活性。鼠 妇纤溶酶PSLTroOl的溶栓活性与尿激酶相比，0. I mg · ml/1的鼠妇纤溶酶酶活力强于100 U · ml/1尿激酶的纤溶活性。鼠妇纤溶酶PSLTroOl的体外抗凝活性与肝素钠相比，浓度为 20 Pg · mL-1活性鼠妇纤溶酶的TT、PT和APTT均长于IU · mL ―1肝素钠，且APTT显著高于肝 素钠，超过600s后仍未凝固。因此，本发明鼠妇纤溶酶不仅具有溶栓作用，同时还能预防血 栓形成。鼠妇纤溶酶PSLTroOl最适溶栓温度为40°C，最适溶栓pH为7. 0 ;由于该鼠妇纤溶 酶的最适溶栓温度、pH与人体温度和血液的pH相契合，因此可以在机体内发挥最大的溶栓 活力。另外，本发明鼠妇纤溶酶并非是直接溶解纤维蛋白，而是通过激活纤溶酶原，使其转 化为纤溶酶，进而溶解纤维蛋白，因此溶栓作用相对温和，用药后的出血倾向较低，可以降 低了组织大出血的风险。
【附图说明】
[0019] 图1是Sephadex G-100凝胶过滤层析色谱图，其中纵坐标A280nm是指洗脱液在 280nm处的吸光度，下同。 图2是Sephacryl S-200 HR凝胶过滤层析色谱图。
[0020] 图3是HiTrap Capto Q离子交换柱层析色谱图。 图4是Superose-12凝胶过滤层析色谱图。
[0021] 图5 SDS-PAGE垂直电泳分析鼠妇纤溶酶的纯度及相对分子量，"还原"表示还原 性SDS-PAGE垂直电泳，"非还原"表示非还原性SDS-PAGE垂直电泳。
[0022] 图6 HPLC法对鼠妇纤溶酶纯度的分析。
[0023] 图7 MALDI-TOF MS测定鼠妇纤维酶的分子量。
[0024] 图8显示鼠妇纤溶酶的最适反应温度。
[0025] 图9显示鼠妇纤溶酶的在不同温度下的稳定性。
[0026] 图10显示鼠妇纤溶酶的最适反应pH。
[0027] 图11显示鼠妇纤溶酶在不同pH条件下的稳定性。
[0028] 图12显示了金属离子对鼠妇纤溶酶的影响。
[0029] 图13显示了酶抑制剂对鼠妇纤溶酶的影响图。
[0030] 图14显示阴、阳性平板中鼠妇纤溶酶的溶栓活性。
[0031] 图15显示鼠妇纤溶酶水解纤维蛋白原的过程，其中M表示蛋白分子量标准 (Marker), 5min、15min、30min、lh、4h、8h、16h、24h表示样品取样时间，C表示空白对照即不 含鼠妇纤溶酶的纤维蛋白原。
[0032] 图16显示了鼠妇纤溶酶的溶栓活性。其中"a"对应的孔中加入浓度为0.1 mgmr1的鼠妇纤溶酶溶液，"b "对应的孔中加入了浓度为100 U·ιΛ 4尿激酶溶液，" c "对应 的孔中加入了浓度为50 Umr1溶液，"d"对应的孔中加入去离子水。
【具体实施方式】
[0033] 实施本发明可以按如下实施例进行，但并不意味着对本发明范围的限制。
[0034] 实施例1 :鼠妇纤溶酶的制备 本发明鼠妇纤溶酶采用如下方法制备： (1)湿法超微粉碎提取 称取一定量干燥鼠妇，加入鼠妇质量8倍、25°C的量蒸馏水浸泡I h，放入超微粉碎机 中在25°C条件下粉碎10 min。将得到的楽料在4 °C条件下5000 r ^irT1离心10 min，取 上清液，即得提取液。
[0035] (2)采用中空纤维膜提取分子量为4kDa~80kDa的蛋白组分 将步骤（1)得到的提取液通过截留分子量为SOkDa的PVDF (聚偏氟乙烯）中空纤维 膜，操作压力为21.34 kPa ~21.56kPa，流速为8ml/min，取透过液。将该透过液通过截留分 子量为4kDa的PES(聚醚砜）中空纤维膜，操作压力为74·21kPa~76·25kPa，流速为2·2 ml · mirT1，取截留液，得到分子量为4kDa~80kDa的蛋白组分。
[0036] ( 3 )硫酸铵沉淀法提取 在步骤（2)所得截留液中加入（见14)2504饱和溶液至体系中硫酸铵的饱和度为60%， 缓慢搅拌Ih后，4°C静置2h，IOOOOg离心lOmin，弃去杂蛋白沉淀；在上清液中继续加入 (