一种α-淀粉酶Amy16及其基因和应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及淀粉酶，尤其是涉及分离自太平洋火色杆菌（Flammeovirga Pacifica) H2具有热稳定性和强碱耐受性的一种α -淀粉酶Amyl6及其基因和应用。
【背景技术】
[0002] 淀粉酶是一类能够水解淀粉产生糊精以及更小的多糖单位或单糖的酶类总称。根 据作用方式的不同，淀粉酶可以分为α -淀粉酶和β -淀粉酶。α -淀粉酶（EC. 3. 2. I. 1) 属于糖苷水解酶13家族，能够通过随机酶切α-1，4-糖苷键来降解长链淀粉。基于序列和 底物特异性的不同，还可以将α -淀粉酶进一步地分为35个α -淀粉酶亚家族。α -淀粉 酶广泛分布于动物、植物和微生物中，但目前应用于工业的α -淀粉酶大多来自于微生物。
[0003] 对α -淀粉酶的研宄已经有半个多世纪，目前，α -淀粉酶已是最重要的工业酶制 剂之一，已被广泛应用在食品、洗涤剂、发酵、纺织、造纸和制药等诸多行业。α -淀粉酶的 一个重要工业应用是在食品加工行业中被用来处理降解淀粉类物质。目前在工业上大量使 用的α-淀粉酶主要来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)、角军淀粉芽抱杆菌（Bacillus amyloliquefaciens)、黑曲霉（Aspergillus niger)和米曲霉（Aspergillus oryzae)。这些酶大多具有耐高温甚至耐超高温的特性， 它们的应用可以简化淀粉加工工艺，降低加工成本；另一方面，高温发酵罐的高生产成本 和设备、发酵技术等瓶颈也严重限制了高温α-淀粉酶的大规模发酵以及在淀粉加工行业 的进一步应用（Van Der Maarel, Μ. J.，Β. Van Der Veen, et al. (2〇〇2) · "Properties and applications of starch-converting enzymes of the a -amylase family. "Tournal of Biotechnology 94(2) : 137-155)。因此近年来，中温淀粉酶也受到了越来越多的关注。虽 然我国上世纪70年代已有了 α -淀粉酶工业化生产，相继开发出多种中温淀粉酶，但大部 分淀粉酶的酶学性质仍无法完全满足现代工业的需求。
[0004] 中国专利CN 102925420Β公开一种α淀粉酶及表达α淀粉酶的重组菌株，所述 的α淀粉酶的氨基酸序列为SEQ ID NO: 1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 1。用于表达 α淀粉酶的黑曲霉P15,其保藏编号为CGMCC No. 6434。该发明所得到的重组菌种能够表达 棒曲霉α淀粉酶AclaP15,其酶活力大大高于其在野生菌中的酶活，且高于宿主菌黑曲霉 自身表达的淀粉酶的酶活力。同时，所得重组α淀粉酶是由食品安全菌黑曲霉分泌所得， 扩大了 AclaP15的应用领域。
[0005] 中国专利CN 102827816B公开一种α -淀粉酶及其应用，所述的α -淀粉酶的核 苷酸序列为SEQ ID NO :2,氨基酸序列为SEQ ID NO :1。该发明筛选出的α-淀粉酶在淀粉 水解为麦芽糖和低聚寡糖及少量葡萄糖的过程中发挥了十分重要的作用，可以用来生产高 麦芽糖浆、作为添加剂用于焙烤制品如面包的生产，以及在啤酒、黄酒和生料酒精行业等行 业均有不同程度的应用，具有工业生产应用价值。而且筛选出的α-淀粉酶可以用来转化 工程菌，从而获得具有表达α-淀粉酶的重组菌。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一目的是提供一种能够应用的具有热稳定和碱耐受性强等特性的新 型α -淀粉酶Amy 16。
[0007] 本发明的第二目的是提供编码α -淀粉酶的基因 amyl6。
[0008] 本发明的第三目的是提供包含基因 amyl6的重组载体。
[0009] 本发明的第四目的是提供包含基因 amyl6的重组菌株。
[0010] 本发明的第五目的是提供α -淀粉酶Amyl6的制备方法。
[0011] 本发明的第六目的是提供α -淀粉酶Amyl6的应用。
[0012] 所述α -淀粉酶Amy 16分离自太平洋火色杆菌H2 (Flammeovirga Pacifica) H2,该菌株已于2012年6月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC N0:M2012229,地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
[0013] 所述α -淀粉酶Amyl6的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，SEQ ID NO. 1如下：
[0014] I MEDNESSIPE HEPKANMELQ VTTHDGAPFN KNESSNKRYS GSPGGPVMMQ AFYWDVPAGG 61 TWNTVKGKL NNWSNQGIGS IWLPPASKAQ NGPFSMGYDP MDYFDFGDYN QMGSKETRFG 121 SGTELRSLVG EAHNQNMEVY ADIVINHNSG GQLEANPYTG TDTffTKFNPA SGKFNRTYND 181 FHPNLDANND EGVFGGFPDL SHKKSYVQDW LWKKSNSVGK YYKNDVGFDG WRFDYVKGFG 241 AWVVKDWVNN VGGFAVGELff DGNASTLKW VDNTDRKSSA FDFAAYYAMD RAFDGNNLNE 301 LNGDMLWKKD SQRAVTFVAN HDTDEIWRKN LAYAYILTHE GYPCIFYRDY EDWLDKSMMN 361 NLLffIHKSYA TGNTSILHVD NDEYIARRNG YNGNPGLVVY INNSDNWKER WVPTNWSNKK 421 IKDYTGHSOT EPfTQGGTW KIQCPPRSYS IffTLK
[0015] α-淀粉酶基因编码455个氨基酸，该酶基因表达的Amyl6蛋白分子量约为 52kDa。本发明的淀粉酶Amyl6同时具有较好的热稳定性、中温条件下在中性和碱性范围内 均具有高活性等特征。本发明筛选到的Amyl6最适温度为50°C，在60°C下仍具有60 %的 活力，且在60 °C下孵育20min后保有80 %的起始活力，40min之后仍保有65 %的起始活力， 表明本发明的淀粉酶Amyl6具有良好的热稳定性。Amyl6的最适pH为6. 5,在pH 5. 5?9 之间的范围内维持50%以上的酶活性。此外α-淀粉酶Amyl6在pH 6,7,8条件下孵育Ih 活力基本保持不变，在pH 9条件下孵育Ih保有70%的起始活力，在pH 10条件下孵育Ih 后仍保有40%的起始活力，表明了该酶具有较强的碱耐受性。由于本发明的淀粉酶具有良 好的热稳定性和碱耐受性，且可有效地与糖化酶协同作用降解淀粉产生葡萄糖，因此可以 广泛地用于食品加工、饲料、轻工等领域，具有良好的工业应用前景。
[0016] 编码α -淀粉酶Amyl6的基因 amyl6的基因序列如SEQ ID NO. 2所示，SEQ ID NO. 2如下：
[0017] I ATGGAGGACA ATGAGAGTTC TATTCCTGAA CATGAGCCAA AAGCCAATAT GGAGTTGCAA 61 GTAACCACTC ATGATGGTGC TCCTTTTAAT AAGAATGAAT CTTCTAATAA AAGATACTCA 121 GGTAGTCCGG GAGGACCTGT GATGATGCAG GCATTTTACT GGGACGTTCC TGCGGGGGGT 181 ACTTGGTGGA ATACCGTGM AGGAAMTTG AATAATTGGA GTAATCAAGG AATTGGATCC 241 ATTTGGTTAC CTCCTGCTTC AAAAGCTCAA AATGGACCTT TCTCTATGGG GTATGACCCA 301 ATGGATTATT TTGATTTTGG TGATTATAAC CAAATGGGTT CAAAAGAAAC AAGGTTTGGA 361 TCTGGTACAG AATTAAGATC TCTTGTTGGG GAAGCACACA ATCAAAATAT GGAAGTGTAT 421 GCTGATATAG TGATCAACCA TAATAGTGGT GGACAACTAG AAGCAAACCC TTATACAGGT 481 ACAGATACAT GGACAAAGTT TAATCCGGCT TCGGGTAAGT TTAATAGAAC ATATAATGAT 541 TTCCACCCTA ACCTTGATGC AAATAATGAT GAAGGTGTTT TTGGAGGTTT TCCAGACTTA 601 AGCCATAAAA AAAGTTATGT GCAAGATTGG TTATGGAAAA AAAGTAACTC TGTAGGAAAA 661 TACTATAAAA ATGATGTCGG TTTTGATGGA TGGAGATTTG ATTACGTGAA AGGCTTTGGT 721 GCATGGGTGG TCAAAGATTG GGTCAATAAT GTAGGTGGAT TTGCTGTAGG TGAATTATGG 781 GACGGTAATG CCAGCACCTT AAAGTGGTGG