酯酶及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，尤其涉及一种酯酶及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002] 2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯是化学酶法合成普瑞巴林 (Pregabalin，简称PGB，商品名为Lyrica K )的重要手性中间体。普瑞巴林是一种神经递质 γ-氨基丁酸（GABA)的三位异丁基取代物，其作为新一代抗癫痫药物，已被应用于治疗多 种中枢神经系统紊乱疾病，包括神经病理性疼痛，社交性焦虑障碍，泛发性焦虑症和辅助性 治疗局限性部分癫痫发作等。由于该药物相较于其他同类治疗癫痫病药物具有明显的优 势，由辉瑞公司生产并上市销售的Lyrica".年销售额呈逐年攀升之势，在2011年、2012年和 2013年分别高达36. 9亿、41. 6亿和46. 0亿美元。由于只有S构型的普瑞巴林具有药理活 性，因此，获取光学纯的中间体2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯在有效减少服用 剂量、提高治疗窗口、减轻非活性对映体所致副作用等方面具有重要的意义。
[0003] 制备普瑞巴林主要有两类方法：一类是使用不对称催化剂、手性配体或者以手性 化合物为原料的不对称合成法，另一类是使用化学手性拆分剂或者生物酶对外消旋反应中 间体或外消旋普瑞巴林进行拆分的外消旋体拆分法。不对称合成法因需要昂贵的手性试 剂，特殊的设备，苛刻的反应条件等，其应用受到了明显的限制。化学拆分法同样具有一些 难以避免的缺陷，譬如反应步骤繁杂，劳动强度大，操作复杂，收率低，环境污染较大等。相 比之下，生物拆分法则可有效避免这些问题，具备操作条件简单温和，对映选择性强，成本 低，环境友好等优点，因此具有极大的开发潜力和广阔的应用前景。
[0004] 目前，不少生物催化法制备普瑞巴林的途径已见报道。例如，具有高活力和高对映 体选择性（转化率为45 %，产物对映体过量值eeps 98% )的腈水解酶AtNitL能够实现 高效地立体选择性水解异丁基琥珀腈，得到中间体（3S)-3-氰基-5-甲基己酸。来自南极 假丝酵母的脂肪酶CALB也被应用于立体选择性合成手性中间体（S)-或（R)-异丁基-戊 二酸酯（收率为96%，ee值为95. 5% )。基于过程效率和产品成本的考虑，这些路径目前 并不能满足制备普瑞巴林的工业化应用要求。
[0005] 另外一条路径，即辉瑞公司利用商业脂肪酶Lipolascκ:选择性地水解2-羧乙 基-(S)_3-氰基-5-甲基己酸乙酯，则成功实现了化学-酶法制备普瑞巴林的工业化生 产。该方法所得到的2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸（转化率为45 % -50%，ee值 >98%)的钠盐，经过后续化学反应步骤最终可制得（S)-普瑞巴林。这条工艺路线实现了 手性中心的尽早确立以及2-羧乙基-(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的外消旋化再利用，大 幅地减少了原料用量和废弃物产生量，使E因子由第一代（传统拆分）路线的86降至8。 基于这条生物法拆分路线，其他作用于2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯的酶或微 生物陆续被开发和报道。如一株土筛得到的菌株KM8经紫外和硫酸二甲酯（DES)诱变，其 转化率和ee p值分别提高至76. 1 %和92. 6%。另一株菌Morgarella morganii ZJB-09203 及从中纯化得到的酯酶也被应用于选择性水解2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯， 当使用全细胞催化剂水解I. 5M底物时，其转化率和的^直分别为45. 3 %和95%。来源于 Thermomyces Ianuginosus的脂肪酶Lip经过定点突变改造，酶活得到大幅提高，在IM底物 投入量下实现了 42. 4%的转化率和98%的的^直。然而，上述路线的酶法拆分都无法获取 更高光学纯度（ee > 99% )的S型产物。
[0006] 因此，通过对映选择性水解2-羧乙基_(R)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯而留下未被 水解的高光学纯度2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯是一种具有潜力的拆分选择。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种酯酶及其编码基因和应用，该酯酶具有高表达量、高选择性和 手性选择性的特点。
[0008] 本发明提供了一种酯酶，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0009] 该酯酶（命名为EstZF172)是从假单胞菌Pseudomonas CGMCC NO. 4184中克隆获 得，由1146个碱基组成，能够催化酯酶水解生成酸和醇。
[0010] 本发明还提供了一种编码所述的酯酶的基因。
[0011] 作为优选，所述的基因的碱基序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0012] 本发明提供了一种包含所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
[0013] 本发明还提供了一种所述的酯酶在催化酯类水解中的应用。
[0014] 具体地，所述的酯酶在催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备 2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的应用。
[0015] 本发明还提供了一种制备2-羧乙基_(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的方法，包括 以下步骤：
[0016] (1)制备包含所述基因的工程菌的静息细胞悬液；
[0017] (2)往静息细胞悬液中添加 rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯进行水解反 应，经后处理，得到2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
[0018] 所述的水解反应如下式所示：
[0019]
【主权项】
1. 一种酯酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. -种编码权利要求1所述的酯酶的基因。
3. 如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的碱基序列如SEQ ID NO. 1所 不O
4. 一种包含权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体和转化子。
5. 如权利要求1所述的酯酶在催化酯类水解中的应用。
6. 如权利要求1所述的酯酶在催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制 备2-羧乙基-(S) -3-氰基-5-甲基己酸乙酯中的应用。
7. -种制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯的方法，包括以下步骤： (1) 制备包含权利要求2所述基因的工程菌的静息细胞悬液； (2) 往静息细胞悬液中添加 rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯进行水解反应， 经后处理，得到2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸 乙酯与静息细胞的质量比为20?60 : 1。
9. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述水解反应的温度为20?55°C。
10. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，水解反应过程中离子缓冲液的pH值为 5 ?10. 5〇
【专利摘要】本发明公开了一种酯酶及其编码基因和应用，该酯酶的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示。本发明从假单胞菌Pseudomonas？CGMCC？NO.4184中克隆得到酯酶基因，该基因表达后获得的酯酶具有高表达量、高选择性和手性选择性的特点；本发明将包含酯酶基因的工程菌应用到催化rac-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯水解制备2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯中，能够控制反应的转化率在超过50％时，即可获得未被水解的高纯度2-羧乙基-(S)-3-氰基-5-甲基己酸乙酯。
【IPC分类】C12P13-00, C12N15-55, C12N15-70, C12N9-18, C12N1-21
【公开号】CN104560912
【申请号】CN201510005882
【发明人】杨立荣, 许方馨, 吴坚平, 徐刚
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月6日