一种催化dna合成效率提高的dna聚合酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种催化DNA合成效率提高的DNA聚合酶，更具体地涉及一种经修饰 后对DNA亲和力提高的DNA聚合酶，属于酶工程领域。
【背景技术】
[0002] Y-家族DNA聚合酶Dbh是一类跨损伤合成聚合酶（TLS)，它能够代替复制性DNA 聚合酶跨越模板损伤处使得DNA合成继续，从而帮助细胞抵抗DNA损害。但为了防止出现 更多突变，跨越损伤后Dbh会被立即切除，正常的复制性聚合酶会恢复对DNA合成的控制， 这就说明Dbh与DNA的结合是短暂的。Dbh的结构是典型的右手结构，分为拇指（thumb)、 手掌（palm)、手指（finger)、小手指（little-finger)四个结构域，相比其它DNA聚合酶， Dbh的手指域很小，导致与新生碱基对的大沟几乎没有接触，另外它的拇指域短而粗，使得 Dbh与DNA及掺入核苷具有较少的作用，总的来说，Dbh对其DNA底物施加的约束很少。它 的结构特点和功能要求决定了 Dbh有着较低的持续合成能力。
[0003] 持续性合成能力的本质是在多轮催化中保留酶对聚合底物的亲和性，因此，提高 聚合酶对底物的亲和力才是提高持续合成能力的本质途径。研宄发现，Dbh保守残基中单 个活性位点突变（Y12A)导致其识别核糖核苷酸能力丧失和核苷酸掺入率的降低；Dbh中LF 域的非保守残基R336与DNA的结合和跨过损伤后磷酸二酯键的形成密切相关。
[0004] 本发明以融合有Ss〇7d的Dbh即Sdbh为基础，构建突变体获得DNA持续合成能力 增强的DNA聚合酶Dbh。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的问题是提供一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh，是先将Dbh 第241-245的氨基酸KSKIP突变为RVRKS，或将第250位的L突变为V，或将第221位的A突 变为S，或将第76位的M突变为I，再在突变体的N端以柔性linker融合Ss 〇7d得到。所 得突变体分别命名为 Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS、Sdbh L250V、SdbhA221S、Sdbh M76I。
[0006] 所述第241-245的氨基酸KSKIP、第250位的L、第221位的A、第76位的M均为非 保守位点。
[0007] 编码Dbh的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，Dbh的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所 不O
[0008] 在本发明的一种实施方式中，编码柔性linker的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所 不O
[0009] 在本发明的一种实施方式中，编码Sso7d的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示。
[0010] 在本发明的一种实施方式中，编码N端通过柔性linker连接了蛋白Sso7d后的 Dbh，即Sdbh的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 在本发明的一种实施方式中，先在N端通过柔性linker连接蛋白Sso7d，得到 Sdbh，然后再对Sdbh的成熟酶部分的相应位点进行突变。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，突变体N端不融合Sso7d，同样能够提高持续合成能 力。
[0013] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种获得所述持续合成能力增强的DNA 聚合酶Dbh的方法，是通过定点突变获得突变体，再在突变体的N端以柔性linker融合 Sso7d〇
[0014] 本发明筛选获得的突变体 Sdbh M76I、Sdbh A221S、Sdbh L250V、Sdbh KSKIP (241-245) RVRKS的持续合成能力提高，这些改造后的Dbh以及携带该酶的试剂盒将 对基因工程的操作产生重要积极作用。
【附图说明】
[0015] 图ISdbh突变体酶的持续合成能力
[0016] 图2Sdbh及突变体的DNA聚合酶活性
[0017] 图3Sdbh及突变体酶的持续合成能力
【具体实施方式】
[0018] 实施例1突变位点的确定
[0019] 通过同源序列比对，确定了 Dbh序列中的非保守位点以及这些位点的突变方 向及频率。结果如表 1 所示，确定了 T37F、I62V、M76I、A221S、Y249I、L250V、K337R 和 KSKIP (241-245) RVRKS这八个突变方向，利用计算机模拟这八个突变体Dbh与DNA的结合及 结合自由能计算。结果如表2所示，理论上结合自由能降低意味着Dbh与底物的结合更为 稳定，也就说明酶与底物的亲和力更大，从而酶的持续合成能力提高，从表2分析可知，除 了 K337R和Y249I外其余突变都能增强持续合成能力。
[0020] 表1.非保守氨基酸的突变残基种类及频率
[0021]
【主权项】
1. 一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，是先将Dbh第241-245的氨 基酸KSKIP突变为RVRKS，或将第250位的L突变为V，或将第221位的A突变为S，或将第 76位的M突变为I，再在突变体的N端以柔性linker融合Ss 〇7d得到；所述Dbh的出发氨 基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
2. 根据权利要求1所述的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，编码柔性linker的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 4所示。
3. 根据权利要求1所述的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，编码Ss〇7d的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 5 所示。
4. 一种持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh，其特征在于，是先将Dbh第241-245的氨 基酸KSKIP突变为RVRKS，或将第250位的L突变为V，或将第221位的A突变为S，或将第 76位的M突变为I。
5. -种获得权利要求1-4任一所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的方法，其特 征在于，通过定点突变获得突变体。
6. 编码权利要求1-4任一所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的核苷酸。
7. 携带权利要求6所述核苷酸的载体或重组细胞。
8. 含有权利要求1-4任一所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的试剂盒。
9. 权利要求1-4任一所述持续合成能力增强的DNA聚合酶Dbh的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种催化DNA合成效率提高的DNA聚合酶，属于生物工程技术领域。本发明先将Dbh第241-245的氨基酸KSKIP突变为RVRKS，或将第250位的L突变为V，或将第221位的A突变为S，或将第76位的M突变为I，再在突变体的N端以柔性linker融合Sso7d，构建出核苷酸掺入效率提高的Dbh，即Sdbh M76I、Sdbh A221S、Sdbh KSKIP(241-245)RVRKS和Sdbh L250V这四个正向突变体，同时也提供了一种通过突变酶非保守位点增强酶持续合成能力的方法。
【IPC分类】C12N15-54, C12N9-12
【公开号】CN104560909
【申请号】CN201510039501
【发明人】吴静
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月26日